Name: Solucan Lab An Introduction to: Kültürleme Worms Mutagenez (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Öğrenin Pristionchus pacificus solucanlarını kültürleme ve EMS ile TMP/UV mutagenez yöntemlerini uygulama. Bu teknikler gen fonksiyonlarını belirlemek için mutant taraması yaparak genetik araştırmalarda kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, NSF hibe İOK # 0615996 tarafından finanse edilmektedir.

Bölüm 1: nematod büyüme ortamının hazırlanması (NGM) Petri kapları C. elegans ve P. Deneysel nematod pacificus genellikle nematodu Büyüme Orta (NGM) 1 içeren 6 cm Petri kapları laboratuvarda kültür. Worms, 20 ° C'de tutulur, ama bir sıcaklık aralığında (4 ila ° C - 25 ° C) inkübe nematod türleri ve deneysel tasarım bağlı. NGM ile plakaları hazırlamak için, standart, steril teknikleri, mantar ve bakteri bulaşmasını önlemek için kullanılması gerekmektedir. NGM plakaları hazırlamak için protokol: <ol><li> 15 g agar, 2.4 g NaCl, 2 g Tripton, 2.72 g KH 2 PO 4, 2 L erlene, su, otoklav ile 1 litre hacim makyaj ve 60 ° C su banyosunda soğutmak için izin tartılır . </li><li> 0.8 ml 1 M CaCl 2, kolesterol (5 mg / ml etanol), ve 1 M MgSO 4. Fungal ve bakteriyel kirlenme, 1 ml streptomisin (100 mg / ml) ve 1ml nistatin (10 mg / ml) önlemek için her bir litre orta eklenebilir. </li><li> Unispense makine kullanma ve steril koşullarda muhafaza medya istenilen plakalar içine dökün. Plakalar yaklaşık 2 / 3 üncü tam dolu olmalıdır. Standart bir 60 mm çapında plaka medya yaklaşık 10 ml gerektirir. Agar tamamen gelified kadar plakaları hareket etmeyin, aksi halde zor stereomikroskopta solucanlar odak agar pürüzlü bir yüzey olacaktır. </li><li> Kuruduktan sonra plakalar hemen 4 numaralı seribaşı veya saklanabilir ° C bakteri ekim kadar. </li></ol> Bölüm 2: OP50 bakteri hazırlanması ve ekim NGM Petri kapları P. pacificus E.coli OP50 gerginlik beslenen laboratuvar ortamında kültüre. OP50 böylece solucanlar 1 görselleştirme kolaylaştıran ince bir çim oluşturan NGM plakalar üzerinde sınırlı bir büyüme vardır. OP50 bir kültür büyümek için, LB-suyu kullanın: <ol><li> 500 ml vidalı kapaklı şişe, 500 ml distile su ve otoklav ile ses makyaj 5 g bactotryptone, 2.5 g maya özü ve 2.5 g NaCl ekleyin. </li><li> Suyu, steril koşullar altında kültür plakasına OP50 tek bir koloni aşılamak ve bu 37 geceleme büyümesine izin ° C </li><li> LB-OP50 kullanılmaya hazır ve kısırlık muhafaza ise 4 ° C'de birkaç ay saklanabilir. Plakalar numaralı seribaşı gerektiğinde, küçük bir steril beher içine küçük bir miktar suyu dökün ve bu stok kültür kirlenmesini önlemeye yardımcı olacaktır. </li><li> Tohum plakaları, 60 mm çap NGM Petri plaka ve yaymak için girdap üzerine OP50 100-120 ul dağıtmak. </li><li> Büyümek için çim için oda sıcaklığında bir gecede bu numaralı seribaşı plakaları inkübe edin. Bu seribaşı plakalar, 3 hafta kadar 4 ° C'de saklanabilir. Ters bir pozisyonda saklanması hızlı kurumasını önlemek yardımcı olur. </li></ol> Bölüm 3: bir seçim yapma Bu bölümde, solucanlar için bir seçim yapmak nasıl açıklar. Almak, solucanlar, tek bir konumdan diğerine aktarmak için kullanılır. Bazı araştırmacılar biraz değişik metal bileşimleri tercih olsa pick 30 göstergesi% 10% 90 platin iridyum tel yapılır: <ol><li> Tel 