Name: İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Öğrenin HEK-293T hücrelerinde voltaj kapılı iyon kanallarının elektrofizyolojik kaydı için optimize edilmiş transfeksiyon stratejisi. Bu yöntem hücre adezyonu ve membran stabilitesini artırarak güvenilir kayıtlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Doğa Bilimleri ve JDS Discovery İşletim Grant tarafından desteklenen Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada, NSERC Alexander Graham Bell Kanada Yüksek Lisans Bursu (doktora) (A SENATORE) ve Kalp ve İnme Vakfı, Hibe # 6284 NA-In-Aid.

<ol><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+%28LCav3%29+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li>
<li>Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOgden%2C+D+%22Microelectrode+techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22">Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook</a>. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).</li>
<li>Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).</li>
<li>Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2%2B+current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2%2Bchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li>
</ol>

Açıklanan protokolleri ve çözümleri kullanarak tam hücreli akımları kaydetmek mümkün transfeksiyon başarılı oldu ve istenen gerilim-kapılı iyon kanalları ya da iyon kanal kompleksleri hücre zarının önemli miktarda mevcut olduğunu gösterir. Hücreleri olumlu transfekte (yani floresan yeşil) ama kaydedilebilir akımları, ek süre 28 ° C düzgün bir şekilde paketlenmiş ve hücre zarının içine eklenecek kanal protein için izin istenebilir yok edilmelidir. Uzun süreli inkübasyon 28 ° C, yama kelepçe kayıt daha zorlu hale hücreler...

<table border="1"><tr><td> Malzeme </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> pIRES2-EGFP plazmid </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> Circle cam lamelleri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-80 </td><td> Çemberleri No 1 - 0,13 0.17mm kalınlığında, Boyut: 12mm </td></tr><tr><td> Amplifikatör </td><td> Akson Aletleri </td><td> Axopatch 200B veya Multiclamp 700B </td><td></td></tr><tr><td> Veri Toplama Sistemi </td><td> Akson Aletleri </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Elektrofizyoloji Yazılım </td><td> Akson Aletleri </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet manipülatörler </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> MPC-385-2 </td><td></td></tr><tr><td> Epifloresans inverted mikroskop </td><td> Zeiss Kanada </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> Akson Aletleri </td><td> CV-7B </td><td></td></tr><tr><td> Headstage elektrot tutucu </td><td> Akson Aletleri </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Toprak elektrot Mikroelektrod tutucu </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrofizyoloji kılcal tüpler </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> BF-150-86-15 </td><td> Borosilikat cam filament, OD 1.5mm, OD 0.86mm, uzun 15cm </td></tr><tr><td> / Kahverengi Mikropipet Çektirme Flaming </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Mikropipet yangın parlatıcı </td><td> Narishige </td><td> Mikro Forge MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Mikro ilaç perfüzyon sistemi </td><td> Bilimsel AutoMate </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> İlaç perfüzyon sistemi </td><td> Bilimsel AutoMate </td><td> Teflon vanalar ile Valvelink8.2 </td><td></td></tr></table>

İfade ve hek-293t hücreler rekombinant gerilim gated İyon kanalları elektrofizyolojik kayıt için optimize edilmiş transfeksiyon strateji

