Name: Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 11 s
Description: Öğrenin sinaps sayısını immünositokimya ile ölçme yöntemini; presinaptik ve postsinaptik belirteçlerin birlikte yerleşimini kullanarak nöron kültürleri ve beyin kesitlerinde sinaptik bağlantıları nicel olarak analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Puncta Analyzer Plug-in Ben A. Barres laboratuar J Barry Wark (Güncel adresi: Physion Danışmanlık) tarafından yazılmıştı (Stanford Üniversitesi). Finansman; <ul><li> Alfred P. Sloan Vakfı </li><li> Esther A. ve Joseph Klingenstein Fonu, Inc. </li><li> Geniş Biyomedikal Araştırma Vakfı </li><li> Cure Huntington Hastalığı Girişimi </li></ul>

<ol><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li>
<li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li>
<li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li>
<li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.</li>
<li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synapse+number+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li>
<li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li>
<li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li>
<li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+retinotopic+connections%3A+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li>
<li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li>
<li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li>
<li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length%2C+branching+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Moll.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li>
</ol>

RGCs eksitatör projeksiyonlar büyük ölçüde odak neyin deneysel hedefleri bağlamında kültür arıtılmış veya beyin bölümünde, yukarıda açıklanan sinaps tahlil ya dayanır. Biz eksitatör sinapslar (Tablo 1) etiketleme için iyi bir referans masayı antikorları sağladı. Bu sinaps tahlil, sinaps herhangi bir nöronal nüfusun sayısı ya da seçici bir pre-ve postsinaptik işaretleyici olduğu başka herhangi bir sinaptik alt tipi ölçmek için adapte edilebilir. Örneğin, sinaps tahlil Burada açıklanan uygun p...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Antijen </td><td> Tür </td><td> Poliklonal / monoklonal </td><td> Satıcı </td><td> Katalog Numarası </td><td> Seyreltme </td><td> Kültür çalışır. </td><td> İşleri Kısım </td></tr><tr><td rowspan="10"> Presinaptik </td><td> Synapsin </td><td> Tavşan </td><td> Poliklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synapsin </td><td> Fare </td><td> Monoklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagot </td><td> Fare </td><td> Monoklonal </td><td> Testi Tasarımlar </td><td> VAM-PS003F </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagot </td><td> Guinea Pig </td><td> Poliklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synaptotagmin 1 </td><td> Tavşan </td><td> Poliklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> Synaptobrevin 2 (C1.69.1) </td><td> Fare </td><td> Monoklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Sinaptofizin (C1.7.2) </td><td> Fare </td><td> Monoklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Fare </td><td> Monoklonal </td><td> Millipore </td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Kobay </td><td> Poliklonal </td><td> Millipore </td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut2 </td><td> Kobay </td><td> Poliklonal </td><td> Millipore </td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td rowspan="6"> Postsinaptik </td><td> PSD-95 (6G6-1C9 klon) </td><td> Fare </td><td> Monoklonal </td><td> Affinity Bio Reaktifleri </td><td> MA1-045 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD-95 </td><td> Tavşan </td><td> Poliklonal </td><td> Zymed </td><td> 51-6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> Beysbolde tur vuruşu </td><td> Fare </td><td> Monoklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Beysbolde tur vuruşu </td><td> Sıçan </td><td> Poliklonal </td><td> Millipore </td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Tavşan </td><td> Poliklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Fare </td><td> Monoklonal </td><td> Synaptic Sistemleri </td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr></tbody></table> Tablo 1: biz bizim sinaps tayininde başarılı bir şekilde kullanılmaktadır olduğunu iyi pre-ve postsinaptik belirteçlerin Listeler örnekler. Bu mevcut tüm belirteçlerin bir liste olmadığını farkında olun. Y = Evet, N = Hayır, ND = Tespit Edilemeyen. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Cat. Hayır. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td> poli-d-lisin </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Roche Diagnostics GmbH </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Normal Keçi Serum </td><td> Gibco </td><td> 16210 </td></tr><tr><td> DAPI ile VectaShield </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> Ekim </td><td> Doku-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Tris-Baz (50 mM) </td><td> Balıkçı </td><td> BP152-5 </td></tr><tr><td> Sığır Serum Albumin </td><td> Sigma </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> l-lizin </td><td> Sigma </td><td> L-1137 </td></tr><tr><td> % 16 PFA çözüm </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimler </td><td> 15711 </td></tr><tr><td> Granül PFA </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimler </td><td> 19210 </td></tr><tr><td> 24 kuyu kültür plaka </td><td> Şahin </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> Keçi anti-fare Alexa konjuge antikorların </td><td> Invitrogen </td><td> --- </td></tr><tr><td> Besleme </td><td> Şirket </td><td> Cat. Hayır. </td></tr><tr><td> 12mm, No: 0 cam lamelleri </td><td> Karl Hecht Gmbh </td><td> 1105209 </td></tr><tr><td> No 1.5 cam lamel (dilim için) </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 48393241 </td></tr><tr><td> Cam slaytlar </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

sinapslar miktarının: synapse numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı testi