3-4 cm Kes, Pasteur pipeti (ucu küçük bir uzunluğu kırıldı) ucu ve daha sonra içine 0,5 cm Bunsen beki üzerinden bardağa mühür. Camdan çıkıntılı tel uzunluğu yaklaşık 3-3.5 cm, ancak bireysel tercihlerine göre değişebilir. </li><li> Sonunda, bir çekiç ve pense kullanarak çıkıntılı tel düzleştirin. Sonra bir kepçe formu basık kısmını yukarı doğru bükün. </li><li> Solucan veya agar zarar görmesini engellemek için zımpara kağıdı ile pick keskin kenarları yumuşatmaya. </li></ol> Bölüm 4: Toplama solucanlar <ol><li> , Solucanlar almak bir alev platin tel sterilize ve delinme veya hasar agar yüzeyi bakım alarak, ceket ucu kalın yapışkan bakteri bakteriyel çim boyunca almak basık ucu sürükleyin. </li><li> Stereomikroskopta kullanarak, çok solucan alma bakteri sopalarla kadar alınır solucan / solucanlara karşı yapışkan ucu hafifçe fırçalayın. </li><li> Alma ucundaki solucan sonra, bakteriyel çim karşı yeni plaka almak ucu dokunmadan veya sürgülü hemen yeni plaka transfer ve solucan tarama olmalıdır. Bakım başka solucanlar zor onları almak için deliklere tarama plaka üzerinde agar yüzeyine zarar vermemek için alınmalıdır. Solucan, çok uzun süre pick kalırsa, birbirinden ayrılacak. </li></ol> Bölüm 5: EMS mutagenez Etil metan sülfonat (EMS) 2 genom mutasyonları geniş bir yelpazede neden olur. Mutantlar, yumurtlama, kas defekti gibi kusurları tespit edilebilirlar, cinsiyet tayini, Dauer oluşumu, davranış ve gonad oluşumu. EMS mutagenez için protokol C için açıklanan benzer elegans 1. <ol><li> 1N NaOH 500 ml (veya daha fazla) hazırlayın. </li><li> , Solucanlar tam 6 cm çapında Petri kapları 4-5 atın üçüncü larva jüvenil (J3) aşamada birkaç yüz solucanları içeren ve 2-3 ml steril M9 plaka başına kullanarak kapalı solucanlar yıkayın. </li><li> Steril, tek kullanımlık 15 ml santrifüj tüpüne tüm solucanları toplayın. Solucanlar yayılmak için bir pelet oluşana kadar 5-7 dakika veya 1500 xg'de santrifüjleyin. </li><li> Sıvı aspire ve M9 2 ml yeniden askıya solucanlar kullanabilirsiniz. M9 2 ml içeren bir tüp 20 ul EMS ekleyin ve bunu çözmek için sallayın. Sonra hafifçe solucan süspansiyon ve türbülans 2ml EMS çözüm ekleyin. EMS son konsantrasyonu 47 mM olacak. Dikkat: EMS çok kuvvetli mutajen ve davlumbaz ele alınmalıdır. Bu mutajen ile temas eden tüm malzemeler (eldiven, pipetler, ipuçları) EMS inaktif 1N NaOH ile tedavi edilmelidir. Tüm EMS mutagenez prosedürü sırasında çift eldiven giyin. Kurumun kurallarına göre tehlikeli atık bertaraf edin. </li><li> Santrifüj tüpüne yerleştirin ve parafilm kapağı kapak; davlumbaz yatay olarak yerleştirin ve 3,5 saat süreyle inkübe solucanlar izin. Tüp da düşük bir hızda rocker yerleştirilebilir. </li><li> Tüp parafilm kapağı açın ve kapağı, solucanlar lavaboya kadar dikey konumu ve inkübe yer. </li><li> Süpernatantı aspire ve 1N NaOH içeren bir beher / balona atın. Bu EMS inaktive. </li><li> 5 ml M9 solucanlar, solucanlar bir pelet oluşana kadar 5-7 dakika veya 1500 xg'de solucanlar, santrifüj yıkamak için tüp 25-30 kez ters çevirin. Süpernatantı aspire ve 1N NaOH beher içine atın. </li><li> Çamaşır adım en az 3 kez tekrarlayın. </li><li> M9 az miktarda (~ 500 ul) pelet solucan son yıkamadan sonra, yeniden askıya alma ve OP50 bakteriler içeren bir çim NGM plakalar