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

In vitro ifade ve elektrofizyolojik kayıt kültürlü insan embriyonik böbrek hücrelerinde rekombinant gerilim-kapılı iyon kanalları (HEK-293T), her yerde bir araştırma stratejisi. Komşu hücreler ile temas nedeniyle karıştırıcı etkisi olmadan elektrofizyolojik kayıt için izin vermek için birbirleri ile temas halinde olmayan HEK-293T, böylece hücreleri yeterince düşük yoğunlukta cam lamelleri üzerine kaplama olmalıdır. Transfekte kanalları da gürültü seviyeleri üzerinde saptanabilir akımları tam hücreli yama kelepçe kayıt için plazma membran yüksek verimlilik ile ifade etmelidir. Heterolog iyon kanalları genellikle 28 ° C transfeksiyon sonra yeterli membran ifade elde etmek için uzun inkübasyon süreleri gerektirir, ancak bu sıcaklıkta hücre lamel yapışma ve membran stabilitesi kayıpları artmaktadır. Bu sorunu aşmak için, biz transfect ve plaka HEK-293T hücreleri için optimize edilmiş bir strateji geliştirdi. Bu yöntem hücrelerin nispeten yüksek confluency 28 transfekte ve inkübe olması gerekir ° C yeterli iyon kanalı protein ekspresyonu için izin değişen kuluçka dönemleri post-transfeksiyon. Transfekte hücreler daha sonra cam lamelleri üzerine kaplama ve 37 ° C lamelleri ve membran restabilization sert hücre eki için izin veren birkaç saat inkübe edilir. Hücreler, kısa bir süre kaplama sonra, ya da daha fazla inkübasyon için 28 ° C transfer edilebilir. Biz ilk inkübasyon 28 ° C, transfeksiyon sonra ancak kaplama önce, plazma zarı normalde iyi ifade edemez heterolog iyon kanalları etkin bir şekilde ifade etmek için anahtarı olduğunu bulabilirsiniz. Pozitif transfekte, kültürlü hücreler sadece upstream iç ribozom giriş yeri ve bir eGFP kodlama dizisi cDNA rekombinant iyon kanalı içeren bir bicistronic vektör (örneğin pIRES2-EGFP) ifade, ortak ifade eGFP veya eGFP ile tanımlanır. Tüm hücre yama kelepçe kayıt özel ekipman gerektirir, artı cilalı kayıt elektrotlar ve L şeklindeki zemin elektrotlar borosilikat cam işçiliği. Iyon kanallarının farmakoloji çalışmasında, ilaç dağıtım, doğrudan kayıt çanak içine ilaçlar micropipetting veya microperfusion kaydedilen hücreleri üzerinde kesintisiz akışı ilaç çözüm üretmeye ağırlık akış sistemleri kullanılarak elde edilebilir.

Yüksek verimli için güvenilir bir yöntem<em&gt; In vitro</em&gt; Ifade ve kültürlü insan embriyonik böbrek hücrelerinde rekombinant gerilim-kapılı iyon kanalları (HEK-293T) sonraki elektrofizyolojik kayıt.

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Kültürlenmiş insan embriyonik böbrek hücrelerinde (HEK-293T) rekombinant voltaj kapılı iyon kanallarının in vitro ekspresyonu ve elektrofizyolojik kaydı...