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

Nörobilim en önemli hedeflerinden biri talimat sinaps oluşumu erken aşamalarında moleküler ipuçları anlamak için. Gibi sinaptik bağlantı değişiklikleri ölçmek için objektif yaklaşımlar geliştirmek zorunlu hale gelmiştir. Örnek fiksasyon itibaren, bu protokol detaylarının nasıl ayrışmış nöronal kültür ve immünsitokimya kullanarak beyin bölümlerinde de sinaps sayısı ölçmek için. Kompartman-spesifik antikorların kullanarak, presinaptik terminalleri yanı sıra postsinaptik uzmanlık siteleri etiket. Biz bu belirteçler tarafından oluşturulan sinyaller arasındaki sinaps ko noktaları olarak tanımlar. Bu colocalizations sayısı ImageJ analiz yazılımı platformu altında Puncta Analyzer (istek üzerine Bary Wark, c.eroglu @ cellbio.duke.edu yazılı) bir eklenti kullanarak miktarı. Bu protokol açıklanan sinaps tahlil seçici pre-ve postsinaptik belirteçlerinin sahip olduğunuz herhangi bir sinir doku veya kültür hazırlama uygulanabilir. Bu Sinaps tahlil, sinaptik gelişme çalışmada yaygın olarak kullanılan değerli bir araçtır.

Bu protokol, ayrışmış nöronal kültür ve immünsitokimya kullanarak beyin bölümlerinde de sinaps sayısını ölçmek için nasıl ayrıntıları. Kompartman-spesifik antikorların kullanarak, presinaptik terminalleri yanı sıra postsinaptik uzmanlık siteleri etiket. Biz bu belirteçler tarafından oluşturulan sinyaller arasındaki sinaps ko noktaları olarak tanımlar.

Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi

Nörobilimdeki en önemli hedeflerden biri, sinaps oluşumunun erken aşamalarını yönlendiren moleküler ipuçlarını anlamaktır. Bu doğrultuda...

Nörobilimdeki en önemli hedeflerden biri, sinaps oluşumunun erken aşamalarını yönlendiren moleküler ipuçlarını anlamaktır. Bu nedenle, sinaptik bağlantıdaki değişiklikleri nicel olarak belirlemek için objektif yaklaşımlar geliştirmek zorunlu hale gelmiştir. Çeşitli deneysel preparatlarda sinaps sayısını belirlemek amacıyla, nöronlar arasındaki sinaptik temas noktalarını işaretlemek için kültür nöronları veya kriyoseksiyon beyin dokusu preparatları, seçici pre ve postsinaptik markerlar ile boyanır.Hücreler veya dokular daha sonra floresan mikroskobunda görüntülenir ve iki immünohistokimyasal belirtece karşılık gelen kanalların her biri için sekiz bitlik görüntüler alınır. Görüntüler, puncta analyzer eklentisi ile Image J 1.29 kullanılarak analiz edilir. Presinaptik ve postsinaptik belirteçler arasındaki kolokalizasyon düzeyini belirlemek için, kolokalizasyon noktaları preparatta bulunan sinaps sayısını belirlemek amacıyla kullanılabilir.Burada açıklanan tekniğin elektron mikroskopisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sinaps analizinin çok daha yüksek verimlilikte bir analiz ve sinaps sayısı kantifikasyonuna olanak tanımasıdır. Bu tekniğin temel etkileri; anormalliklerin ve

quantifying-synapses-an-immunocytochemistry-based-assay-to-quantify

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kavşaklarda bulunan kümelenmiş nörotransmitter reseptörlerinin bolluğu güçlü sinaptik gücü etkiler. Bu yöntem tek-sinaps çözünürlükte üç boyutlu olarak floresan etiketli nörotransmitter reseptörleri...

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em&gt; C. elegans</em

Bu video, T lenfositleri ile floresan antijenleri taşıyan epitel hücreleri arasındaki etkileşimleri araştıran immünolojik sinaps topolojisinin canlı hücre görüntülemesini göstermektedir. Floresan mikroskobu, endotel hücrelerinde kırmızı sitoplazma yer değiştirmesini ve sarı zar halkalarını ortaya çıkarır ve bu da immünolojik sinapsların oluşumunu gösterir.

