Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi

Nörobilimdeki en önemli hedeflerden biri, sinaps oluşumunun erken evrelerini yönlendiren moleküler ipuçlarını anlamaktır. Bu nedenle, sinaptik bağlantıdaki değişiklikleri nicelleştirmek için objektif yaklaşımlar geliştirmek zorunlu hale gelmiştir. Çeşitli deneysel preparatlarda sinaps sayısını nicelleştirmek için, nöronlar arasındaki sinaptik temas noktalarını işaretlemek amacıyla kültür nöronları veya kriyoseksiyon beyin dokusu preparatları, seçici presinaptik ve postsinaptik markerlar ile boyanır.

Hücreler veya dokular daha sonra floresan mikroskobunda görüntülenir ve iki immünohistokimyasal belirtece karşılık gelen kanalların her biri için sekiz bitlik görüntüler alınır. Görüntüler, puncta analyzer ile Image J 1.29 kullanılarak analiz edilir. Presinaptik ve postsinaptik belirteçler arasındaki kolokalizasyonun derecesini belirlemek için, kolokalizasyon noktaları daha sonra preparatta mevcut olan sinaps sayısını belirlemek amacıyla kullanılabilir.

Burada açıklanan tekniğin elektron mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sinaps analizinin çok daha yüksek kapasiteli bir analiz ve sinaps sayısı sayımı sağlamasıdır. Bu tekniğin temel uygulama alanları; anomaliler ve sinaptik bağlantıların altta yatan patolojinin temeli olduğu düşünülen Alzheimer hastalığı, epilepsi veya otizm gibi klinik bozuklukların teşhisi ve tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu teknik, etkilenen nöronların birbirleriyle sinaps kurma yeteneğinde gördüğümüz eksiklikleri azaltabilecek veya iyileştirebilecek müdahale yöntemlerini belirlemek için kullanılabilir.

Bu yöntem beyin gelişimini incelemek için yararlı olsa da, her bir temas bölgesinin karşıt yüzlerini seçici olarak işaretleme imkanınızın olduğu, hücreden hücreye temas sayısını incelemek veya nicelendirmek istediğiniz diğer model organizmalara veya organ sistemlerine de uygulanabilir. P5-P7 arası hayvanlardan elde edilen ve sıyırınan sıçan retinal ganglion hücrelerini, polilizine kaplı cam lameller üzerine ekerek nöronal kültürler hazırlayın. Hücrelerin, transfeksiyondan önce 24 kuyucuklu bir plakada 37 °C'de üç ila beş gün boyunca büyümesine izin verilir.

Transfeksiyondan sonra, ekilen hücreler yeterince olgunlaştığında sinapsların gelişmesine izin vermek için hücreleri yedi ila sekiz gün daha inkübe edin. Kültür ortamını kuyucuklardan uzaklaştırın ve her bir kuyucuğa önceden ısıtılmış 500 µL %4 paraformaldehit ekleyerek oda sıcaklığında yedi dakika boyunca sabitleyin. Sabitleme işleminin ardından hücreleri fosfat tamponlu salin ile üç kez durulayın.

Hücrelerin kuyucuklarda asla kurumasına izin verilmediğinden emin olmak önemlidir. Bir kuyucuktan tampon çözelti uzaklaştırıldıktan sonra, vakit kaybetmeden bir sonraki tampon ile değiştirilmelidir. %50 normal keçi serumu ve %0,2 Triton X 100 içeren bloklama tamponunu hazırlayın.

Her bir kuyucuktan PBS'yi uzaklaştırdıktan sonra, her kuyucuğa 200 µL bloklama tamponu ekleyin ve 30 dakika boyunca bloklama yapın. Oda sıcaklığında, bloklama tamponunu uzaklaştırın ve üç kez durulayın. PBS ile, seçilen pre ve post sinaptik antikor çiftini içeren %90 antikor tamponu ve %10 NGS çözeltisinde bir primer antikor dilüsyonu hazırlayın.

Burada, pre-sinaptik bir belirteç olan tavşan anti-sinapsin ve post-sinaptik bir belirteç olan fare anti-homer kullanılmıştır. Çökmüş antikorları uzaklaştırmak için primer antikor dilüsyonunu bir masaüstü santrifüjde maksimum hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin, ardından her kuyucuğa 200 microliters primer antikor solüsyonu ekleyin. Primer solüsyonun kurumasını önlemek için plakayı nemlendirilmiş bir kaba yerleştirin.