üzerine pipetle. Bu noktada artık kimyasal kaputu çalışmak gerekiyor. </li><li> Sıvı birkaç dakika kurumasını bekleyin ve sonra taze numaralı seribaşı plakaları almak ve sağlıklı görünen J4 larva transferi. Orijinal plaka kurumun tehlikeli atık kurallarına göre atın. </li><li> Mutagenized solucanlar kendi kendini döller. Bir stereomikroskopta kullanarak, ilgi resesif mutantlar için F2 nesil fenotipleri ekran. </li></ol> Bölüm 6: Psoralen mutagenez Bu bölümde, uzun dalga boyu ultraviyole (UV) ile birlikte TMP kullanarak mutagenez için prosedürü açıklar. Mutagenez TMP / UV yöntemi yaygın bir genom 3 içinde silinmesi mutasyonlar ikna etmek için kullanılır. <ol><li> Önceki yordamda açıklandığı gibi 15 ml santrifüj tüp içine 4-5, 6 cm çapında Petri kapları solucanları toplayın. </li><li> 5 dakika için 1500 xg'de 20 kez ters solucanlar, ve santrifüj yıkamak için, 10 ml M9 ekleyin. Süpernatantı atın ve bir toplam 3 kez yıkama tekrarlayın. Sıvı aspire ve M9 kendi hacmi 30 mcg / ml TMP içeren yaklaşık 10 kez solucanlar yeniden askıya. Pipet 20 M9 2 ml içine TMP ul (3 mg / ml). EMS gibi, TMP güçlü bir kanserojen ve uygun güvenlik önlemleri alarak ele alınması gerekir. UV ışık uygun göz giyer potansiyel risk önlemek için kullanılmalıdır. Tek uygun biyolojik tehlike torbalara atılmalıdır. </li><li> Tüp düşük devirli bir rocker (40 UPM), oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin. Dikey kapalı tüp solucanlar lavabo izin vermek için 10 dakika olarak ayarlayın. </li><li> Pasteur pipeti ile tüp altındaki solucanlar çıkarın ve seri başı olmayan bir NGM plaka üzerine aktarabilirsiniz. Kurumunuzun tehlikeli kimyasal yönergeleri izleyerek süpernatantı atın. </li><li> Aşırı TMP plaka emilir kadar karanlıkta plaka tutun. </li><li> UV yoğunluk ölçer kullanarak, 500 μW / cm 2 4 plaka üzerinde yoğunluk olduğunu, uzun dalga UV kaynağı ve plaka arasındaki mesafeyi ayarlamak . Alüminyum kapak ve kapak çıkarın ve 50 saniye için uzun dalga UV radyasyonu TMP tedavi solucanları içeren plaka kapak ve maruz. </li><li> Kapak ve oda sıcaklığında 5 saat süreyle karanlıkta solucanlar terk. </li><li> Alış ve taze numaralı seribaşı plakaları sağlıklı görünen J4 larva transferi. Kurumun tehlikeli kimyasal yönergeleri izleyerek orijinal plaka atın. </li><li> Bir stereomikroskopta kullanarak, ilgi mutasyon için F2 nesil fenotipleri ekran. </li></ol> Bölüm 7: Temsilci Sonuçlar Bazı P. mutagenez (ya EMS veya TMP / UV) kaynaklanan pacificus mutant fenotipleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Her mutant vahşi tip hayvan kolayca ayırt karakteristik bir fenotip vardır. Solucanlarmutajen, ebeveyn nesil (P0) 30 J3/J4 larvaları ayrı tabak yerleştirilir ve F1 nesil yumurta bırakmak için izin verildi ile tedavi edildi. Sağlıklı F1 döl gösterdi plakaları, toplam 1000 F1s ayrı ayrı kalıplara transfer edildi ve F2 döl fenotipleri gösterildi. Dumpy 5,6, ankoordine 6 ve Trafo 7 fenotipleri Hayvanlar bulundu. <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Pristionchus pacificus yabani tip ve mutant hayvanlar. A. wt hermafrodit B. wt erkek C. dpy mutant D. unc mutant E. tra mutant. Top iki panel vahşi tip hermafrodit (solda) ve erkek (sağ) Hayvanların gösteren kalan paneller farklı mutantlar ile karşılaştırmak.

