İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Elektrofizyoloji, kültürlenmiş insan embriyonik böbrek hücrelerinde rekombinant voltaj kapılı iyon kanallarının aktivitesini incelemek için yaygın olarak kullanılır. Başarılı bir kayıt, hücrelerin tespit için hücre zarında yeterli seviyelerde kanalları eksprese etmesini ve hücrelerin tek tek hücrelerin izolasyonu için yeterince düşük bir hücre yoğunluğunda kaplanmasını gerektirir. Hücre kayıtlarının gerçekleştirilmesi, tipik olarak hücre yapışması ve zar stabilitesi kaybının olduğu bu tür bir ifade için gerekli olan 28 santigrat derecedeki uzun inkübasyon süreleri nedeniyle sıklıkla engellenir.

Burada, bu sorunları ortadan kaldıran hücre kültürü ve transfeksiyon için optimize edilmiş bir yöntem gösterilmiştir. Hücreler orta derecede bir ko-akıcılıkta transfekte edilir, daha sonra yeterli iyon kanalı ekspresyonu elde edilene kadar 28 santigrat derecede inkübe edilir. Kopyalanan hücreler daha sonra düşük yoğunlukta cam örtü kızakları üzerine kaplanır ve hücre bağlanması ve zar stabilizasyonuna izin vermek için birkaç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edilir.

Uygun şekilde kaplandıktan sonra, hücreler daha sonra birlikte eksprese edilen EGFP ve tüm hücre yama kelepçesi ile tanımlanır. Kayıt yapılabilir veya hücreler bir kez daha 28 santigrat derecede inkübe edilebilir. Kanal yüzey ekspresyonunu daha da artırmak için, L CAV bir, L CAV iki veya L cav üç gibi voltaj kapılı kalsiyum kanalları ile transfekte edilmiş hücreler üzerinde yapılan deneylerden elde edilen sonuçlar, kanalların hücreler tarafından başarılı bir şekilde transfekte edildiğini ve eksprese edildiğini gösterir.

Laboratuvarımızda L CAV üç için sadece temsili sonuçlar gösterilmiş olsa da, insan hücre hatlarında yama kelepçe kaydı için zayıf eksprese eden iyon kanalı genlerinin ekspresyonunu arttırmak için bir yöntem geliştirdik. Şimdi konvansiyonel yaklaşım, önce hücreleri örtü fişleri üzerinde bölmek ve iyon kanalı genlerini içeren plazma CDNA'ları ile transfekte etmek ve daha sonra elektrofizyolojik kayıttan önce yüksek verimli iyon kanalı ekspresyonu elde etmek için 28 santigrat derecede günlerce inkübe etmektir. Yeni yaklaşımımız, kayıttan önce 28 santigrat derecede gerekli inkübasyon süresini büyük ölçüde azaltır.

Şimdi 28 derecelik inkübasyon süresini azaltarak, hücre zarlarının çok daha kararlı olduğunu ve transfekte edilmiş hücrelerin örtü kaymalarına çok daha fazla yapıştığını görüyoruz. Bu, kaydedilebilir hücre sayısını artırır ve denemeyi önemli ölçüde daha verimli hale getirir. Transfeksiyondan önce, HEK 2 9 3 T hücrelerinin tamamen birleşik bir şişesini, bir ila dört şişeyi 25 santimetre karelik yeni bir şişeye bölün ve hücreleri 37 santigrat derece% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.

Hücrelerin dört saat sonra üç ila dört saat boyunca bağlanmasına izin verin, eki doğrulamak için hücreleri diferansiyel girişim kontrastına göre inceleyin. Hücrelerin artık yuvarlak görünmediğini ve düzleştiğini unutmayın. Uzantılar veya psödopodia görülebilir.

Daha az birleşme hücresi aynı görünecek, ancak birbirinden daha fazla aralıklı olacaktır. Hücreler bağlandıktan sonra, standart bir kalsiyum fosfat transfeksiyonu gerçekleştirmek için gerekli reaktifleri birleştirin. Şişe başına 600 mikrolitre transfeksiyon çözeltisinde toplam 12 mikrogram DNA hazırlayın.

Burada, çeşitli iyon kanallarından gelen CDNA'lar, bu ekspresyon vektörünün bir memeli hücre hattına P-I-R-E-S iki EGFP plazmid Transfeksiyonuna klonlanır. İyon kanalı kaplama dizisinin hemen aşağısında ve EGFP kaplama dizisinin yukarı akışında bir iç ribozom giriş bölgesinde başlatılan translasyon yoluyla klonlanmış ek ile aynı mRNA'dan gelişmiş yeşil floresan proteininin üretilmesiyle sonuçlanır. Bu, pozitif olarak transfekte edilmiş hücrelerin, EGFP proteininin doğrudan ilgilenilen proteine kaynaştırılmasından kaynaklanabilecek protein fonksiyonunda olası bir girişim olmadan tanımlanmasına izin verir.

