Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi

Sinirbilimdeki en önemli hedeflerden biri, sinaps oluşumunun erken aşamalarını yönlendiren moleküler ipuçlarını anlamaktır. Bu nedenle, sinaptik bağlantıdaki değişiklikleri ölçmek için objektif yaklaşımlar geliştirmek zorunlu hale gelmiştir. Çeşitli deneysel preparatlarda sinaps sayısını ölçmek için, kültürlenmiş nöronlar veya kriyo kesitli beyin dokusu preparatları, nöronlar arasındaki sinaptik temas noktalarını etiketlemek için seçici sinaptik öncesi ve sonrası belirteçlerle boyanır.

Hücreler veya doku daha sonra bir floresan mikroskobunda ve iki immünohistokimyasal belirteçte karşılık gelen kanalların her biri için gerekli olan sekiz bitlik görüntülerde görüntülenir. Görüntüler, puncta analizörü ile görüntü J 1.29 kullanılarak analiz edilmiştir. Ön ve son sinaptik belirteçler arasındaki kolokalizasyonun derecesini belirlemek için, preparatta bulunan sinapsların sayısını belirlemek için kolokalizasyon noktaları kullanılabilir.

Burada açıklanan tekniğin elektron mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, sinaps testinin çok daha yüksek bir verim analizine ve sinaps sayısının nicelleştirilmesine izin vermesidir. Bu tekniğin ana etkileri, Alzheimer hastalığı, epilepsi veya otizm gibi anormalliklerin ve sinaptik bağlantının altta yatan patolojinin temeli olarak yer aldığı klinik bozuklukların tanı ve tedavisine kadar uzanır. Bu teknik, etkilenen nöronun birbiriyle sinapsis oluşturma yeteneğinde gördüğümüz eksiklikleri azaltabilecek veya iyileştirebilecek müdahale biçimlerini belirlemek için kullanılabilir.

Bu yöntem beyin gelişimini incelemek için yararlı olsa da, hücreden hücreye temasların sayısını incelemek veya ölçmekle ilgilendiğiniz diğer model organizmalara veya organ sistemlerine de uygulanabilir. Sıçan retinasından saflaştırılmış, P beş ila yedi hayvandan hasat edilen sıçan retinal ganglion hücrelerini poli de lizin ile kaplanmış cam örtü fişleri üzerine kaplayarak nöronal kültürler hazırlayın. 24 oyuklu bir plakada, hücrelerin transfeksiyondan üç ila beş gün önce 37 santigrat derecede büyümesine izin verilir.

Transfeksiyonu takiben, kaplanmış hücreler yeterince olgunlaştığında sinapsların gelişmesine izin vermek için hücreleri yedi ila sekiz gün daha inkübe edin. Kültür ortamını kuyucuklardan çıkarın ve yedi dakika boyunca sabitlenmiş her bir kuyucuğa 500 mikrolitre ön ısıtma,% 4 para formaldehit ekleyin. Fiksasyonu takiben oda sıcaklığında, hücreleri fosfat tamponlu tuzlu su ile üç kez durulayın.

Hücrelerin kuyularda kurumasına asla izin verilmemesini sağlamak önemlidir. Bir kuyudan bir tampon çıkarıldıktan sonra, derhal bir sonraki tampon ile değiştirilmelidir. % 50 normal keçi serumu ve% 0.2 Triton X 100 içeren bloke edici tampon hazırlayın.

PBS'yi her birinden çıkardıktan sonra, her bir kuyucuğa 200 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin ve 30 dakika boyunca bloke edin. Oda sıcaklığında, engelleme tamponunu çıkarın ve üç kez durulayın. PBS ile,% 90 antikor tamponunda,% 10 NGS çözeltisinde,% 10 NGS çözeltisi içinde bir birincil antikor seyreltmesi hazırlayın.

Burada bir tavşan antis sinapsin, bir pre-sinaptik işaretleyici ve bir fare anti homer. Bir post-sinaptik işaretleyici kullanılır, Santrifüj, çökelmiş herhangi bir antikoru çıkarmak için bir tezgah üstü santrifüjde maksimum hızda beş dakika boyunca birincil antikor seyreltmesi, daha sonra her birine 200 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin. Birincil çözeltinin kurumasını önlemek için plakayı nemlendirilmiş bir kaba yerleştirin.