Elektrofizyoloji, kültüre edilmiş insan embriyonik böbrek hücrelerindeki rekombinant voltaj kapılı iyon kanallarının aktivitesini incelemek için yaygın olarak kullanılır. Başarılı bir kayıt için, hücrelerin kanalları tespit edilebilecek yeterli seviyelerde hücre membranında eksprese etmesi ve bireysel hücrelerin izole edilebilmesi için hücrelerin yeterince düşük bir hücre yoğunluğunda ekilmesi gerekir. Hücre kayıtlarının gerçekleştirilmesi, genellikle hücre adezyonunun ve membran stabilitesinin kaybolduğu, bu tür bir ekspresyon için gereken 28 °C'deki uzun inkübasyon süreleri nedeniyle sıklıkla engellenmektedir.Burada, bu sorunları ortadan kaldıran hücre kültürü ve transfeksiyon için optimize edilmiş bir yöntem gösterilmektedir. Hücreler orta düzeyde bir konfluensle transfekte edilir, ardından yeterli iyon kanalı ekspresyonu sağlanana kadar 28 °C'de inkübe edilir. Transfekte edilen hücreler daha sonra düşük yoğunlukta cam lameller üzerine ekilir ve hücre yapışmasını ve membran stabilizasyonunu sağlamak için birkaç saat boyunca 37 °C'de inkübe edilir.Uygun şekilde ekilen hücreler, ardından birlikte eksprese edilen EGFP ve tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) yöntemi ile tanımlanır. Kayıt gerçekleştirilebilir veya hücreler tekrar 28 °C'de inkübe edilebilir. Kanal yüzey ekspresyonunu daha da artırmak için L CAV one, L CAV two veya L cav three gibi voltaja bağımlı kalsiyum kanalları ile transfekte edilmiş hücrelerde yapılan kayıt deneylerinden elde edilen sonuçlar, kanalların hücreler tarafından başarıyla transfekte edildiğini ve eksprese edildiğini göstermektedir.Laboratuvarımızda sadece L CAV üç için temsili sonuçlar gösterilmiş olsa da, insan hücre hatlarında patch clamp kaydı için düşük ekspresyon gösteren iyon kanalı genlerinin ekspresyonunu artırmak amacıyla bir yöntem geliştirmiş bulunmaktayız. Mevcut geleneksel yaklaşımda, önce hücreler lameller üzerine yayılır ve iyon kanalı genlerini içeren plazmid cDNA'lar ile transfekte edilir; ardından elektrofizyolojik kayıt öncesinde yüksek verimli iyon kanalı ekspresyonu elde etmek için 28 °C'de birçok gün inkübe edilir. Yeni yaklaşımımız, kayıt öncesinde 28 °C'de gereken inkübasyon süresini önemli ölçüde azaltmaktadır.Şimdi, 28 °C'lik inkübasyon süresini azaltarak, hücre membranlarının çok daha stabil olduğunu ve transfekte edilen hücrelerin lamellere çok daha iyi tutunduğunu görmekteyiz. Bu durum, kaydedilebilir hücre sayısını artırarak deney sürecini önemli ölçüde daha verimli hale getirir. Transfeksiyondan önce, tam konfluente ulaşmış bir HEK 2 9 3 T hücresi flaskını bir e dört oranında yeni bir 25 cm²'lik flaska bölün ve hücreleri 37 °C, %5 CO2 içeren bir inkübatöre yerleştirin.Hücrelerin üç ila dört saat boyunca tutunmasını sağlayın; dört saat sonra, tutunmayı doğrulamak için hücreleri diferansiyel girişim kontrastı ile inceleyin. Hücrelerin artık yuvarlak görünmediğini ve yassılaştığını gözlemleyin. Uzantılar veya psödopodlar görünür durumdadır.Konfluens seviyesi daha düşük olan hücreler benzer görünecek ancak birbirlerinden daha uzak konumlanacaklardır. Hücreler yapıştıktan sonra, standart bir kalsiyum fosfat transfeksiyonu gerçekleştirmek için gerekli reaktifleri birleştirin. Her flask için transfeksiyon solüsyonunun 600 microliters hacminde toplam 12 micrograms DNA hazırlayın.Burada, çeşitli iyon kanallarından elde edilen cDNA'lar P-I-R-E-S iki EGFP plazmidine klonlanmıştır. Bu ekspresyon vektörünün bir memeli hücre hattına transfeksiyonu, iyon kanalı kodlama dizisinin hemen aşağısında ve EGFP kodlama dizisinin yukarısında yer alan bir iç ribozom giriş bölgesinden başlayan translasyon aracılığıyla, klonlanan ekleme ile aynı mRNA'dan geliştirilmiş yeşil floresan protein üretimi ile sonuçlanır. Bu durum, EGFP proteininin ilgi duyulan proteine doğrudan füzyon edilmesinin neden olabileceği protein fonksiyonu üzerindeki olası girişimler olmadan, pozitif olarak transfekte edilmiş hücrelerin tanımlanmasına olanak tanır.Transfeksiyon solüsyonunu hücrelerin üzerine damla damla pipetleyin, ardından flaskı nazikçe çalkalayın ve ertesi güne kadar gece boyunca 37 degrees Celsius inkübatöre yerleştirin. Hücreleri floresan mikroskobu altında inceleyerek transfeksiyon verimliliğini kontrol edin. Pozitif transfekte olmuş hücreler, hücrenin tamamında yeşil görünmelidir.Transfeksiyon doğrulandıktan sonra, ters çevrilmiş flaskın içine dikkatlice dört ila beş mililitre ılık besiyeri pipetleyin. Flaskı yavaşça, hücre yüzeyi aşağıya gelecek şekilde ters çevirip sallayarak yıkama solüsyonunun hücrelerin üzerinde nazikçe hareket etmesini sağlayın ve böylece hücreleri yıkayın. Besiyerini uzaklaştırın ve bu yıkama işlemini tekrarlayın.