Transfeksiyon solüsyonunu hücrelerin üzerine damla damla pipetleyin, ardından şişeyi hafifçe döndürün ve ertesi gün gece boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Hücreleri floresan mikroskobu altında görüntüleyerek transfeksiyon verimliliğini kontrol edin. Pozitif olarak transfekte edilmiş hücreler, tüm hücre boyunca yeşil görünmelidir.

Transfeksiyon doğrulandıktan sonra, ters çevrilmiş şişeye dört ila beş mililitre ılık ortamı dikkatlice pipetleyin. Hücre yüzeyi aşağı bakacak şekilde şişeyi yavaşça ters çevirerek ve yıkama solüsyonu üzerlerinde nazikçe hareket edecek şekilde şişeyi sallayarak hücreleri yıkayın. Ortamı çıkarın ve bu yıkamayı tekrarlayın.

İki kez daha adım atın. Daha sonra şişeye altı mililitre orta ekleyin ve iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Omurgasız iyon kanallarının ekspresyonu bazı zorluklar sunar.

Birincisi, genellikle büyük boyuttadırlar ve bu nedenle endoplazmik retikulumda translasyonu uzun zaman alabilir. Ayrıca, bir memeli hücre hattındaki hücre zarına verimli bir şekilde hedeflenmeyebilirler. Son olarak, farklı türler farklı kodon kullanım frekansları sergilediğinden, heterolog CDNA'lar, bu zorlukların bazılarının üstesinden gelmek için HEK 2 9 3 T gibi memeli hücrelerinde nadir görülen yüksek kodon frekanslarını barındırabilir.

Transfect yıkandıktan sonra 37 santigrat derecede iki saatlik inkübasyonun ardından, ekspresyon süresini uzatmak için şişeleri iki ila altı gün boyunca 28 santigrat derece inkübatöre aktarın. Kuluçka süresi, ifade edilen her bir iyon kanalı türü için ampirik olarak belirlenmelidir. Uzun süre 28 santigrat derecede inkübasyon, hücre ayrılmasına ve zayıf zar stabilitesine yol açtığından.

Elektrofizyolojik çalışmalar yapılmadan önce daha fazla hücre hazırlığına ihtiyaç vardır. İlk olarak, bir mililitre 37 santigrat derece tripsin çözeltisini ters çevrilmiş bir şişeye aspirasyon pipeti ile ortamı transfekte edilmiş hücrelerden çıkarın. Ardından, tripsinin hücrelerin üzerinden nazikçe geçmesine izin vermek için şişeyi nazikçe hücre yüzeyi aşağı konuma getirin.

Şişeyi ters çevirin ve tripsini çıkarın. Daha sonra doğrudan hücrelerin üzerine 250 mikrolitre ılık tripsin ekleyin ve hücreler ayrılana kadar üç ila beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu arada, üç ila sekiz poli L lizin kaplı örtüyü 60 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin ve beş mililitre ılık kültür ortamı ekleyin.

Hücreler resüsleri ayrıldıktan sonra, mikro pipetin ucunu kullanarak yaklaşık altı kez yukarı ve aşağı pipetleyerek dört mililitre ılık ortamda askıya alın, tabağın dibinde olduklarından emin olmak için kapak fişlerini aşağı doğru bastırın. Daha sonra 250 ila 500 mikrolitre yeniden askıya alınmış hücre ekleyin. Hücreleri, örtü fişlerine yapışmalarını sağlamak için üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Hücreleri 37 derecede çok uzun süre bırakmak, hücre bölünmesine ve transfekte edilmiş plazmitlerin seyreltilmesine neden olacaktır. Kesilen hücreler, burada gösterildiği gibi birbirlerinden izole edilmeleri için yeterince düşük bir yoğunlukta kaplanmalıdır. Bu, elektrofizyolojik kaydı kolaylaştıracaktır.

Aksesuar alt birimleri gerektiren hücreler için, hücreleri genellikle 28 santigrat dereceye aktarmak ve elektrofizyolojik olmadan önce üç ila dört gün daha inkübe etmek gerekir. Kayıt, aksesuar alt birimleri gerektirmeyen hücreler için gerçekleştirilir. Bu inkübasyonun hemen ardından kayıt yapılabilir.

Burada kullanılan elektrofizyoloji teçhizatı bir amplifikatör, motorlu, çift pipetli manipülatörler ve epi floresan mikroskobu ve perfüzyon sistemleri içerir. Ekipman bir titreşim izolasyon masasına monte edilmiştir ve başıboştur. Elektriksel gürültü, 40 inç yüksekliğinde tip iki gelincik kafesi ile sınırlıdır P clamp 10.1 yazılımı ile birlikte analogdan dijitale dönüştürücü arayüzü olan 1440 rakam verisi ile donatılmış bir PC içeren elektronik kontrol sistemleri.

Bilgisayar monitörü amplifikatörü, motorlu manipülatör ve bir valf bağlantısı füzyon kontrol sisteminin tümü Faraday kafesinin dışına monte edilmiştir. Bağımsız 19 inçlik bir metal elektrik rafında, tüm elektrikli ekipman bir bakır dağıtıcıya topraklanır ve hat yalıtımı, tutarlı bir topraklama ve aşırı gerilim bastırma sağlayan tıbbi sınıf bir izolasyon transformatörüne takılır. İki ila beş mega ohm dirence sahip ateşle parlatılmış mikro pipetleri baş katındaki mikro pipet tutucuya monte ederek deneylere hazırlanın.