Birincil antikor ile inkübasyonu takiben gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Her kuyuyu üç kez durulayın. PBS ile, hazırlanan% 10 NGS içeren antikor tamponunda biri ila 1000 oranında seyreltilmiş 200 mikrolitre uygun ikincil antikor ekleyin.

Daha önce olduğu gibi, çanağı nemlendirilmiş odaya yerleştirin ve sekonderlerle inkübasyonu takiben karanlıkta oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Her kuyuyu PBS ile üç ila dört kez durulayın. Bir cam slayt üzerine DPI'lı bir damla vektör kalkanı montaj ortamı yerleştirin.

Ardından, montaj için kapak camını hücrelerle birlikte damlanın üzerine ters çevirin. Son olarak, kapak kaymasının kenarlarına şeffaf oje sürün. Uygulama sırasında lamele bezlerini itmemeye veya hareket ettirmemeye özen gösteriniz.

Bu, hücreleri paylaşacağından, slaytların kuru ve karanlık bir yerde en az 30 dakika kurumasını bekleyin. Burada görüntüleme, uygun filtre setleri ve 63 kez yağa daldırma objektifi ile donatılmış bir zes axio görüntüleyici floresan mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilir. Mikroskop tablasına transfekte edilmemiş hücreler içeren bir slayt yerleştirin.

Hücre çekirdeklerini görselleştirmek için DPI filtre setini kullanarak, en yakın komşularından en az iki hücre çapı uzakta olan hücreleri seçin. Bu adım için DPI kullanımı, önyargıdan kaçınmaya ve hücre seçiminin rastgeleliğini sağlamaya yardımcı olacaktır. Seçilen her hücre için, bu durumda uygun filtre setlerini, GFP ve Texas Red'i kullanarak sekiz bitlik görüntüler elde edin.

Üst üste binen sahte renkli görüntü, sırasıyla kırmızı ve yeşil renkte pre ve post-sinaptik belirteçleri göstermelidir. Ardından, mikroskop tablasına transfekte edilmiş hücreler içeren bir slayt yerleştirin. Burada hücreler bir TD domates ekspresyon vektörü ile transfekte edilmiştir.

Hücreleri daha önce olduğu gibi seçmek için bu işaretçiyi kullanın. Seçilen her hücre için, bu durumda uygun filtre setlerini kullanarak sekiz çukur görüntüsü elde edin, GFP, Texas Red ve Sci beş. Üst üste binen sahte renkli görüntü, kırmızı, yeşil ve mavi renklerde post-sinaptik belirteçlere sahip olmalıdır.

Burada, kolokalize sinaptik ponksiyonun miktar tayini için delinme analizörü programı kullanılır. Puncta analizörü eklentisi Barry Walk tarafından yazılmıştır ve istek üzerine resim J 1.26'da mevcuttur. Toplanan görüntülerden birini açın.

İlgilenilen SOR'un etrafında radyal olarak yaklaşık bir hücre çapında bir bölge seçmek için dairesel seçim aracını kullanın. İlgilenilen bölge seçiliyken, eklentiler menüsüne gidin ve görüntülenen analiz seçenekleri penceresinde delinme analizörü'nü seçin, Kırmızı Kanal Yeşil Kanal'ı seçin. İlk arka planı çıkarın ve sonuç dosyasını ayarlayın.

Tamam'a tıklayın. Ardından sonuçların kaydedileceği bir konum tanımlayın. Bu sonuçlar, görüntülenen pencerede daha fazla analiz için Excel'e aktarılabilir.

Ardından, 50'lik bir yuvarlanan top yarıçapının seçildiğinden emin olun ve beyaz arka plan seçeneğinin işaretini kaldırın. Bu değişiklik gerekli değildir, ancak genellikle uygulamanın kullanıcıları tarafından tercih edilir. Görselleştirme kolaylığı için Tamam'ı tıklayın.

Kırmızı kanal görüntüsüne karşılık gelen bir maskenin yanında yeni bir pencere açılacaktır. Eşiği, kırmızı maske mümkün olduğu kadar çok sayıda gizli bireysel delinme ile karşılık gelene kadar ayarlayın. Çok fazla gürültü oluşturmadan, bitti'yi tıklayın.

Minimum punctu boyutunu dört piksel olarak ayarlayın. Başka hiçbir şeyde değişiklik yapmayın. Tamam'a tıklayın.