Primer antikor ile inkübasyonu takiben, dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Her kuyucuğu üç kez yıkayın. PBS ile, önceden hazırlanmış %10 NGS içeren antikor tamponunda 1:1000 oranında seyreltilmiş 200 µL uygun sekonder antikor ekleyin.

Daha önce yapıldığı gibi, sekonder antikorlarla inkübasyonun ardından plakayı nemlendirilmiş hazneye yerleştirin ve oda sıcaklığında, karanlıkta iki saat boyunca inkübe edin. Her kuyuğu PBS ile üç ila dört kez durulayın. Bir lam üzerine DPI içeren vector shield montaj medyumu damlatın.

Ardından, hücrelerin bulunduğu lamelini montaj için damlanın üzerine ters çevirerek yerleştirin. Son olarak, lamelin kenarlarına şeffaf oje sürün. Uygulama sırasında lamelleri itmemeye veya hareket ettirmemeye dikkat edin.

Bu işlem hücreleri paylaşacağı için, lamların kuru ve karanlık bir yerde en az 30 dakika boyunca kurumasına izin verin. Burada görüntüleme, uygun filtre setleri ve 63 kat yağ daldırma objektif ile donatılmış bir zes axio imager floresan mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilir. Transfekte edilmemiş hücreler içeren bir lamı mikroskop tablasına yerleştirin.

Hücre çekirdeklerini görüntülemek için DPI filtre setini kullanarak, en yakın komşularından en az iki hücre çapı kadar uzakta olan hücreleri seçin. Bu adımda DPI kullanımı, yanlılığı önlemeye yardımcı olacak ve hücre seçiminin rastgeleliğini sağlayacaktır. Seçilen her hücre için, uygun filtre setlerini (bu durumda GFP ve Texas Red) kullanarak sekiz bitlik görüntüler elde edin.

Üst üste bindirilmiş yalancı renkli görüntü, sırasıyla presinaptik ve postsinaptik belirteçleri kırmızı ve yeşil renklerde göstermelidir. Ardından, transfekte edilmiş hücreler içeren bir lamı mikroskop tablasına yerleştirin. Burada hücreler, bir TD tomato ekspresyon vektörü ile transfekte edilmiştir.

Hücreleri daha önce olduğu gibi seçmek için bu işaretçiyi kullanın. Seçilen her hücre için, bu durumda GFP, Texas Red ve Sci five uygun filtre setlerini kullanarak sekiz adet pit görüntüsü elde edin. Üst üste bindirilmiş yalancı renkli görüntüde, post-sinaptik işaretçiler kırmızı, yeşil ve mavi renklerde olmalıdır.

Burada, kolokalize sinaptik punktaların kantifikasyonu için punkt analizör programı kullanılmaktadır. Puncta analizör eklentisi Barry Walk tarafından yazılmıştır ve ImageJ 1.26 sürümünde talep üzerine temin edilebilir. Toplanan görüntülerden birini açın.

İlgilenilen SOR'un radyal olarak çevresinde, yaklaşık bir hücre çapında bir bölgeyi seçmek için dairesel seçim aracını kullanın. İlgi bölgesi seçiliyken, eklentiler menüsüne gidin ve karşınıza çıkan analiz seçenekleri penceresinden puncture analyzer seçeneğini belirleyin. Kırmızı Kanal ve Yeşil Kanal seçeneklerini seçin. İlk olarak arka planı çıkarın ve sonuç dosyasını ayarlayın.

Tamam'a tıklayın. Ardından sonuçların kaydedileceği konumu belirleyin. Bu sonuçlar, açılan pencerede daha fazla analiz için Excel'e aktarılabilir.

Ardından, 50'lik bir yuvarlanan top yarıçapının (rolling ball radius) seçili olduğundan emin olun ve beyaz arka plan seçeneğinin işaretini kaldırın. Bu değişiklik zorunlu değildir ancak uygulamanın kullanıcıları tarafından sıklıkla tercih edilir. Görselleştirmeyi kolaylaştırmak için tamam'a tıklayın.

Kırmızı kanal görüntüsüne karşılık gelen bir maskeyle birlikte yeni bir pencere açılacaktır. Eşik değeri, kırmızı maske mümkün olduğunca çok sayıda ayrı bireysel delikle örtüşene kadar ayarlayın. Çok fazla gürültü oluşturmadan, bittiye tıklayın.

Minimum noktalama işareti boyutunu dört piksel olarak ayarlayın. Başka hiçbir şeyi değiştirmeyin. Tamam'a tıklayın.

