Name: İzleme Oluşumu ve Antifungal Duyarlılık Testi için 96 Şey microtiter Levha tabanlı Yöntemi Candida albicans Biyofilmler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Öğrenin, 96 kuyucuklu mikrotiter plakalar kullanarak Candida albicans biyofilmleri oluşturma ve antifungal duyarlılık testi yapma yöntemini. Bu teknik, metabolik aktivite ölçümü ile hızlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratuvarda Biyofilm ilgili çalışmaları hibe tarafından finanse Diş ve Kraniofasial Araştırma ve Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar (JLL-R). Enstitüsü Ulusal Enstitüsü R21DE017294 ve R21AI080930 sayılı. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIDCR NIAID veya NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. C. hazırlanması albicans C. albicans Risk Grubu 1/BSL1 mikroorganizma. Her zaman bu mikroorganizma ile çalışmak için iyi aseptik / steril teknikleri kullanmak ve biyolojik zararlı maddeleri uygun şekilde bertaraf edilmesi için kurumsal prosedürleri takip etmek hatırlıyorum. <ol><li> C. bir gecede kültür hazırlayın C tek bir koloni aşılanarak YPD (Maya Peptonlu Dekstroz) sıvı ortamda albicans YPD 25 ml içine albicans. </li><li> 30 ° C gecede orbital çalkalayıcı (yaklaşık 180 rpm) kültür inkübe edin. En C. albicans suşlarının, bu koşullar altında maya hücreleri gibi büyüyecek. </li><li> Santrifüj gecede kültürleri (yaklaşık 3000 rpm, 5-10 dakika), steril PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve RPMI 1640 ortamın pH 7.0 ve önceden ısıtılmış 165 mM morpholinepropanesulfonic asit ile tampon 20-25 ml nihai pelet tekrar süspansiyon 37 ° C (bu ortamda artık sadece "RPMI 1640" olarak anılacaktır). </li><li> Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Sayımından sonra, 1.0 x 10 6 hücre / mL RPMI 1640 son bir yoğunlukta hücre süspansiyon hazırlamak. Not: hücrelerinin toplu bir eğilim olduğundan, yıkamalar arasında ve pipetleme önce şiddetle vorteks önemlidir. </li></ol> 2. Biyofilm Oluşumu için 96-iyi microtiter Plaka Ayarlama <ol><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak C. 100 mcL ekleyin 96-iyi mikrotiter plate (-s) seçilen kuyulara albicans süspansiyon. Bu negatif kontrol olarak hizmet verecek, sütun 12 kuyu hücreleri eklemek etmeyin. </li><li> Kapak orijinal kapağı ile tüm mikrotiter plaka, mühür parafilm ile, 37, 24 saat için bir kuluçka ve inkübe içinde yer ° C. Inkübasyon süresi belirli deneysel tasarım adapte edilebilir. - 48 saat (yani 2, 4, 8, 12, 24 ve 48 saat) farklı zaman noktalarında birden fazla plakalar ekim ve her plaka işleme Örneğin, (24) bir süre üzerinde biyofilm oluşumu kinetiği incelemek mümkündür </li><li> Biyofilm oluşumundan sonra, çok kanallı pipet kullanarak dikkatle kuyuların her birinde oluşan biyofilm gibi dokunmatik ve bozmak için değil orta aspirat. </li><li> Bir çok kanallı pipet yıkama plakaları steril PBS (ortalama 200 mcL) üç kez kullanılması. Alternatif olarak, otomatik bir mikrotiter tabak yıkama kullanın. Yıkar yılları arasında, özellikle son yıkamadan sonra, herhangi bir kalıntı PBS kaldırmak için kağıt havlu ile blot ters bir pozisyonda plakaları boşaltın. Bu noktada kuyu alt kısmında oluşan biyofilm çıplak gözle bile açıkça görülebilir olmalı ve aynı zamanda ters bir mikroskop kullanılarak (Şekil 1) görüntülenebilmekte. Biyofilmler antifungal duyarlılık testi testleri için işlenmek üzere hazır. (Deneyin temel amacı, biyofilm oluşumu ölçüde değerlendirmek için ise, plakaları kolorimetrik yöntemi kullanılarak işlenecek hazır. XTT / menodion reaktifi (bkz. Adım 3) Bunun için ortaya çıkan renk olabilir ) mikrotiter plate okuyucusu kullanılarak okunabilir. </li></ol> 3. Biyofilmler Antifungal duyarlılık testleri <ol><li> Stok solüsyonları veya toz, RPMI 1640 ortamında test edilecek her antifungal çalışan bir solüsyon hazırlanır. Tipik yüksek konsantrasyonu 1.024 mg / ml flukonazol için ve 16 mcg / ml amfoterisin B ve kaspofungin. Diğer konsantrasyonları farklı ajanlar için kullanılıyor olabilir. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, mantar biyofilm içeren her mikrotiter plate 1. sütununda karşılık gelen kuyulara antifungal yüksek çalışma konsantrasyonu 200 mcL ekleyin. </li><li> 2 - 10 sütunlar, her kuyuya RPMI 1640 100 mcL ekleyin. </li><li> Sütun 11 kuyulara RPMI 1640 100 mcL ekleyin. </li><li> Kolon 1 kuyulardan antifungal ajan 100 mcL çıkarın ve sütun 2 bitişik kuyuları (zaten 100 mcL orta içeren) ekleyin. </li><li> Iyi bir seri katlanan seyreltme gerçekleştirmek için yukarı ve aşağı pipetleme içeriğini karıştırın ve ipuçları kaldırmak. </li><li> Karıştırıldıktan sonra 10 sütun kuyulardan son 100 mcL hacmi atılır sonra sütun 10 kuyu, kadar doğru hareket tekrarlayın. Bu şekilde, bir dizi ilgi ajan (-ler) dilüsyonları iki katına, 10 sütun, kuyu en konsantre sütun 1 kuyu en çok konsantre gelen. 