Yeşil kanal için bu sefer önceki adımı tekrarlayın. Bunu yeşil kanal ile tekrarladıktan sonra, eklenti her kanalda ayrı ayrı puncta'ya karşılık gelen niceleme ve iki kanal arasında ortak lokalize bir puncta sağlayacaktır. Burada gösterilen sinaps testi, beyinden kriyo kesitlerine ve omurilik veya retina gibi diğer herhangi bir sinir sistemi dokusuna uygulanabilir.

Uygun bir pre ve post-sinaptik belirteç çifti olması şartıyla. PBS ile kan kaybı ve bolluk ile ötenazi yapılmış bir fareden beyin dokusu toplayarak başlayın. Tüm beyni, ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede PBS'de% 4 paraldehit içine yerleştirin.

Beyni PBS ile üç kez durulayın. Cryo beyni %30 sükroz içine yerleştirerek korur. PBS'de.

Doku başlangıçta yüzer, doku dibe çökene kadar dört santigrat derecede tutulur. Bu aşamada, kriyo koruması tamamlanmıştır. Daha sonra,% 20 sükrozdan oluşan iki ila bir çözelti içinde, OCT ve PBS, bölümleme için istenen oryantasyonda brainin gömer.

Örneğin, sagital veya koronal. Ardından, bir kova kuru buzun üzerine düz bir metal yüzey yerleştirin. Dondurulduktan sonra donması için gömülü beyni üzerine yerleştirin, beyni bir dondurucu poşetine aktarın ve bölümlere ayırmadan önce bir yıla kadar eksi 80 santigrat dereceye koyun.

Bir kriyostat kriyo kullanarak, dokuyu 12 ila 16 mikronluk bölümlere ayırın ve cam slaytlara monte edin. Ardından, slaytları 37 derecelik bir fırına koyarak kurutun. Daha sonra kalan OCT'yi çıkarmak için PBS ile üç kez durulayın.

Sürgünün etrafında hidrofobik bir bariyer oluşturmak için bir parafin kalemi kullanılır ve parafin sınırı tarafından sürgüden akması engellenen sürgüye bloke edici tampon eklenir. Slaytları, bir sonraki yeri engellemek için oda sıcaklığında bir saat boyunca PBS'de% 20 normal keçi serumuna yerleştirin. Primer antikorlardaki kesitler PBS'de %0.3 triton ve %10 normal keçi serumu ile seyreltildi.

Burada, glutamaterjik, post-sinaptik bölmeleri etiketlemek için tavşan antiti, PSD 95 kullanılır ve glutamaterjik pre-sinaptik terminalleri etiketlemek için kobay anti v glu iki kullanılır. Slaytları dört santigrat dereceye yerleştirin ve inkübasyonu takiben 36 ila 60 saat inkübe edin. Slaytları her biri 15 dakika boyunca PBS'ye üç kez batırarak birincil antikoru yıkayın.

Bu adımdan sonra slaytları doğrudan ışıktan koruduğunuzdan emin olun. PBS'de bir ila 200 oranında seyreltilmiş ikincil antikorları %0.3 triton ve %10 normal keçi serumu ile uygulayın. İşte, keçi anti Gine domuzu.

Alexa 4 8 8 ve keçi anti tavşan. Alexa 5, 9, 4 kullanılır. Karanlıkta oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

Slaytları, monte etmek için her biri 15 dakika boyunca PBS'ye dört kez batırarak yıkayın. Dappy ile küçük damlalar vektör kalkanı montaj ortamı ekleyin ve slaytları kapak kızakları ile örtün. Kapak fişlerinin hareketlerini engellemek için oje sürün.

Doku kesitinin görüntülenmesi konfokal mikroskop kullanılarak uygun lazerler ile her kesit görüntüsü için 63 kez yağa daldırma objektifi kullanılarak, toplam beş mikron derinlikte 0.33 mikron aralıklarla seri optik kesitler olmak üzere toplam 15 optik kesit ile yapılmalıdır. Her hayvandan en az üç bölüm görüntülenmeli ve belirli bir deney koşulundan en az üç hayvan dahil edilmelidir. Her biri bir mikron derinliği temsil eden beş projeksiyon elde ederek, ardışık üç bölümden oluşan gruplardan maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturun.

