Name: İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Öğrenin HEK-293T hücrelerinde voltaj kapılı iyon kanallarının elektrofizyolojik kaydı için optimize edilmiş transfeksiyon stratejisi. Bu yöntem hücre adezyonu ve membran stabilitesini artırarak güvenilir kayıtlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Doğa Bilimleri ve JDS Discovery İşletim Grant tarafından desteklenen Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada, NSERC Alexander Graham Bell Kanada Yüksek Lisans Bursu (doktora) (A SENATORE) ve Kalp ve İnme Vakfı, Hibe # 6284 NA-In-Aid.

<ol><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+%28LCav3%29+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li>
<li>Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOgden%2C+D+%22Microelectrode+techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22">Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook</a>. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).</li>
<li>Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).</li>
<li>Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2%2B+current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2%2Bchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li>
</ol>

Açıklanan protokolleri ve çözümleri kullanarak tam hücreli akımları kaydetmek mümkün transfeksiyon başarılı oldu ve istenen gerilim-kapılı iyon kanalları ya da iyon kanal kompleksleri hücre zarının önemli miktarda mevcut olduğunu gösterir. Hücreleri olumlu transfekte (yani floresan yeşil) ama kaydedilebilir akımları, ek süre 28 ° C düzgün bir şekilde paketlenmiş ve hücre zarının içine eklenecek kanal protein için izin istenebilir yok edilmelidir. Uzun süreli inkübasyon 28 ° C, yama kelepçe kayıt daha zorlu hale hücreler...

<table border="1"><tr><td> Malzeme </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> pIRES2-EGFP plazmid </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> Circle cam lamelleri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-80 </td><td> Çemberleri No 1 - 0,13 0.17mm kalınlığında, Boyut: 12mm </td></tr><tr><td> Amplifikatör </td><td> Akson Aletleri </td><td> Axopatch 200B veya Multiclamp 700B </td><td></td></tr><tr><td> Veri Toplama Sistemi </td><td> Akson Aletleri </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Elektrofizyoloji Yazılım </td><td> Akson Aletleri </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet manipülatörler </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> MPC-385-2 </td><td></td></tr><tr><td> Epifloresans inverted mikroskop </td><td> Zeiss Kanada </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> Akson Aletleri </td><td> CV-7B </td><td></td></tr><tr><td> Headstage elektrot tutucu </td><td> Akson Aletleri </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Toprak elektrot Mikroelektrod tutucu </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrofizyoloji kılcal tüpler </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> BF-150-86-15 </td><td> Borosilikat cam filament, OD 1.5mm, OD 0.86mm, uzun 15cm </td></tr><tr><td> / Kahverengi Mikropipet Çektirme Flaming </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Mikropipet yangın parlatıcı </td><td> Narishige </td><td> Mikro Forge MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Mikro ilaç perfüzyon sistemi </td><td> Bilimsel AutoMate </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> İlaç perfüzyon sistemi </td><td> Bilimsel AutoMate </td><td> Teflon vanalar ile Valvelink8.2 </td><td></td></tr></table>

İfade ve hek-293t hücreler rekombinant gerilim gated İyon kanalları elektrofizyolojik kayıt için optimize edilmiş transfeksiyon strateji