11 sütun rakipsiz biyofilm pozitif kontrol olarak görev yapacak ve 12 sütun boş kuyular negatif kontrol olarak görev yapacak. </li><li> 37 kapaklar, 24 -48 saat parafilm ve inkübe mühür ile plakalar Kapak ° C </li><li> Kuluçka döneminden sonra (3 x PBS) önce Adım 2.4 'gibi plakalar yıkayın. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak arka plan X ölçümü için negatif kontrol kuyuları için iyi bir ön yıkanmış biyofilm içeren her yanı sıra 100 mcL XTT / menodion çözüm eklemekTT-kolorimetrik düzeyleri. <ol><li> XTT 0.5 g / L, 0.22 mikron gözenek boyutu filtre kullanarak filtre ile sterilize edilmiş olması gerekir steril Ringer laktat, PBS veya tuzlu doymuş bir çözüm olarak hazırlanmıştır. XTT çözümü ışığa karşı hassastır, bu yüzden hazırlanması sırasında alüminyum folyo ile kaplanmış olmalıdır. -70 Hazırlandıktan sonra ve filtre ile sterilize edilmiş 10 mL çalışma birimlere kısım, ve mağaza ° C Alüminyum folyo kullanarak ışık tüpleri koruyun. Kullanımdan hemen önce belirli bir deney için gerekli olarak birçok boru türü olarak sadece Çözülme. </li><li> Menadiyon küçük hacimleri (yaklaşık 50 mcL) içine aliquoted ve -70 saklanan 100% aseton 10 mM stok solüsyonu ° C olarak hazırlanmıştır. 10 ml çözülmüş XTT çözüm içeren bir tüp menodion, stok solüsyonu 1 mcL ekleyerek, kullanımdan hemen önce XTT / menodion çözüm hazırlayın. </li></ol></li><li> 37, 2 saat süreyle karanlıkta alüminyum folyo ve inkübe plakaları Kapak ° C </li><li> Plakalar ortaya çıkarın. Bir çok kanallı pipet kullanarak yeni bir mikrotiter plate ile ilgili kuyulara her iyi ve transfer renkli likit 80 mcL çıkarın. </li><li> Mikrotiter plate okuyucusu 490 nm'de bir plaka (lar) ı okuyun. </li><li> Kolorimetrik okumaları bir kontrol antifungal ilaç yokluğunda oluşan biyofilm karşılaştırma (bu durumda 11 sütun için değerler% 50 veya% 80 azalma tespit edildiği antifungal konsantrasyonları sesil minimum inhibitör konsantrasyonları SMIC50 ve SMIC80 hesaplayın , negatif kontrol), sadece XTT içeren sütun 12 kuyulardan değerleri çıkarmak için de hatırlıyorum. SMIC sonuçları bir tablo (yani birden fazla antifungaller karşı birden fazla izolatları) veya alternatif olarak, her antifungal karşı izole her bir mantar için antifungal konsantrasyonu yüzde inhibisyonu karşı komplo grafik olarak sunulabilir olarak sunulabilir. </li></ol> Örnek: negatif kontrol değerleri çıkarılarak sonra, ortalama OD kontrolü sütun 11 oluşan biyofilm 1.32. SMIC50 az 1.32 x 50/100 = 0,66 Bu durumda, kolorimetrik okumaları&gt;% 50 azalma önde gelen düşük antifungal konsantrasyon. Aynı şekilde SMIC80, bu durumda daha az 1.32 x 20/100 = 0.264, kolorimetrik okumaları&gt;% 80 azalma önde gelen düşük antifungal konsantrasyon. 4. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 C microphotograph albicans biyofilm ters bir mikroskop kullanılarak alınan bir 96 mikrotiter plate iyi bir alt kurdu. Şekil 2, her biri için bir C 11 biyofilm XTT kolorimetrik okumaları (OD 490 değerleri ) albicans vahşi tip suşu aynı 96 mikrotiter plate 8 farklı satırların her birinde kurdu. Şekil 3 amfoterisin B'nin C'ye karşı farklı konsantrasyonlarda faaliyet göstermektedir albicans biyofilm; oklar SMIC50 ve SMIC80 değerleri göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. (A) Panel A, C inverted mikroskop bağlı bir kamera ile alınan bir microphotograph gösterir albicans biyofilm RPMI orta ve müteakip yıkamalar PBS ile aspirasyon sonra kuyunun altındaki kurdu. Tipik bir C (B) mikrografı albicans biyofilm taramalı elektron mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Barlar panelleri sırasıyla A ve B için 100 mikron ve 10 mikron. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Birden fazla eşdeğer C Oluşumu 96-iyi microtiter plakalar albicans biyofilm bir C oluşturduğu biyofilm XTT-azaltma testleri Kolorimetrik okumaları (OD 490 değerleri) microtiter plakalar kuyularda albicans yabani türü. Değerler aynı 96 mikrotiter plate 8 farklı satırların her birinde oluşan 11 bağımsız biyofilm içindir. Farklı satırlar için tek yönlü varyans analizi ve sapmaların homojenlik ve Bonferroni çoklu karşılaştırma testi sonrası Bartlett testi kullanılarak karşılaştırıldı. (P&gt; 0.05) her satır tüm çiftleri karşılaştırırken istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar tespit edildi. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. C'ye karşı antifungal duyarlılık testi tipik sonuçlar C biyofilm karşı farklı amfoterisin B konsantrasyonlarının etkinliği tipik sonuçlar betimleyen albicans biyofilm Grafik albicans vahşi tip süzün. Değerler ortalama yüzde kuyuları kontrol ile karşılaştırıldığında XTT azaltma deneyleri için kolorimetrik okuma olarak ifade edilir. SMIC50 ve SMIC80 değerleri oklarla gösterilir.