Bunlar, astrositlerin yokluğunda oluşan sinapsların sayısını belirlemek için modifiye edilmiş bir ROI'ye sahip RG C'ler için tarif edildiği gibi Görüntü J kullanılarak ölçülür. İmmünokimya, beklendiği gibi kırmızı ile gösterilen fagot ve yeşil ile gösterilen homer'e karşı antikorlar kullanılarak bazal büyüme ortamı ile tedavi edilen ayrışmış rgc üzerinde gerçekleştirildi. Astrosit salgılanan moleküllerin oluşan sinaps sayısı üzerindeki etkisini belirlemek için çok az sinaptik kolokalizasyon noktası gözlenmiştir in vitro ayrışmış RG C'ler, boyamayı takip eden toplam 12 gün boyunca her üç günde bir fare astrosit şartlandırılmış ortamlarla tedavi edildi.

Bu nöronda çok sayıda sinaps belirgindi, ancak kısa süre sonra kırmızı ile gösterildi. Homer yeşil renkte gösterilmiştir: Sitoplazmik Lee eksprese edilen TD domates ile transfekte edilen ayrışmış RDC'ler sadece bazal büyüme ile muamele edildi. Orta sinapslar görülmez.

TD domatesi mavi, sinaps ise kırmızı renkte görülür. Yeşil renkle gösterilen post-sinaptik işaretleyici homer için çok az sinyal görülüyor. Aynı hücreler kronik olarak sıçan astrosit şartlandırılmış besiyeri ile tedavi edildiğinde, birçok sinaps görülür.

TD domates mavi, sinapsin kırmızı ve homer burada yeşil renktedir. Astrosit şartlandırılmış ortam ile muamele edilmiş ve kırmızı ve sinaptik sonrası homer yeşil belirteçlerde ön sinaps için boyanmış saflaştırılmış bir RGC, delinme analizörü kullanılarak oluşturulan eşik maskeleri, mevcut iki kanala karşılık gelir. Kolokalizasyon noktalarını belirledikten sonra, Puncta analizörü bu noktaların grafiksel bir temsilini verir.

Her iki kanalda ve kolokalizasyon noktaları için tanımlanan ayrık punkta sayısını gösteren puncta analizörü tarafından sayısal bir çıktı sağlanır. Bu nöronun analizi ile üretilen veriler, astrositlerin salgılanan moleküllerinin, burada sinaptik öncesi ve sonrası immünohistokimyasal etiketlemenin kolokalizasyonunun, önemli astrosit salgılanan sinapojenik molekül trombo spon için nöronal reseptörün aşırı ekspresyonu yoluyla astrosit kaynaklı sinaps oluşumunun güçlenmesini göstermek için ölçüldüğü bir sinaps testi olarak gösterilen sinaps oluşumunu teşvik etme yeteneğini göstermektedir. Bu şekilde gösterilen, bazal büyüme ortamı, gm veya astrosit şartlandırılmış ortam ile kronik olarak tedavi edilen nöron başına ortalama sinaps sayısıdır.

A-C-M-A-C-M, retinal ganglion hücrelerinde sinaps oluşumunu, boş bir vektörü eksprese eden hücrelere kıyasla trombo spon reseptörünü eksprese etmeye göre daha güçlü bir şekilde teşvik eder. Fare superior colliculus'taki sinaptik yoğunluğu ölçmek için, sinaptik öncesi ve sonrası bölmeler, bölmeye özgü immünohistokimyasal belirteçler kullanılarak ayrı ayrı etiketlendi. Burada gösterildiği gibi, doğum sonrası yedinci günden P 14'e kadar sinaps sayısında bir artış oldu.

Bu, bu gelişimsel zaman penceresi boyunca üst ulustaki sinaps sayısındaki artışı gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol ayrışmış nöronal kültürler için yaklaşık iki gün içinde ve bu prosedürü takiben hayvandan hasat edilen beyin bölümleri için yaklaşık beş gün içinde tamamlanabilir. Elektrofizyoloji ve elektron mikroskobu gibi diğer yöntemler, sinaptik sayıdaki değişikliklerin sırasıyla hem fonksiyonel sinapslardaki hem de ultra yapısal olarak normal sinapslardaki değişiklikleri yansıttığını doğrulamak için kullanılır.

Bu videoyu izledikten sonra, sinaps sayısını ölçmek için deneysel hazırlığınıza immünohistokimyayı nasıl uygulayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bu protokol, pre-sinaptik ve post-sinaptik kompartmanları seçici olarak etiketlemek için kompartmana özgü antikorların nasıl kullanılacağını detaylandırır. Bu bağlamda, sinapsları, bu belirteçlerin her birinden elde edilen sinyaller arasındaki kolokalizasyon noktaları olarak tanımlıyoruz.