İki kez daha adımyla. Ardından balona altı mililitre besiyeri ekleyin ve 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Omurgasız iyon kanallarının ekspresyonu bazı zorluklar teşkil etmektedir.İlk olarak, genellikle büyük boyutlardadırlar ve bu nedenle endoplazmik retikulumda translasyonları uzun sürebilir. Ayrıca, bir memeli hücre hattında hücre membranına verimli bir şekilde yönlendirilemeyebilirler. Son olarak, farklı türler farklı kodon kullanım frekansları sergilediğinden, heterolog cDNA'lar, bu zorlukların bazılarını aşmak için HEK 2 9 3 T gibi memeli hücrelerinde yaygın olmayan kodonların yüksek frekanslarını barındırabilir.Yıkama ve transfeksiyondan sonra 37 °C'de yapılan iki saatlik inkübasyonun ardından, ekspresyon süresini uzatmak için flaskları iki ila altı gün boyunca 28 °C'lik bir inkübatöre aktarın. İnkübasyon süresi, eksprese edilen her iyon kanalı tipi için ampirik olarak belirlenmelidir. Çünkü 28 °C'de uzun süreli inkübasyon, hücrelerin ayrılmasına ve zayıf membran stabilitesine yol açar.Elektrofizyolojik çalışmalar gerçekleştirilmeden önce ek hücre hazırlığı gereklidir. İlk olarak, transfekte edilmiş hücrelerdeki besiyerini aspirasyon pipeti ile uzaklaştırın ve ters çevrilmiş bir flask içine 37 °C sıcaklıkta bir mililitre tripsin çözeltisi ekleyin. Ardından, tripsinin hücrelerin üzerinden nazikçe geçmesini sağlamak için flaskı yavaşça hücre yüzeyi aşağıya gelecek şekilde geri getirin.Balonu tekrar ters çevirin ve tripsini uzaklaştırın. Ardından, hücrelerin üzerine doğrudan 250 µL sıcak tripsin ekleyin ve hücreler ayrılana kadar 37 °C'de üç ila beş dakika inkübe edin. Bu sırada, üç ila sekiz adet poli-L-lizin kaplı lameli 60 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin ve beş mL sıcak kültür ortamı ekleyin.Hücreler ayrıldıktan sonra, yaklaşık altı kez pipetleme yaparak onları dört mililitre ılık besiyerinde süspande edin; ardından, mikropipet ucuyla lamellerin kabın tabanında olduğundan emin olmak için üzerlerine hafifçe bastırın. Daha sonra, resüspande edilmiş hücrelerden 250 ila 500 µL ekleyin. Hücrelerin lamellere yapışmasını sağlamak için 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin.Hücrelerin 37 derecede çok uzun süre bırakılması, hücre bölünmesine ve transfekte edilen plazmitlerin seyrelmesine neden olacaktır. Transfekte edilen hücreler, burada gösterildiği gibi birbirlerinden izole olacak kadar düşük bir yoğunlukta ekilmelidir. Bu durum, elektrofizyolojik kayıt işlemini kolaylaştıracaktır.Yardımcı alt birimler gerektiren hücreler için, elektrofizyolojik kayıt öncesinde hücrelerin genellikle 28 °C'ye transfer edilmesi ve ek olarak üç ila dört gün boyunca inkübe edilmesi gerekir. Yardımcı alt birim gerektirmeyen hücreler için ise kayıt, bu inkübasyonun hemen ardından gerçekleştirilebilir.Burada kullanılan elektrofizyoloji düzeneği; bir amplifikatör, motorlu çift pipet manipülatörleri, epi-floresan mikroskop ve perfüzyon sistemlerini içermektedir. Ekipman, bir titreşim izolasyon masası üzerine monte edilmiştir ve dış elektriksel gürültü, 40 inç yüksekliğinde tip iki Faraday kafesi ile sınırlandırılmıştır. Elektronik kontrol sistemleri, Digidata 1440 ve P clamp 10.1 yazılımı ile birlikte çalışan bir analog-dijital dönüştürücü arayüzüne sahip bir PC'yi kapsamaktadır.Bilgisayar monitörü amplifikatörü, motorlu manipülatör ve bir valf bağlantılı perfüzyon kontrol sistemi Faraday kafesinin dışına monte edilmiştir. Serbest duran 19 inçlik metal elektrik rafı üzerinde, tüm elektrikli ekipmanlar bakır bir dağıtıcıya topraklanmış ve hat