<ol><li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activity+of+caspofungin+against+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).</li>
<li>Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+2%2C3-bis%282-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl%29-5-%5B%28phenylamino%29carbonyl%5D-2H-t+etrazolium+hydroxide+%28XTT%29+colorimetric+method+with+the+standardized+National+Committee+for+Clinical+Laboratory+Standards+method+of+testing+clinical+yeast+isolates+for+susceptibility+to+antifungal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents.</a> J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).</li>
<li>Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uses+and+limitations+of+the+XTT+assay+in+studies+of+Candida+growth+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism.</a> J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).</li>
<li>Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+susceptibility+of+Candida+biofilms%3A+Unique+efficacy+of+amphotericin+B+lipid+formulations+and+echinocandins%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).</li>
<li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p%3A+a+regulator+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biol%22%5BJournal%5D)">C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation.</a> Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).</li>
<li>Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+biofilms%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Candida biofilms: an update.</a> Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li>
<li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+combinations+against+Candida+albicans+biofilms+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).</li>
<li>Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pharmacodynamic+properties+of+three+antifungal+agents+against+preformed+Candida+albicans+biofilms+determined+by+time-kill+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).</li>
<li>Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Iberoam.+Micol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li>
<li>Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+endpoint+determination+system+for+antifungal+susceptibility+testing+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).</li>
<li>Nett, J., Andes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilm+development%2C+modeling+a+host-pathogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).</li>
</ol>