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

In vitro ifade ve elektrofizyolojik kayıt kültürlü insan embriyonik böbrek hücrelerinde rekombinant gerilim-kapılı iyon kanalları (HEK-293T), her yerde bir araştırma stratejisi. Komşu hücreler ile temas nedeniyle karıştırıcı etkisi olmadan elektrofizyolojik kayıt için izin vermek için birbirleri ile temas halinde olmayan HEK-293T, böylece hücreleri yeterince düşük yoğunlukta cam lamelleri üzerine kaplama olmalıdır. Transfekte kanalları da gürültü seviyeleri üzerinde saptanabilir akımları tam hücreli yama kelepçe kayıt için plazma membran yüksek verimlilik ile ifade etmelidir. Heterolog iyon kanalları genellikle 28 ° C transfeksiyon sonra yeterli membran ifade elde etmek için uzun inkübasyon süreleri gerektirir, ancak bu sıcaklıkta hücre lamel yapışma ve membran stabilitesi kayıpları artmaktadır. Bu sorunu aşmak için, biz transfect ve plaka HEK-293T hücreleri için optimize edilmiş bir strateji geliştirdi. Bu yöntem hücrelerin nispeten yüksek confluency 28 transfekte ve inkübe olması gerekir ° C yeterli iyon kanalı protein ekspresyonu için izin değişen kuluçka dönemleri post-transfeksiyon. Transfekte hücreler daha sonra cam lamelleri üzerine kaplama ve 37 ° C lamelleri ve membran restabilization sert hücre eki için izin veren birkaç saat inkübe edilir. Hücreler, kısa bir süre kaplama sonra, ya da daha fazla inkübasyon için 28 ° C transfer edilebilir. Biz ilk inkübasyon 28 ° C, transfeksiyon sonra ancak kaplama önce, plazma zarı normalde iyi ifade edemez heterolog iyon kanalları etkin bir şekilde ifade etmek için anahtarı olduğunu bulabilirsiniz. Pozitif transfekte, kültürlü hücreler sadece upstream iç ribozom giriş yeri ve bir eGFP kodlama dizisi cDNA rekombinant iyon kanalı içeren bir bicistronic vektör (örneğin pIRES2-EGFP) ifade, ortak ifade eGFP veya eGFP ile tanımlanır. Tüm hücre yama kelepçe kayıt özel ekipman gerektirir, artı cilalı kayıt elektrotlar ve L şeklindeki zemin elektrotlar borosilikat cam işçiliği. Iyon kanallarının farmakoloji çalışmasında, ilaç dağıtım, doğrudan kayıt çanak içine ilaçlar micropipetting veya microperfusion kaydedilen hücreleri üzerinde kesintisiz akışı ilaç çözüm üretmeye ağırlık akış sistemleri kullanılarak elde edilebilir.

Yüksek verimli için güvenilir bir yöntem<em&gt; In vitro</em&gt; Ifade ve kültürlü insan embriyonik böbrek hücrelerinde rekombinant gerilim-kapılı iyon kanalları (HEK-293T) sonraki elektrofizyolojik kayıt.

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Kültürlenmiş insan embriyonik böbrek hücrelerinde (HEK-293T) rekombinant voltaj kapılı iyon kanallarının in vitro ekspresyonu ve elektrofizyolojik kaydı...

Elektrofizyoloji, kültüre edilmiş insan embriyonik böbrek hücrelerindeki rekombinant voltaj kapılı iyon kanallarının aktivitesini incelemek için yaygın olarak kullanılır. Başarılı bir kayıt için, hücrelerin kanalları tespit edilebilecek yeterli seviyelerde hücre membranında eksprese etmesi ve bireysel hücrelerin izole edilebilmesi için hücrelerin yeterince düşük bir hücre yoğunluğunda ekilmesi gerekir. Hücre kayıtlarının gerçekleştirilmesi, genellikle hücre adezyonunun ve membran stabilitesinin kaybolduğu, bu tür bir ekspresyon için gereken 28 °C'deki uzun inkübasyon süreleri nedeniyle sıklıkla engellenmektedir.Burada, bu sorunları ortadan kaldıran hücre kültürü ve transfeksiyon için optimize edilmiş bir yöntem gösterilmektedir. Hücreler orta düzeyde bir konfluensle transfekte edilir, ardından yeterli iyon kanalı ekspresyonu sağlanana kadar 28 °C'de inkübe edilir. Transfekte edilen hücreler daha sonra düşük yoğunlukta cam lameller üzerine ekilir ve hücre yapışmasını ve membran stabilizasyonunu sağlamak için birkaç saat boyunca 37 °C'de inkübe edilir.Uygun şekilde ekilen hücreler, ardından birlikte eksprese edilen EGFP ve tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) yöntemi ile