yalıtımı, tutarlı bir toprak hattı ve dalgalanma bastırma sağlayan tıbbi sınıf bir izolasyon trafosuna bağlanmıştır. Kafa aşamasındaki mikro pipet tutucuya, iki ila beş mega ohm dirence sahip, ateşle cilalanmış mikro pipetleri monte ederek deneylere hazırlık yapın.Patch pipetler iç solüsyonla doldurulur, hava kabarcıklarını gidermek için hafifçe vurulur ve son olarak kafa ünitesine monte edilir. Ardından, pens kullanarak üzerinde hücrelerin bulunduğu bir lamelliği, oda sıcaklığında 3 mL dış kayıt solüsyonu içeren 35 mm'lik plastik bir Petri kabına aktarın. Mikropipet ile kaba bilinen miktarlarda ilaç eklendiği ilaç deneyleri gerçekleştirilirken, kayıt solüsyonunun hacmi doğru şekilde ölçülmelidir; ardından kabı mikroskop tablasına yerleştirin.Ardından, bir mikro elektrot tutucu yarım hücreyi üç molar sezyum klorür ile doldurun. Daha sonra referans elektrodu yarım hücreye yerleştirin ve mikro manipülatörü kullanarak toprak elektrodu banyoya yerleştirin, patch pipeti banyo çözeltisine indirin. Hücreleri floresan modunda görüntüleyin ve pozitif olarak transfekte edilmiş, aderent, izole bir yeşil hücreyi görüş alanının merkezine getirin.Banyo modundayken, patch pipeti hücreye iyice yaklaştırın. Bilgisayar ekranında gözlemlenen kare dalga izini sıfırlayın. Patch pipetinin konumunu, hücreye tam olarak değecek ve ekrandaki kare akım izi dalgalanmaya başlayacak şekilde ayarlayın.Giga ohm sızdırmazlık sağlanana kadar bağlı bir şırınga ile hafif vakum uygulayın. Giga ohm sızdırmazlık elde edildiğinde, programı patch moduna geçirin. Hücre membranını delmek için şırınga ile hızlı bir vakum darbesi uygulayın.Ardından hücre moduna geçin ve amplifikatörde tüm hücre parametrelerini kullanın. Kapasitif geçici durumu kompanse etmek için, hücre içi kayıt çözeltisinin yamanmış hücreye diyaliz olması amacıyla yamanın dengelenmesi gerekir. Bu deney için yazılan voltaj klembi protokollerini buraya girin.Deney yapımcısı, hücre membranı boyunca voltaj modüle edildiğinde ortaya çıkan voltaj kapılı iyon kanallarındaki iyon akımlarını ölçmek için bir protokol tasarlamıştır. Bu durumda, yazılımın hücreyi -110 millivolt değerinde tutmasını ve ardından 250 milisaniye boyunca -70 millivolt değerine adım (step) yapmasını belirten bir IV protokolü incelenmektedir. Daha sonra her seferinde adım 10 millivolt artacak şekilde tekrar -110 millivolt tutma potansiyeline geri dönülür; böylece adımlar -70 millivolt, -60 millivolt şeklinde devam eder ve son adım +20 millivolt değerine kadar ulaşır.Kayıt altına alınan akımları, amplifikatör üzerindeki bir Alçak Geçiren Bessel filtresi kullanarak 10 kilohertz değerinde filtreleyin ve clamp X 10.1 yazılımını kullanarak iki kilohertz örnekleme frekansında dijitalleştirin; yalnızca %10'dan daha az olan minimum sızıntıya sahip kayıtları kullanın. Analiz için, HEK 2 93 T hücreleri kültüre edildi ve burada gösterildiği gibi L Cav. Üç kalsiyum kanalları ile transfekte edildi. Heterolog iyon kanalı CDNAlarının başarılı transfeksiyonu, P-I-R-E-S iki eeg FP vektöründen üretilen floresan ile belirlendi.Burada, bir omurgasız cav3 voltaj bağımlı kalsiyum kanalının başarılı ekspresyonunu gösteriyoruz. Hücreler transfekte edilmediğinde kalsiyum akımları oluşturulamazken; transfekte edilen hücrelere tüm hücre voltaj klemp protokolleri uygulandığında büyük akımlar meydana gelmektedir.Deneyciler, gereksinimlerine bağlı olarak çeşitli elektrofizyolojik koşullar ve veri analiz rejimleri kullanabilirler. Bu prosedürü uygularken, deneylerin zamanlaması konusunda kendi muhakemenizi kullanmanızı hatırlatmak önemlidir. Farklı kanallar hücre membranında farklı verimliliklerle eksprese olduğundan, hücrelerin canlılığını artırmak ve ilgilendiğiniz kanalların yüzey ekspresyonunu maksimize etmek için kullanılacak optimal stratejiyi belirlemek size kalmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, bir insan hücre hattının nasıl kültüre edileceği ve sürdürüleceğinin yanı sıra, elektrofizyolojik kayıtlar için heterolog iyon kanalı cDNA'larının ve alt birim cDNA'larının bu hücrelere nasıl transfekte edileceği konusunda iyi bir anlayış kazandığınızı umuyoruz.