JLL-R, antifungal ajanlar gelişmekte olan MicrobeHTS Technologies, Inc öz sermaye sahibi. MicrobeHTS Technologies, Inc bu çalışmalar için herhangi bir mali destek sağladı.

Burada XTT kullanarak biyofilm içinde hücrelerin metabolik faaliyetleri ölçen bir kolorimetrik yöntemi ile birleştiğinde Candida biyofilm oluşumu için, basit, hızlı, ekonomik ve yüksek tekrarlanabilir 96 mikrotiter plate modeli açıklanmaktadır . Bu biyofilm oluşumu için 96 iyi mikrotiter plate modeli C için geliştirilmiş. albicans, ancak diğer Candida türleri için kullanılabilir. ve diğer mantar organizmalar için kolayca adapte. Bu yöntem, birden fazla parametre ve biyofilm oluşumunu ...

<table><tbody><tr><td>Sabouraud-dekstroz agar</td><td>BD Biosciences</td><td>211584</td><td>Fungal izolatların taze alt kültürleri için plak hazırlamak amacıyla</td></tr><tr><td>YPD: Maya pepton dekstroz</td><td>US Biological</td><td>Y2076</td><td>Gece boyu sıvı kültürlerin çoğaltılması için besiyeri</td></tr><tr><td>L-glutamin ile desteklenmiş, sodyum bikarbonat içermeyen RPMI-1640</td><td>Cellgro</td><td>50-020-PB</td><td>Biyofilm oluşumu için sıvı besiyeri</td></tr><tr><td>Morfolinpropan sülfonik asit (MOPS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td>RPMI 1640'ı tamponlamak için</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin, PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Yıkama işlemleri için tampon</td></tr><tr><td>XTT sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4251</td><td>Hazırlama talimatları için yukarıya bakınız</td></tr><tr><td>Ringer&amp;rsquo;s laktat</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC0409-7953-09</td><td>XTT çözeltisinin hazırlanması için</td></tr><tr><td>Menadion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5625</td><td>Dikkat: cilt teması, soluma veya yutma yoluyla tehlikelidir</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik santrifüj tüpleri</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik santrifüj tüpleri</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyucuklu mikrotitre plakaları: Polistiren, düz tabanlı, doku kültürü işlem görmüş</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet ve uçlar</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Herhangi Bir Tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotitre plaka okuyucu</td><td>Herhangi Bir Tedarikçi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İzleme oluşumu ve antifungal duyarlılık testi için 96 Şey microtiter levha tabanlı yöntemi candida albicans biyofilmler

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans, şimdi ABD hastaneleri, üçüncü en sık görülen enfeksiyon bozukluğu olan hastalarda kandidiyazis ve genişleyen bir nüfus mantar enfeksiyonlarının en sık nedeni olmaya devam etmektedir . Kandidiyazis farklı tezahürleri biyofilm oluşumu, hem ev sahibi doku ve / veya tıbbi cihazlar (yani kateter) ile ilişkilidir. Biyofilm içinde hücrelerinin konağın immün yanıtları ve antifungallerin eylem korunur Biyofilm oluşumu, negatif klinik etkileri taşır. Biz C. oluşumu için, basit, hızlı ve güçlü bir in vitro model geliştirdik albicans biyofilm antifungal duyarlılık testi için de kullanılabilir 96 mikrotiter plakalar, biyofilm. Bu testte okuma, metabolik olarak aktif fungal biyofilm hücreleri tarafından XTT azaltılması (tetrazolium tuz) dayalı, kolorimetrik. Tipik bir deneyde, antifungal duyarlılık testi için ek bir 24 saat, biyofilm oluşumu için yaklaşık 24 saat sürer. Çünkü sadeliği ve yaygın olarak kullanılan laboratuar malzemeleri ve ekipman kullanımı, bu tekniğin, biyofilm araştırma democratizes ve antifungal duyarlılık testi mantar biyofilm standardizasyon doğru önemli bir adımı temsil etmektedir.

Biz oluşumu için basit, hızlı ve sağlam bir bir yöntem tarif<em&gt; Candida albicans</em&gt; Biyofilm içinde hücre antifungal duyarlılık testi 96 microtiter plakalar ve kendi programını kullanarak biyofilm.

İzleme Oluşumu ve Antifungal Duyarlılık Testi için 96 Şey microtiter Levha tabanlı Yöntemi Candida albicans Biyofilmler

Compromised hastalardan oluşan ve giderek genişleyen bir popülasyonda Candida albicans, fungal enfeksiyonların en sık görülen nedeni olmaya devam etmektedir ve kandidiyazis günümüzde üçüncü...