<ol><li>Brenner, S. Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li>
<li>Anderson, P. Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).</li>
<li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1381-1381 (1994).</li>
<li>Pires-daSilva, A. WormBook. , 1-1 (2005).</li>
<li>Kenning, C., Kipping, I., Sommer, R. J. Genesis. 40 (3), 176-176 (2004).</li>
<li>Sommer, R. J., Carta, L. K., Kim, S. Y. Fundamental and Applied Nematology. 19 (6), 511-511 (1996).</li>
<li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. Genes & development. 18 (10), 1198-1198 (2004).</li>
<li>Wei, A., Yuan, A., Fawcett, G. Nucleic acids research. 30 (20), 110-110 (2002).</li>
<li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-356 (2002).</li>
</ol>

Mutagenez çeşitli deneysel model organizmaların genetik çalışmalar için yaygın olarak istihdam edilen bir tekniktir. Mutagenez deneyler genellikle bir genin 2 işlevini tanımlamak için kullanılır. Pa sadece burada açıklanan mutagenez prosedürleri kullanılabilir pacificus değil, aynı zamanda C elegans ve ilgili diğer nematod türü. Burada iki yöntem, EMS ve TMP / UV mutagenez açıklar. EMS genom 3,8 boyunca nokta mutasyonları veya küçük delesyonla...

solucan lab an introduction to: kültürleme worms mutagenez

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

Ultraviyole ışığı ile birlikte (TMP / UV) etil metan sülfonat (EMS) ve 4, 5 &#39;, 8-Trimethylpsoralen: Bu protokol, laboratuvar ve nasıl iki alternatif yöntemler kullanarak onları mutagenize nematod korumak için prosedürler açıklanmaktadır. Nematodlar, çünkü kendinden gübreleme hermafroditlerde ve hayvan başına ahfadının yüzlerce üretebilir erkek oluşmaktadır basit vücut planı ve çiftleşme sistemi, genetik çalışmalar için güçlü bir biyolojik sistemler. Nematod, bakteri çim içeren agar plaklarına korunur ve kolay bir plakadan bir pick kullanarak başka bir transfer edilebilir. TMP / UV esas silmeler indükler EMS, nokta mutasyonları ve küçük delesyonlar ikna etmek için yaygın olarak kullanılan bir alkilleyici ajandır. Nematod kullanılan türlerin bağlı olarak, EMS ve TMP konsantrasyonları optimize edilmesi gerekecektir. Nematod Pristionchus pacificus resesif mutasyonlar izole etmek için, F2 nesil hayvanlar görsel fenotipleri için tarandı. Bu yöntemleri göstermek için, solucanlar mutagenized ve koordinasyonsuz (UNC), Dumpy (dpy) ve Trafo (Tra) mutantlar aradı.

Tarama fenotipik defekti olan mutantlar için, belirli bir biyolojik süreç fonksiyonu genleri tanımlamak için basit bir yöntem. Bu yazıda, kültür serbest yaşayan solucanlar (örneğin, nasıl tarif<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;) Laboratuvar ve iki farklı mutagenez yöntemleri, EMS ve TMP / UV göstermektedir.