optimized-transfection-strategy-for-expression-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz nasıl bir iyon kanalı fonksiyonu tek bir nokta mutasyonu etkisinin araştırılması gösterecektir.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Memeli sistemleri tarafından rekombinant proteinlerin ekspresyonu, yapısal biyoloji için protein kompleksleri üretmek için çekici bir yöntem haline geliyor. Burada, yapısal çalışmalar için protein komplekslerini saflaştırmak için süspansiyonda yetiştirilen memeli hücrelerini kullanan basit ama oldukça verimli bir ekspresyon sistemi sunuyoruz.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Genetik olarak kodlanmış voltaj göstergeleri kullanılarak zar potansiyelindeki değişiklikleri görüntülemek için bir yöntem açıklanmıştır.

Genetik Kodlanmış Floresan Gerilim Sensörleri İki Türleri ile Potansiyel görüntüleme Membran

Ökaryotik proteinlerin uygun translasyon sonrası modifikasyonla laboratuvar ölçeğinde üretimi önemli bir engel teşkil etmektedir. İşte bir memeli ekspresyon sistemi kullanarak protein ekspresyonu için hızlı kuruluş ve geri dönüşe sahip sağlam bir protokol. Bu sistem, seçici amino asidi, proteinlerin seçici etiketlenmesini ve glikan bileşiminin küçük molekül modülatörlerini destekler.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Onlar insanlar kullanmak için kabul edilebilir önce kardiyak rejeneratif tıp roman tedavi stratejileri kapsamlı ve detaylı çalışmalar büyük preklinik hayvan modellerinde gerektirir. Burada, biz perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü intramyocardial enjeksiyon tekniği Tavşanlarda, roman böyle tedavilerin etkinliğini test hipotez için değerli olan göstermek.

Perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü Intramyocardial enjeksiyon ve hücre teslim büyük preklinik modeli

Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanarak, H9 insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) shRNA'ların kararlı ekspresyonu için lentiviral parçacıklar ürettik ve geçici olarak dönüştürülmüş H9 türevi nöral progenitör hücreler (NPC'ler) yüksek verimlilikte.

Lentiviral Aracılı shRNA'ların Düşük Maliyetli Katyonik Polimer Polietilenimin (PEI) Kullanılarak hESC'lere ve NPC'lere Verilmesi

Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV), klinik ve preklinik gen iletimi için yaygın olarak kullanılmaktadır. rAAV'ler için yeterince takdir edilmeyen bir kullanım, kültürlenmiş hücrelerin saflaştırmaya gerek kalmadan sağlam bir şekilde aktarılmasıdır. rAAV'ye yeni başlayan araştırmacılar için, transgen kaset klonlama, ham vektör üretimi ve hücre kültürü transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

Saflaştırılmamış Rekombinant Adeno İlişkili Viral Vektörler Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Transgen Ekspresyonu

Uyarılabilir hücrelerin tepkilerini in vitro olarak incelemek için protokol, genetik olarak tasarlanmış tet-on spiking HEK hücrelerinin basit bir uyarılabilir hücre modelinde elektroporasyona bağlı aksiyon potansiyeli üretimindeki değişikliklerin yanı sıra ilgili parametrelerin otomatik olarak çıkarılması ile transmembran voltajındaki değişikliklerin optik olarak izlenmesini açıklar.

Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi

Öğrenin HEK-293T hücrelerinde voltaj kapılı iyon kanallarının elektrofizyolojik kaydı için optimize edilmiş transfeksiyon stratejisi. Bu yöntem hücre adezyonu ve membran stabilitesini artırarak güvenilir kayıtlar sağlar.

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji (Video) | JoVE Journal

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Daha fazla video keşfet