Bu prosedürün genel amacı, candida albicans biyofilmleri oluşturmak ve bunların antifungal ajanlara karşı duyarlılığını incelemektir. Bu işlem, öncelikle 96 kuyucuklu mikrotitre plakalarının kuyucuklarında bu fungal biyofilmler oluşturularak gerçekleştirilir; ardından önceden oluşturulmuş biyofilmlere antifungaller eklenir ve bu inkübasyonu takiben 24 ila 48 saat boyunca inkübe edilir.Biyofilmler içindeki hücrelerin metabolik aktivitesini ölçen kolorimetrik bir yöntem, antifungallerin biyofilmlere karşı minimum inhibitör konsantrasyonunu belirlemek amacıyla bu ajanların aktivitesini ölçmek için kullanılır. Nihayetinde, kolorimetrik okuma ile birleştirilmiş, basit ve kolay bir 96 kuyucuklu mikrotiter plaka tabanlı yöntem aracılığıyla biyofilm oluşturma yeteneği ve antifungal duyarlılık testi sonuçları elde edilebilir. Bu tekniğin temel avantajı; kolay, nispeten düşük maliyetli, yüksek düzeyde tekrarlanabilir olması ve birden fazla eşdeğer biyofilmin oluşumuna izin vermesidir.Ayrıca, çoğu araştırma ve klinik laboratuvarında yaygın olarak bulunan 96 kuyucuklu platform teknolojisi ile uyumludur. Bu tekniğin doğurduğu sonuçlar kanidlerin tedavisine kadar uzanmaktadır; zira bu enfeksiyonlar çok sık biyofilm oluşumu ile ilişkilendirilmektedir.Uygun mikrobiyolojik uygulama tekniklerini kullanarak, SAU dekstroz bakır plaktaki taze albicans alt kültüründen bir öze dolusu hücre alın ve 25 mL maya pepton dekstroz besiyeri içeren 125 mL'lik bir erlenmeyer flaskına inoküle edin; kültürü 180 RPM ve 30 °C'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, maya kültürlerini 50 mL'lik konik tüplere aktarın ve 3000 RPM'de 5 ila 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve vorteksleyin.Hücreleri ayrıştırmak için peleti kuvvetlice karıştırın. Ardından, kültürleri tekrar santrifüjlemeden önce yıkamak için steril PBS ekleyin. Bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın ve sonra hücreleri yeniden süspande edin.pH 7.0'ye tamponlanmış yaklaşık 20 mililitre RPMI 1640 besiyerinde. 165 milimolar mops çözeltisi kullanarak ve 37 degrees Celsius'ye önceden ısıtarak, bu süspansiyondan standart bir hemositometre ve parlak alan mikroskobu kullanarak bir ila 100 dilüsyon hazırlayın. Hücreleri sayın.Ardından, ılık tamponlu RPMI 1640 içerisinde 1x10⁶/mL konsantrasyonunda nihai bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, steril 96 kuyucuklu düz tabanlı bir mikrotitre plakasının seçili kuyucuklarına 100 µL hücre süspansiyonu ekleyin. Negatif kontrol olarak kullanılacakları için 12. kolondaki kuyucukları boş bırakın.Plakayı paraform ile kapatıp mühürledikten sonra, biyofilmlerin oluşması için 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her kuyucuktaki medyumu, dipte oluşan biyofilmleri bozmamaya dikkat ederek nazikçe aspire edin ve atın.Yıkamak için her kuyucuğa 200 µL PBS ekleyin ve plakayı dikkatlice ters çevirip kağıt havlu yığınına bastırarak boşaltın. Bu yıkama adımını üç kez tekrarlayın. Bu aşamada, biyofilmler gözle tespit edilebilir ve ters mikroskop veya SEM kullanılarak görüntülebilir.Biyofilmlerin, filamentlerin ve maya hücrelerinin birbirine geçmiş bir karışımından oluştuğu