Solucan Lab An Introduction to: Kültürleme Worms Mutagenez

Bu protokol, nematodların laboratuvar ortamında nasıl yaşatılacağına dair prosedürleri ve iki alternatif yöntem kullanılarak nasıl mutajeneze tabi tutulacaklarını açıklamaktadır: etil metan ...

Bu prosedürün genel amacı, ceno, hepatitis elegance ve prisca gibi nematodlarda mutantlar oluşturmak için yaygın olarak kullanılan iki farklı mutajenez protokolünü gerçekleştirmektir. Pacificus mutajenez, genlerin işlevini ortaya çıkarmak için güçlü bir araçtır. Bu işlem, öncelikle mutajenezin uygulanacağı, yetişkinlik öncesi son larval evredeki çok sayıda solucandan oluşan kültürlerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir.Bir sonraki adım, solucanları iki alternatif prosedür kullanarak mutajeneize etmektir: etil metan sülfonat uygulaması veya ultraviyole radyasyon ile birlikte SOX mutajenezi. Prosedürün üçüncü adımı, sağlıklı görünümlü solucanların, besin kaynağı olan bakterilerle yeni ekilmiş agar plaklarına aktarılmasıdır. Prosedürün son adımı ise, birinci, ikinci veya üçüncü nesilde hedeflenen mutant fenotiplerin taranmasıdır.Merhaba, ben Teksas Üniversitesi Arlington Biyoloji Bölümü'ndeki Dr. Andre Perez de Silva'nın laboratuvarından Jore. T-M-P-U-V ve EMS Mutajenez prosedürleri, gelişim sırasında önemli bir rol oynayan biyolojik süreçlerde hangi genlerin yer aldığı gibi genetik araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olmaktadır. Merhaba, benim adım Manish Phar; gösterilecek mutajenez yöntemleri Pristi Onca S Pacificus için olsa da, bu yöntemler nematod sea elegance gibi diğer deneysel modeller ve hatta zebrafish gibi omurgalılar için de yaygın olarak kullanılabilir.Hadi başlayalım. Solucanları bir konumdan diğerine aktarmak için kullandığımız iğne; 30 gauge, %90 platin ve %10 iridyum telden yapılmıştır. Bazı araştırmacılar iğne yapmak için biraz daha farklı metal bileşimlerini tercih edebilse de, iğneyi tutmak için bir pastör pipeti de kullanılır.Pastör pipetinin uzatılmış ucunu gerekli uzunlukta kırarak başlayın. Yaklaşık üç ila dört santimetre tel kesin ve bunun 0.5 santimetresini pastör pipetinin ucunun içine yerleştirin. Teli, bir bunsen beki üzerinde camın içine mühürleyin.Camdan dışarı çıkan telin uzunluğu yaklaşık üç ila üç buçuk santimetredir, ancak kişisel tercihlere göre değişiklik gösterebilir. Dışarı çıkan telin ucunu bir pense yardımıyla düzleştirin. Ardından, düzleştirilen kısmı yukarı doğru bükerek bir kepçe şekli oluşturun.Son olarak, solucana veya agara zarar vermeyi önlemek için pensin keskin kenarlarını zımpara kağıdı ile düzeltin. Solucanları toplamak için, pensin telini alev üzerinde sterilize edin ve ardından ucunu kalın, yapışkan bakterilerle kaplamak için düzleştirilmiş ucu bir NGMP ağaç plakasındaki bakteri kolonisi boyunca sürükleyin. Bir stereo mikroskop kullanarak, agar yüzeyini delmemeye veya zarar vermemeye çok dikkat edin.Solucan, mayla üzerindeki bakterilere yapışana kadar yapışkan ucu solucana sürün. Solucan maylanın ucuna geldiğinde, mayla