Önceki adımı bu kez yeşil kanal için tekrarlayın. Bu işlem yeşil kanal için de tamamlandıktan sonra, eklenti her kanaldaki puncta'lar için ayrı ayrı nicelleştirme ve iki kanal arasındaki ko-lokalize puncta'lar için veri sağlayacaktır. Burada gösterilen sinaps analizi, beyin kriyoseksiyonlarına ve spinal kord veya retina gibi diğer tüm sinir sistemi dokularına uygulanabilir.

Uygun bir pre ve post-sinaptik marker çiftinin mevcut olması koşuluyla. Eksanguinasyon ile ötanize edilmiş ve PBS ile yıkanmış bir fareden beyin dokusunu hasat ederek başlayın. Tüm beyni, dört derece santigrat sıcaklıkta bir gece boyunca PBS içinde %4 paraldehit çözeltisine yerleştirin.

Beyni üç kez PBS ile yıkayın. Beyni PBS içindeki %30 sükroz çözeltisine yerleştirerek kriyoproteksiyon uygulayın.

Doku, dibe çökene kadar başlangıçta 4 °C'de yüzer durumda tutulacaktır. Bu aşamada kriyokoruma tamamlanmıştır. Ardından, %20 sükroz, OCT ve PBS'den oluşan 2:1 oranındaki bir solüsyon içinde beyni, kesit alma için istenen yönelimde gömün.

Örneğin, sagital veya koronal. Ardından, kuru buz dolu bir kovanın üzerine düz metal bir yüzey yerleştirin. Gömülü beyni dondurmak için bunun üzerine koyun; donma işlemi tamamlandığında beyni bir dondurucu torbasına aktarın ve kesit alma işleminden önce bir yıla kadar -80 °C'de saklayın.

Bir kriyostat kullanarak dokuyu 12 ila 16 mikronluk kesitler halinde kesin ve cam slaytlara monte edin. Ardından, slaytları 37 °C'lik bir fırına yerleştirerek kurutun. Daha sonra, kalıntı OCT'yi uzaklaştırmak için slaytları üç kez PBS ile durulayın.

Lam etrafında hidrofobik bir bariyer oluşturmak için bir parafin kalem kullanılır ve bloklama tamponu, parafin sınır sayesinde lamdan dışarı akması engellenerek eklenir. Bloklama için lamları, oda sıcaklığında bir saat boyunca PBS içinde %20 normal keçi serumunda bekletin; ardından kesitleri, %0,3 triton ve %10 normal keçi serumu içeren PBS ile seyreltilmiş primer antikorlara yerleştirin.

Burada, glutamaterjik postsinaptik bölmeleri işaretlemek için tavşan anti-PSD 95 ve glutamaterjik presinaptik terminalleri işaretlemek içinle gine domuzu anti-vGluT2 kullanılır. Lamları 4 °C'ye yerleştirin ve 36 ila 60 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, lamları üç kez 15'er dakika boyunca PBS içine daldırarak primer antikoru yıkayın.

Bu adımdan sonra, lamları doğrudan ışıktan koruduğunuzdan emin olun. %0,3 triton ve %10 normal keçi serumu içeren PBS içinde 1/200 oranında seyreltilmiş sekonder antikorları uygulayın. Burada, keçi anti Gine domuzu kullanılmıştır.

Alexa 488 ve keçi anti-tavşan Alexa 594 kullanılır. Oda sıcaklığında, karanlıkta iki saat boyunca inkübe edin.

Slaytları, montaj öncesinde her biri 15 dakika sürecek şekilde dört kez PBS içine daldırarak yıkayın. Slaytlara dappy ile küçük damlalar halinde vector shield montaj ortamı ekleyin ve slaytları lamellerle kapatın. Lamellerin hareketini engellemek için oje uygulayın.

Doku kesitlerinin görüntülemesi, her bir kesit görüntüsü için 63x yağ daldırma objektifi kullanılarak, uygun lazerlerle donatılmış bir konfokal mikroskop ile gerçekleştirilmelidir; toplam beş mikron derinlik boyunca 0,33 mikron aralıklarla seri optik kesitler alınarak toplam 15 optik kesit elde edilmelidir. Her hayvandan en az üç kesit görüntülenmeli ve belirli bir deney koşulundan en az üç hayvan dahil edilmelidir. Ardışık üç kesitlik gruplardan, her biri bir mikron derinliği temsil eden beş projeksiyon oluşturacak şekilde maksimum yoğunluk projeksiyonları (maximum intensity projections) üretilmelidir.