optimized-transfection-strategy-for-expression-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz nasıl bir iyon kanalı fonksiyonu tek bir nokta mutasyonu etkisinin araştırılması gösterecektir.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Memeli sistemleri tarafından rekombinant proteinlerin ekspresyonu, yapısal biyoloji için protein kompleksleri üretmek için çekici bir yöntem haline geliyor. Burada, yapısal çalışmalar için protein komplekslerini saflaştırmak için süspansiyonda yetiştirilen memeli hücrelerini kullanan basit ama oldukça verimli bir ekspresyon sistemi sunuyoruz.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Genetik olarak kodlanmış voltaj göstergeleri kullanılarak zar potansiyelindeki değişiklikleri görüntülemek için bir yöntem açıklanmıştır.

Genetik Kodlanmış Floresan Gerilim Sensörleri İki Türleri ile Potansiyel görüntüleme Membran

Ökaryotik proteinlerin uygun translasyon sonrası modifikasyonla laboratuvar ölçeğinde üretimi önemli bir engel teşkil etmektedir. İşte bir memeli ekspresyon sistemi kullanarak protein ekspresyonu için hızlı kuruluş ve geri dönüşe sahip sağlam bir protokol. Bu sistem, seçici amino asidi, proteinlerin seçici etiketlenmesini ve glikan bileşiminin küçük molekül modülatörlerini destekler.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Onlar insanlar kullanmak için kabul edilebilir önce kardiyak rejeneratif tıp roman tedavi stratejileri kapsamlı ve detaylı çalışmalar büyük preklinik hayvan modellerinde gerektirir. Burada, biz perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü intramyocardial enjeksiyon tekniği Tavşanlarda, roman böyle tedavilerin etkinliğini test hipotez için değerli olan göstermek.

Perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü Intramyocardial enjeksiyon ve hücre teslim büyük preklinik modeli

Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanarak, H9 insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) shRNA'ların kararlı ekspresyonu için lentiviral parçacıklar ürettik ve geçici olarak dönüştürülmüş H9 türevi nöral progenitör hücreler (NPC'ler) yüksek verimlilikte.

Lentiviral Aracılı shRNA'ların Düşük Maliyetli Katyonik Polimer Polietilenimin (PEI) Kullanılarak hESC'lere ve NPC'lere Verilmesi

Uyarılabilir hücrelerin tepkilerini in vitro olarak incelemek için protokol, genetik olarak tasarlanmış tet-on spiking HEK hücrelerinin basit bir uyarılabilir hücre modelinde elektroporasyona bağlı aksiyon potansiyeli üretimindeki değişikliklerin yanı sıra ilgili parametrelerin otomatik olarak çıkarılması ile transmembran voltajındaki değişikliklerin optik olarak izlenmesini açıklar.

Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi

Öğrenin HEK-293T hücrelerinde voltaj kapılı iyon kanallarının elektrofizyolojik kaydı için optimize edilmiş transfeksiyon stratejisi. Bu yöntem hücre adezyonu ve membran stabilitesini artırarak güvenilir kayıtlar sağlar.

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji (Video) | JoVE Journal

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Daha fazla video keşfet