ucunu yeni plakanın bakteri örtüsüne dokundurarak veya sürterek solucanı derhal yeni plakaya aktarın. Solucanların deliklere girip geri alınmasının zorlaşabileceği plakanın agar yüzeyine zarar vermemeye özen gösterilmelidir.Pick ucunu bakteriyel çime dokundurduğunuzda veya üzerinde kaydırdığınızda solucan pick üzerinden sürünerek çıkmalıdır. Solucan pick üzerinde çok uzun süre kalmamalıdır, aksi takdirde kuruyabilir. Üçüncü larva juvenil evresindeki prisca pacificus solucanlarının bulunduğu altı santimetre çapındaki dört ila beş Petri plağı üzerinde EMS mutajenezini göstereceğiz.Her plakadaki solucanları, plaka başına iki ila üç mililitre steril M9 kullanarak yıkayın. Birkaç yüz solucan bulunmalıdır. Solucanları steril tek kullanımlık 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın.Solucanlar bir pelet oluşturana kadar veya beş ila yedi dakika boyunca 1500 Gs'de santrifüjleyin. Sıvıyı aspire edin ve çift eldiven giyip çeker ocak altında çalışarak solucanları yeniden süspande etmek için iki mililitre M nine kullanın; iki mililitre M nine içeren bir tüpe 20 microliters EMS ekleyin ve çözünmesi için çalkalayın. Ardından bunu iki mililitre solucan süspansiyonuna ekleyin ve hafifçe dairesel hareketlerle karıştırın.EMS'nin final konsantrasyonu 47 millimolar olacaktır. Paraform içeren santrifüj tüpünü çeker ocak içindeki düşük hızlı bir sallayıcıya yerleştirin ve solucanları üç buçuk saat inkübe edin. Üç buçuk saatlik inkübasyonun sonunda, tüpü dikey konuma getirin ve solucanlar dibe çökene kadar inkübe edin; ardından üst fazı aspire edin ve süpernatanttaki EMS'yi inaktive etmek için bir normal sodyum hidroksit içeren bir behere boşaltın.Ellerinizi çeker tüpünden her çıkardığınızda, ellerinizi bir normal sodyum hidroksit ile duruladığınızdan emin olun. EMS'yi inaktive etmek için solucanlara beş mililitre M dokuz ekleyin. Solucanları yıkamak için tüpü 25 ila 30 kez ters çevirin ve 1500 Gs'de beş ila yedi dakika veya santrifüj sonrası solucanlar pelet oluşturana kadar santrifüjleyin; ardından süpernatantı aspire edin ve bir normal sodyum hidroksit beherine boşaltın.M9 ekleme ve santrifüjleme ile ardından üst fazın uzaklaştırılmasını içeren bu yıkama adımını en az üç kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, solucan peletini minimum miktarda M9 içinde yeniden süspande edin ve solucan süspansiyonunu OP50 bakteri çeperi içeren NGM plaklarına pipetleyin. Sıvının birkaç dakika kurumasına izin verdikten sonra, sağlıklı görünümlü J4 larvalarını seçerek taze ekilmiş plakalara aktarın.Mutajene maruz kalan solucanların yaklaşık sekiz ila 10 gün sonra kendi kendini döllemesini sağlayın, ardından F2 nesli fenotiplerini ilgilenilen mutasyonların aşırılığı açısından taramak için bir stereo mikroskop kullanın. Mutajenez için uygulanan bu prosedür, dört ila beş adet 6 cm çapındaki Petri kabından toplanıp 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarılan ppac pacificus solucanları üzerinde gösterilecektir. Solucan peletine 10 ml M9 