görülebilir. Biyofilm oluşumu doğrulandıktan sonra, antifungal ajanların testi tamponlanmış RPMI 1640 besiyeri kullanılarak başlatılabilir; test edilecek antifungal ajanların yüksek konsantrasyonlu çalışma çözeltileri hazırlanmalıdır. Tipik yüksek konsantrasyonlar, flukonazol için 1024 micrograms per milliliter, amfoterisin B ve kaspofungin için ise 16 micrograms per milliliter'dir.Ardından, birinci sütundaki kuyucuklara 200 µL antifungal çözelti ve iki ile on bir arasındaki sütunlardaki kuyucuklara 100 µL tamponlu RPMI 1640 besiyeri ekleyin. Birinci sütundaki kuyucuklarda bulunan yüksek konsantrasyonlu antifungal çözeltilerin 100 µL'sini ikinci sütundaki kuyucuklara aktararak bir dizi seri iki katlı seyreltme gerçekleştirin.Karıştırmak için nazikçe pipetleyip yukarı-aşağı yaptıktan sonra, ikinci sütun kuyucuklarından üçüncü sütun kuyucuklarına ve bu şekilde 10. sütuna kadar 100 microliters pipetleyin. 11. sütun pozitif kontrol olarak hizmet edeceğinden bu sütuna herhangi bir antifungal solüsyon eklemeyin ve 10. sütun kuyucuklarındaki son 100 microliters'ı atın. 12. sütundakiler hariç tüm kuyucuklar.Şu anki final hacmi 100 µL olmalıdır. Plakanın üzerini kapatın, parafilm ile mühürleyin ve antifungal maddelerin etki etmesi için 24 ila 48 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin. İnkübasyonun ardından, plakayı daha önce tarif edildiği gibi PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, negatif kontrol kuyucukları da dahil olmak üzere tüm kuyucuklara 100 µL XTT medyum çözeltisi ekleyin.12. kolonda. Plaka kapağını kapatın, ışıktan korumak için alüminyum folyo ile sarın ve 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası renk gelişimine izin vermek için plağon folyosunu çıkarın.Başlangıçta berrak olan XTT çözeltisi, metabolik olarak aktif hücreler tarafından işlendikten sonra turuncuya dönecektir. Renkli süpernatantların 80 µL'sini yeni, düz tabanlı bir mikrotiter plakaya aktarın. Plakayı, burada gösterildiği gibi, 490 nm dalga boyuna ayarlanmış bir kolorimetrik mikrotiter plaka okuyucu ile okuyun. Antifungallerin yokluğunda, kolorimetrik okumalar işleme tabi tutulmamış gruptur.SEA başvuru sahiplerinin farklı sıralardaki biyofilmleri eşdeğerdir. Test edilen antifungal bileşiklerin etkisini değerlendirmek için öncelikle, 12. sütundaki negatif kontrol kuyucuklarından elde edilen ortalama arka plan değerini diğer tüm değerlerden çıkarın. Ardından, 11. sıradaki pozitif kontrolleri kullanarak yüzde inhibisyonu hesaplayın.Kolorimetrik okumalarda %50 veya %80'lik bir azalmanın tespit edildiği maksimum antifungal konsantrasyonlar, Cecil minimum inhibitör konsantrasyonları olarak bilinir. Bu değerler genellikle bir bileşiğin potansiyelinin referans ölçümü olarak kullanılır. Bu basit yüksek kapasiteli yöntem kullanılarak, fungal biyofilmler in vitro ortamda 24 saat içinde oluşturulabilir ve başlangıç geliştirmesinin ardından seçilen bileşikler antifungal aktivite açısından taranabilir.Bu teknik, tıbbi mikoloji alanındaki araştırmacıların biyofilm oluşumunu araştırmalarının ve antifungal ajanların aktivitesini incelemelerinin yolunu açmıştır. Ayrıca, biyofilmlerdeki hücreler.