Bunlar, astrositlerin yokluğunda oluşan sinaps sayısını belirlemek amacıyla, modifiye edilmiş bir ROI kullanılarak RG Cs için açıklandığı şekilde Image J ile nicelleştirilmiştir. İmmünokimya, bazal büyüme ortamıyla işlem görmüş disosiye rgc'ler üzerinde, beklendiği üzere kırmızıda gösterilen bassoon ve yeşilde gösterilen homer karşıtı antikorlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İn vitro disosiye edilmiş RG Cs üzerinde astrosit kaynaklı salgıların sinaps sayısı üzerindeki etkisini belirlemek için, boyama sonrası toplam 12 gün boyunca her üç günde bir fare astrosit kondisyonlu ortamı uygulanmış ve çok az sayıda sinaptik kolokalizasyon noktası gözlemlenmiştir.

Bu nöronda çok sayıda sinaps belirgindi, ancak soon kırmızı renkte gösterilmiştir. Homer yeşil renkte gösterilmiştir; sitoplazmik Lee ile transfekte edilip TD tomato eksprese eden ayrıştırılmış RDC'ler yalnızca bazal büyüme ortamı ile işlenmiştir. Sinapslar görülmemektedir.

TD domates mavide ve sinaps ise kırmızıda görülmektedir. Yeşil renkte gösterilen post-sinaptik belirteç homer için çok az sinyal görülmektedir. Aynı hücreler kronik olarak sıçan astrosit kondisyonlu ortamı ile tedavi edildiğinde, birçok sinaps görülür.

Burada TD tomato mavi, synapsin kırmızı ve homer yeşil renktedir. Astrosit koşullandırılmış ortam ile işlem görmüş, presinaptik işaretleyici için kırmızı ve postsinaptik homer yeşil işaretleyicileri ile boyanmış saflaştırılmış bir RGC gösterilmektedir; puncture analyzer kullanılarak oluşturulan eşik maskeleri mevcut iki kanala karşılık gelmektedir. Kolokalizasyon noktaları belirlendikten sonra, Puncta analyzer bu noktaların grafiksel bir temsilini sunar.

Puncta analizörü tarafından, her iki kanalda tanımlanan ayrı punctaların sayısını ve kolokalizasyon noktalarını belirten sayısal bir çıktı sağlanır. Bu nöronun analizinden elde edilen veriler, astrositler tarafından salgılanan moleküllerin sinaps oluşumunu teşvik etme yeteneğini örneklendirmektedir; burada, önemli bir astrosit salgılı sinapsjenik molekül olan thrombospondin'in nöronal reseptörünün aşırı ekspresyonu ile astrosit kaynaklı sinaps oluşumunun potansiyalizasyonunu göstermek amacıyla, pre- ve post-sinaptik immünohistokimyasal markalamanın kolokalizasyonunun nicelendirildiği bir sinaps deneyi olarak sunulmuştur. Bu şekilde, bazal büyüme ortamı (gm) veya astrosit kondisyonlu ortam ile kronik olarak tedavi edilen nöron başına ortalama sinaps sayısı gösterilmektedir.

A-C-M-A-C-M, boş vektör eksprese eden hücrelere kıyasla trombospon reseptörünü eksprese eden retinal ganglion hücrelerinde sinaps oluşumunu daha güçlü bir şekilde teşvik eder. Fare superior kollikulusundaki sinaptik yoğunluğu nicelendirmek için, bölmeye özgü immünohistokimyasal belirteçler kullanılarak pre-sinaptik ve post-sinaptik bölmeler ayrı ayrı işaretlenmiştir. Burada gösterildiği üzere, doğum sonrası yedinci günden P 14'e kadar sinaps sayısında bir artış gerçekleşmiştir.

Bu, belirtilen gelişimsel zaman aralığında superior colliculus'taki sinaps sayısındaki artışı göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu protokol disosiye nöronal kültürler için yaklaşık iki günde, bu prosedürü takip eden hayvanlardan alınan beyin kesitleri için ise yaklaşık beş günde tamamlanabilir. Sinaptik sayıdaki değişikliklerin sırasıyla hem fonksiyonel sinapslardaki hem de ultrastrüktürel olarak normal sinapslardaki değişimleri yansıttığını doğrulamak için elektrofizyoloji ve elektron mikroskopisi gibi diğer yöntemler kullanılır.

Bu videoyu izledikten sonra, sinaps sayısını belirlemek için deneysel hazırlığınıza immünohistokimyanın nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu protokol, pre ve post-sinaptik kompartmanları seçici olarak işaretlemek için kompartman spesifik antikorların nasıl kullanılacağını detaylandırmaktadır. Bu bağlamda sinapsları, bu markerların her birinden elde edilen sinyallerin kolokalizasyon noktaları olarak tanımlıyoruz.