ekleyin.Solucanları yıkamak için tüpü 20 kez altüst edin ve 1500 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjden sonra süpernatantı atın. Solucanların M nine ile yıkanmasını toplam üç kez tekrarlayın; son yıkamadan sonra sıvıyı aspire edin ve solucanları hacimlerinin yaklaşık 10 katı kadar M nine içerisinde yeniden süspanse edin.Ardından, 30 µg/mL final konsantrasyonu elde etmek için 3 mg/mL'lik stoktan 4,5,8-trimetil SOREIN veya TMP ekleyin. TMP ile tüpü oda sıcaklığında, düşük hızlı bir sarsıcı üzerinde, karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüm solucanların dibe çökmesi için tüpü 10 dakika boyunca dikey konumda bekletin; bu videoda tüp açık gösterilmiştir, ancak TMP çözeltisi ışığa maruz bırakılmamalıdır.Bu kimyasal ışığa duyarlı olduğu için, solucanları tüpün tabanından çıkarmak ve ekilmemiş bir NGM plakasına aktarmak için past pipet kullanın. Fazla TMP plaka tarafından emilene kadar plakayı karanlıkta tutun. TMP plaka tarafından emildikten sonra, solucanlara ultraviyole ışık uygulanabilir.TMP UV nörojenez prosedüründeki en kritik adımlardan biri, uzun dalga UV kaynağı ile plaka arasında doğru mesafenin sağlanmasıdır. Bu nedenle, plaka üzerine düşen UV ışığının doğru yoğunluğunu elde etmek için mesafeyi birkaç kez ayarlamamız gerekir. Yoğunluk, yoğunluk ölçer ile kaydedilmeli ve 500 µW/cm² olmalıdır.UV ışığının potansiyel riski nedeniyle bu adım sırasında uygun koruyucu gözlük kullanılmalıdır. Bir UV yoğunluk ölçer kullanarak, uzun dalga UV kaynağından 500 micro watts per centimeter squared yoğunluk sağlayacak mesafeyi belirleyin.Ardından, alüminyum folyoyu ve kapağı çıkarın ve TMP ile işlem görmüş solucanları içeren plakayı, plaka üzerindeki yoğunluk 500 µW/cm² olacak şekilde lambadan uygun bir mesafeye yerleştirin. Plakayı 50 saniye boyunca uzun dalga UV radyasyonuna maruz bırakın, ardından kapatın ve solucanları oda sıcaklığında beş saat boyunca karanlıkta bekletin. Beş saat sonra, sağlıklı görünümlü J4 larvalarını seçerek taze ekilmiş plakalara aktarın.Son olarak, bir stereo mikroskop kullanarak F1, F2 veya F3 nesillerini ilgilenilen fenotipler açısından tarayın. Burada, EMS veya TMPUV mutajenezi sonrası F2 neslinde tanımlanan bazı ppac pacificus mutant fenotipleri gösterilmiştir. Bu görüntülerdeki üstteki iki panel, yabanıl tip bir hermafrodit ve yabanıl tip bir erkeğe örnektir.Her mutanın, yabani tip hayvandan kolayca ayırt edilebilen karakteristik bir fenotipi vardır. Panel C, bir dumpy mutant örneğidir. Panel D koordinasyonsuz bir mutantı göstermektedir ve panel E ise bir transformer mutana aittir. Uzmanlaşıldığında, EMS mutajenezi dört buçuk saatte, TMP uuv mutajenezi ise uygun şekilde gerçekleştirilirse beş buçuk saatte tamamlanabilir.Bu zaman dilimi aynı zamanda inkübasyon süresini de kapsamaktadır. EMS ve TMP'nin son derece tehlikeli olduğunu unutmayın; bu maddelerle çalışırken laboratuvar önlüğü giymek, çift eldiven kullanmak, çeker ocak ve koruyucu gözlük kullanmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