a-96-well-microtiter-plate-based-method-for-monitoring-formation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Tahlil, bakteri ve mantar erken biyofilm oluşumunu ölçmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem mikrotiter plate mikrobiyal biyofilm oluşumu için alt tabaka olarak kullanır ve biyofilm kristal viyole suşu kullanılarak görüntülenmiştir. Tahlil ya erken biyofilm oluşumu için bir kalitatif veya kantitatif sağlar.

Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

Biz 3D nano-biyofilm oluşan yüksek yoğunluklu mikroarray platformu...

Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)

Bu video, bir et suyu mikrodilüsyon testi kullanarak antifungal bileşikleri taramak için bir in vitro testi göstermektedir. Test bileşikleri, bir mikrotitre plakasında seri olarak seyreltilir ve bir mantar aşısı ile inkübe edilir. İnkübasyon sonrası, plaka, test bileşiklerinin antifungal potansiyelini ve minimum inhibitör konsantrasyonlarını (MIC) değerlendirmek için görünür mantar büyümesi olmayan kuyucuklar için incelenir.

Antifungal Bileşiklerin Taranması için İn Vitro Et Suyu Mikrodilüsyon Testi

Bu video, antikorların mantar biyofilmleri üzerindeki etkisini incelemek için bir in vitro tekniği göstermektedir. Patojenik mantar Candida tropicalis, biyofilm oluşumunu kolaylaştıran aspartil proteinaz 2 (Sap2) salgılanan bir virülans faktörü salgılar. Biyofilm olgunlaşmasını inhibe eden Sap2'ye özgü antikorlar içeren ısıyla inaktive edilmiş bir serum eklendikten sonra, mantar hücrelerinin canlılığı bir kromojenik test kullanılarak değerlendirilir.

Antikorların Candida tropicalis Biyofilmi Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek İçin Bir İn Vitro Test

Bir fare deri altı modelinde Candida albicans biyofilm gelişiminin deneysel bir prosedürünü sunuyoruz. Mantar biyofilmleri, koloni oluşturan birimlerin sayısının belirlenmesi ve üretilen ışık miktarının canlı hücre sayısına karşılık geldiği invaziv olmayan bir biyolüminesans görüntüleme ile ölçüldü.

Biyoparlaklık Görüntüleme Ardından Fare Subkutan Modeli Tıbben-ilgili yabancı Organları Candida albicans Biyofilm Geliştirme

Bu protokol ana bilgisayar fizyolojik koşullar altında Candida albicans biyofilm oluşumu görselleştirmek için özelleştirilebilir otomatik mikrosıvısal aygıt kullanımını açıklar.

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Mantar önleyici bileşikler ve özleri süzmek için bir kolay ve uyarlanabilir suyu microdilution yöntem.

Suyu Microdilution Vitro tarama: yeni mantar önleyici bileşikler algılamak için kolay ve hızlı bir yöntem

Burada, mitokondrial solunum ve Candida Albicans glycolytic işlevinde araştırmak için kademeli bir protokol bir ilave akı çözümleyicisini kullanarak mevcut.

Candida albicans kullanarak gerçek zamanlı ekstraselüler akı analiz biyo-enerji incelenmesi

Candida albicans biyofilmlerinin iç özelliklerini görüntülemek ve ölçmek için, kırılma indisi eşleştirmesi ile açıklığa kavuşturulan sabit bozulmamış numuneler hazırlıyoruz. Daha sonra, optik kesit mikroskopisi biyofilmin tam kalınlığı na rağmen üç boyutlu görüntü verilerini elde etmek için kullanılabilir.

Aydınlatma ve Görüntüleme Candida albicans Biyofilmler

Bu protokol, peptitlerin ve küçük moleküllü antifungal ajanlar gibi diğer bileşiklerin Candida albicans'a karşı antifungal aktivitesi hakkında nicel veriler elde etmek için bir yöntemi açıklar. Büyüme inhibisyonunu ölçmek için koloni oluşturan birimleri saymak yerine optik yoğunluk kullanımı, zamandan ve kaynaklardan tasarruf sağlar.

Peptitlerin Candida albicans'a Karşı Antifungal Aktivitesinin Ölçülmesi

Antikorların C. tropicalis tarafından oluşturulan biyofilmler üzerindeki etkilerini incelemek için 2,3-bis (2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil)-5-karboksanil-2H-tetrazolyum (XTT) indirgeme testi kullanan 96 kuyucuklu mikrotitrek plaka bazlı bir protokol burada açıklanmıştır. Bu in vitro protokol, potansiyel yeni antifungal bileşiklerin biyofilmlerdeki Candida türü hücrelerinin metabolik aktivitesi üzerindeki etkisini kontrol etmek için kullanılabilir.

Antikorların Candida tropicalis Biyofilmleri Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için Çözünür Tetrazolyum Bazlı İndirgeme Testi

Öğrenin, 96 kuyucuklu mikrotiter plakalar kullanarak Candida albicans biyofilmleri oluşturma ve antifungal duyarlılık testi yapma yöntemini. Bu teknik, metabolik aktivite ölçümü ile hızlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

İzleme Oluşumu ve Antifungal Duyarlılık Testi için 96 Şey microtiter Levha tabanlı Yöntemi Candida albicans Biyofilmler

Daha fazla video keşfet