Canlı Hücre Görüntüleme ile İmmünolojik Sinaps Topolojisinin Değerlendirilmesi

Bu video, belirli bir presinaptik proteinin dağılımını ölçmek için bir fare beyin diliminin immünofloresan boyamasını göstermektedir. İşlem, spesifik olmayan bölgelerin bloke edilmesini, hedef protein için birincil antikorların ve bir referans işaretleyicinin uygulanmasını, ardından ikincil antikor etiketlemesini ve nükleer karşı boyamayı içerir. Referans işaretleyici, tutarlı bir taban çizgisi sağlayarak doğru niceleme sağlar ve presinaptik proteinin dağılımı, konfokal mikroskopi kullanılarak...

İmmünofloresan Kullanarak Fare Beynindeki Bir Presinaptik Proteinin Dağılımının Ölçülmesi

Kaynak: McLeod, F.,  et al. Hipokampal Kemirgen Beyin Dilimlerinde Sinaps Yoğunluğunun Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2017). Bu video, konfokal immünofloresan analizi kullanarak hipokampal beyin dilimlerinde sinaptik belirteçleri görselleştirmek için bir yöntemi göstermektedir. Dilimler, presinaptik ve postsinaptik belirteçleri hedef alan primer antikorlarla immün boyanır, ardından florofor konjuge sekonder antikorlar gelir. Etiketli belirteçler daha sonra sinaptik mimariyi kolokalizasyonları...

İmmünofloresan Kullanılarak Fare Hipokampal Dilimlerinde Sinapsların Mikroskobik Analizi

Burada, biz birincil insan T hücreleri ve antijen sunan hücreler arasındaki bağışıklık sinapslarda nitel ve nicel analizi için tam bir iş akışı tanımlamak. Yöntem alma ve nispeten kısa bir süre içinde birkaç bin hücre görüntülerin değerlendirme sağlar görüntüleme akış sitometresi temel alır.

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

Doğru bir şekilde belirlenmesi ve Hipokampal dilimleri ayirt kullanarak sinapslarda analiz için bir protokol bu makalesinde ana hatlarıyla.

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

Biz optik bir tahlil sinaptik vezikül (SV) kültürlü nöronlarda geri dönüşüm için açıklar. Bu iletişim kuralı bir presynaptic işaret ve protein ilgi ifade etmek için çift transfection ile birleştirerek presynaptic siteleri, onların sinaptik vezikül kapasitesi geri dönüşüm bulun ve faiz protein rolünü belirlemek için bize izin verir.

Sinaptik vezikül Presynaptic protein Overexpressing kültürlü nöronlarda geri dönüşüm için optik bir tahlil

Burada, bir sinaptik protein ayirt boyama kullanarak işaret protein, confocal mikroskobu ve bilgisayar tabanlı analiz göre dağılımını belirlemek için nicel bir yaklaşım açıklar.

Türdeş olmayan dağıtım ayirt kullanarak fare beynindeki bir sinaptik protein miktarının

Bu protokol hem immünolojik sinaps oluşumunu hem de sonraki polarize salgı trafiğini immünolojik sinapsa doğru görüntüler. Hücresel konjugates bir süperantijen-darbeli Raji hücre (bir antijen sunan hücre olarak hareket) ve Jurkat klonu (bir efektör yardımcı T lenfosit olarak hareket) arasında kuruldu.

İnsan İmmünolojik Sinaps Görüntüleme

DetectSyn, tedaviler veya hastalık durumları arasında göreceli sinaps (sinaptik öncesi ve sonrası) sayısındaki değişiklikleri ölçen tarafsız, hızlı bir floresan testidir. Bu teknik, hem kültürlü nöronlarda hem de sabit dokuda kullanılabilen bir yakınlık ligasyonu tekniği kullanır.

DetectSyn: Sinaps Yoğunluğundaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Hızlı, Tarafsız Bir Floresan Yöntemi

Burada, akış sitometrisi kullanarak vGLUT1 pozitif sinapsların ve pHRodo Red etiketli ham sinaptozomların mikroglial yutulmasını ölçmek için iki protokol sunuyoruz.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Öğrenin sinaps sayısını immünositokimya ile ölçme yöntemini; presinaptik ve postsinaptik belirteçlerin birlikte yerleşimini kullanarak nöron kültürleri ve beyin kesitlerinde sinaptik bağlantıları nicel olarak analiz edin.

Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi

Daha fazla video keşfet