an-introduction-to-worm-lab-from-culturing-worms-to-mutagenesis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Sıvı tabanlı kültür ve dağıtımı için bir...

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

Bu videoda, PCR taraması ile tek bir nematodun genetik bir belirteç için hızlı bir şekilde taranması için kullanılan bir teknik açıklanmaktadır. Örnek protokolde, CRISPR tabanlı genom düzenlemeyi tarıyoruz.

Tek Solucan PCR: Genomik DNA'yı Çıkarmak ve Çoğaltmak için Bir Yöntem

C. elegans genellikle katı agar plakaları üzerinde büyütülmüş ve sıvı kültürlerde E ile tohumlanır coli. Toksikolojik ve beslenme çalışmaları karıştırıcı bakteriyel yan ürünleri önlemek için, biz aşağı bir uygulama yelpazesi için solucanlar çok sayıda büyümeye ve senkronize etmek için, bir aksenik sıvı ortam, CeHR kullanılmaktadır.

Kültürleme Caenorhabditis elegans Mikroparçacık bombardımanı ile aksenik Sıvı Medya ve Transgenik Worms Yaratılış

Burada, mikrobiyal etkileşim çalışmaya çok yönlü ana model olarak Caenorhabditis elegans Yuvarlak solucanlar mevcut.

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

Worm-align/Worm_CP, Caenorhabditis elegans örneklerini düzeltmek ve hizalamak ve önceki eğitim adımlarına gerek kalmadan tüm solucan görüntü tabanlı tahlilleri yapmak için kullanılabilecek basit bir FIJI/CellProfiler iş akışıdır. Solucan hizalama/Worm_CP, canlı hayvanlarda ısı şokuna bağlı ekspresyonun veya sabit numunelerdeki lipid damlacıklarının ölçülebilirhale uyguladık.

Caenorhabditis elegans'tan Elde Edilen Floresan Görüntü Verilerinin Düzleştirilmesi ve Ölçülmesi Için Solucan Hizalama ve Worm_CP İki Açık Kaynak Boru Hattı

Genetik olarak çekilebilir nematod Caenorhabditis elegans, ilaç keşfi için basit ve ucuz bir model olarak kullanılabilir. Burada, RAS ve EGFR proteinlerinin aşağı akış sinyalini engelleyen antikanser terapötiklerini tanımlamak için bir protokol açıklanmıştır.

Caenorhabditis elegans kullanılarak EGFR ve RAS inhibitörlerinin tanımlanması

Bu protokol, dış bakterileri uzaklaştırmak için soğuk felç ve yüzey ağartmayı takiben bireysel bakteriyel olarak kolonize Caenorhabditis elegans'ın 96 kuyucuklu bir bozulmasını tanımlar. Elde edilen süspansiyon, çok sayıda bireysel solucanda bakteri yükünün doğru, orta verimli bir şekilde ölçülmesini sağlamak için agar plakaları üzerine kaplanmıştır.

Caenorhabditis elegans-Bakteriyel Etkileşimlerde Heterojenliği Ölçmek için Tek Solucanlı Verileri Kullanma

Kompost mikrokozmosları, Caenorhabditis elegans'ta mikrobiyom araştırmalarını kolaylaştırmak için doğada bulunan mikrobiyal çeşitliliği laboratuvara getirir. Burada, çevresel mikrobiyal çeşitlilik ile solucan bağırsak mikrobiyom bileşimi arasındaki ilişkileri keşfetmek için çevresel mikrobiyal çeşitliliği modüle etme yeteneğini gösteren deneylerle mikrokozmos deneyleri kurmak için protokoller verilmiştir.

Caenorhabditis elegans'ta Mikrobiyom Araştırmaları için Mikrobiyal Çeşitliliğe Sahip, Doğal Benzeri Ortamlar Olarak Kompost Mikrokozmoslar

Burada sunulan, mikrofabrikasyon çok kuyucuklu cihazlarda katı ortam üzerinde izole edilmiş bireysel nematodların kültürlenmesi için optimize edilmiş bir protokoldür. Bu yaklaşım, bireysel hayvanların, aktivite, vücut büyüklüğü ve şekli, hareket geometrisi ve hayatta kalma dahil olmak üzere yaşlanma ve sağlıkla ilgili çeşitli fenotipler için yaşamları boyunca izlenmesini sağlar.

Çok Kuyulu Cihazlarda Katı Ortamda İzole Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Kültürü ve İzlenmesi

Tüm plazmid Site directed mutagenesis özgün bir plazmid biraz farklı varyasyonlarını oluşturmak için basit bir yoludur. Burada temel yerine plazmid kullanarak standart reaktifleri tanıtmak için kolay ve maliyet etkin bir şekilde göstermektedir.

Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez

Öğrenin Pristionchus pacificus solucanlarını kültürleme ve EMS ile TMP/UV mutagenez yöntemlerini uygulama. Bu teknikler gen fonksiyonlarını belirlemek için mutant taraması yaparak genetik araştırmalarda kullanılır.

Solucan Lab An Introduction to: Kültürleme Worms Mutagenez

Daha fazla video keşfet