Yama pipetleri, hava kabarcıklarını gidermek için dahili solüsyon hareketi ile doldurulur ve son olarak kafa aşamasına monte edilir. Daha sonra, forseps kullanarak, kaplanmış hücrelere sahip bir kapak fişini, oda sıcaklığında üç mililitre harici kayıt çözeltisi içeren 35 milimetrelik plastik bir Petri kabına aktarın. Bilinen miktarlarda ilacın bir mikro pipet ile tabağa eklendiği ilaç deneyleri yapılırken kayıt solüsyonunun hacmi doğru bir şekilde ölçülmelidir, tabağı mikroskop tablasına yerleştirin.

Daha sonra bir mikro elektrot tutucu yarım hücreyi üç molar sezyum klorür ile doldurun. Daha sonra referans elektrodu yarım hücreye yerleştirin ve toprak elektrodunu mikrom manipülatörünü kullanarak banyoya yerleştirin, yama pipetini banyo solüsyonuna indirin. Hücreleri floresan modunda görselleştirin ve görüş alanının ortasında izole edilmiş, pozitif transfekte edilmiş yapışkan bir yeşil hücreyi ortalayın.

Banyo modundayken, yama pipetini hücrenin yakınına getirin. Bilgisayar ekranında gözlemlenen kare dalga izini sıfırlayın. Yama pipetinin konumunu, yalnızca hücreye dokunacak ve ekrandaki kare akım izi dalgalanmaya başlayacak şekilde ayarlayın.

Bir giga ohm conta oluşana kadar bağlı bir şırınga ile hafifçe emme uygulayın. Giga ohm'luk bir sızdırmazlık elde edildiğinde, programı yama moduna geçirin. Hücre zarını kırmak için şırınga ile hızlı bir emme darbesi uygulayın.

Ardından hücre moduna geçin ve amplifikatörde tüm hücre parametrelerini kullanın. Kapasitif geçici durumu telafi etmek için, hücre içi kayıt çözeltisinin yamalı hücreye diyalize girmesi için yamayı dengelemek gerekir. Bu deney için yazılmış gerilim kelepçesi protokollerini buraya giriniz.

Deneyci, hücre zarı boyunca voltaj modüle edildiğinde ortaya çıkan voltaj kapılı iyon kanalları aracılığıyla iyon akımlarını ölçmek için bir protokol tasarlamıştır. Bu durumda, yazılımın hücreyi eksi 110 milivoltta tuttuğunu ve ardından 250 milisaniye boyunca eksi 70 milivolta SEP yaptığını belirten bir IV protokolüne bakıyoruz. Ardından, adım her 10 milivolt arttığında eksi 110 milivolt tutma potansiyeline geri dönün, böylece adımlar eksi 70 milivolt, eksi 60 milivolt vb., son adım artı 20 milivolt olana kadar.

Amplifikatör üzerinde bir Lowpass Bessel filtresi kullanarak kaydedilen akımları 10 kilohertz'de filtreleyin ve clamp X 10.1 yazılımını kullanarak iki kilohertz'lik bir örnekleme frekansında sayısallaştırın, yalnızca %10'dan az minimum sızıntı olan kayıtları kullanınAnaliz için, HEK 2 93 T hücreleri kültürlendi ve L Cav ile transfekte edildi. Burada gösterildiği gibi üç kalsiyum kanalı. Heterolog iyon kanalı CDNA'larının başarılı transfeksiyonu, P-I-R-E-S iki eeg FP vektöründen üretilen floresan ile gösterildi.

Burada bir omurgasız cav üç voltajlı kalsiyum kanalının başarılı bir şekilde ekspresyonunu gösteriyoruz. Hücreler transfekte edilmediğinde, hiçbir kalsiyum akımı ortaya çıkarılamaz. Oysa transfekte edilmiş hücreler, hücrelere tüm hücre voltaj kelepçesi protokolleri uygulandığında büyük akımlar üretir.

Deneyciler, gereksinimlerine bağlı olarak çeşitli elektrofizyolojik koşulları ve veri analizi rejimlerini kullanabilirler. Bu prosedürü denerken, deneylerin zamanlaması ile ilgili kendi kararınızı kullanmayı unutmamak önemlidir. Hücre zarında farklı kanallar farklı verimliliklerle ifade edildiğinden, hücrelerin canlılığını artırmak ve ilgilendiğiniz kanalların yüzey ifadesini en üst düzeye çıkarmak için kullanılacak en uygun stratejiyi belirlemek size kalmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, bir insan hücre hattının nasıl kültürleneceği ve korunacağının yanı sıra heterolog iyon kanalı CDNA'larının ve alt birim CDNA'larının bu hücrelere nasıl transfekte edileceği konusunda iyi bir anlayış kazandığınızı umuyoruz. Elektrofizyolojik kayıt için.