Lökotrien B Gerçek zamanlı görüntüleme ₄ Hücre aracılığı ile Göç ve β-arrestin BLT1 Etkileşimleri

Lökotriyen B4, çeşitli inflamatuar hücreler üzerindeki G-proteini kenetli reseptörler olan BLT1 ve BLT2 aracılığıyla etkilerini gerçekleştiren pro-inflamatuar bir moleküldür. LTB4-BLT1 yolu; astım, artrit ve ateroskleroz dahil olmak üzere birçok inflamatuar hastalıkta kritik rol oynadığı gösterilmiştir. G-proteini kenetli reseptörler veya GPCR'lar; kemotaksi, hücre içi kalsiyum salınımı ve gen düzenlemesi gibi hücre içi yanıtların ortaya çıkmasını sağlayan hücre dışı sinyallerin iletimini gerçekleştirir.

Hücre dışı ligand bağlanması, heterotrimerik G proteinlerinin aktivasyonuna yol açan bir dizi konformasyonel değişikliği tetikler. G proteini daha sonra, kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerde (BMDC'ler) lökotrien B4 aracılı hücre göçünü gerçek zamanlı olarak izlemek için siklik adenozin monofosfat, asetil trifosfat ve diasilgliserol gibi ikinci haberci seviyelerini modüle eder. Ligand bir mikropipet aracılığıyla kontrollü akışla iletilirken BMDC'lerin görüntülemesi yapılır. Göçü değerlendirmek için zaman ayarlı görüntüleme gerçekleştirilir.

Laboratuvarımız, bu canlı hücre gerçek zamanlı görüntüleme tekniklerini kullanarak lökotrien B4 reseptörü BT1'in dendritik hücreler üzerinde fonksiyonel olarak eksprese edildiğini keşfetmiştir. Ayrıca BT1'in internalizasyonunda fosforilasyon ve beta-arrestin bağımlı mekanizmalar belirledik. Laboratuvarımızda bu tekniklerin çoğunu geliştirmiş olan yardımcı doçent Dr. Jla, hem canlı hücre migrasyonunu hem de reseptör internalizasyonunu gösterecektir. Hücre migrasyonu deneyleri için kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri (BMDC'ler) hazırlamak amacıyla, 0,5 milyon hücreyi FBS, rekombinant GM-CSF ve rekombinant FLT3 içeren RPMI 1640 kültür ortamında 35 mm'lik cam tabanlı bir kaba ekleyin.

Hücreler ekildikten sonra, 37 °C'de ve %5 karbondioksit içeren ortamda 16 saat boyunca inkübe edin. 16 saat sonra üç mililitre PBS ekleyin ve ardından aspire edin. Bu yıkama işlemini, son aspirasyondan sonra en az iki kez daha tekrarlayın ve plağa iki mililitre PBS ekleyin.

Hücreler artık deney için hazırdır ve 37 °C'de tutulmalıdır. Bu süre zarfında, bu videodaki deneylerde kullanılan görüntüleme sistemi; ısıtmalı tabla ve soğutmalı SNAP hq dijital siyah beyaz CCD kamera ile donatılmış, Nikon eclipse TE 300 ters mikroskoba bağlı A-T-E-F-M epi floresan sisteminden oluşmaktadır.

Uyarılma ve emisyon dalga boyları, filtre tekerlekleri ve bir Lambda 10-2 filtre tekerleği kontrolörü ile kontrol edilir. Donanım kontrolü ve görüntüleme işlemleri metamorph yazılımı ile yönetilir. Pipetleri tutmak için mikroskop tablasına iki mikro manipülatör takılmıştır; bu pipetler ya beraberindeki metindeki talimatlara göre hazırlanabilir ya da satın alınabilir.

100 nanomolar stok pro-inflamatuar ligand lökotrien B4 veya LTB4'ten 1,5 mililitreyi 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Mikropipet ucunu solüsyonun içine yerleştirip solüsyonun içeri girmesine izin vererek mikropipeti doldurun; bu yükleme yöntemi, mikropipetin ucunda hava kabarcıkları oluşmasını önleyecektir. Ardından, bir mikrofill iğneye takılı olan bir kübik santimetrelik tüberkülin şırıngasını 1 mililitre LTB4 ile doldurun.

Ardından, bunu mikro pipeti üstten yavaşça doldurmak için kullanın ve boruyu LTB dört ile doldurulmuş mikro pipete takın. Daha sonra mikro pipeti ve boruyu, yine ligand ile doldurulmuş bir mililitrelik bir şırıngaya takılı 21 gauge bir buçuk inçlik bir iğneye bağlayın. Şimdi, kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin canlı hücre görüntülemesini gerçekleştirmek için ligand dolu mikro pipeti mikroskop tablasındaki mikro manipülatörlerden birine dikkatlice sabitleyin.

LTB dört ligand uygulamasının ardından, plakaya ekilmiş olgunlaşmamış b MDCs'leri inkübatörden çıkarın ve mikroskobun ısıtmalı tablasına yerleştirin. 60 x immersiyon lensi kullanarak hücreleri görüş alanına getirin. Migrasyonun uygun şekilde izlenebilmesi için hücrelerin aşırı yoğun olmadığı bir alan bulun.

Fluoro tabağın kapağını çıkarın. Ardından, kaba manuel manipülatörü kullanarak ligand yüklü pipeti dikkatlice indirin ve hidrolik hassas mikro manipülatörü kullanarak hücrelere yakın konuma getirin.

Pipeti odaklayın. LTB dört ligandının uçtan yavaşça salınmasını başlatmak için şırıngayla az miktarda basınç uygulayın; ligand, difüzyon yoluyla medyumun içine yavaşça yayılmalıdır. Ardından, Metamorph yazılımını kullanarak, iki saat boyunca her 15 saniyede bir brightfield görüntüsü alacak şekilde görüntüleme parametrelerini ayarlayın.

Liganda doğru gerçekleşen migrasyonun ilerlemesini her beş dakikada bir izlemeye devam edin. Bu protokolde açıklanan yöntem, dendritik hücrelerin lökotrien B4'e doğru migrasyonunu belirlemek için kullanılmıştır. Burada, fare kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin 100'e doğru migrasyonu incelenmiştir.

Nan Animal veya LTB four'un görüldüğü bu zaman ayarlı görüntüleme videosu, canlı B MDCs hücrelerinin ltb. four'a doğru göçünü göstermektedir. Benzer yöntemler, birçok hücre tipinin çeşitli kemoatraktanlara karşı kemotaktik yanıtını belirlemek için uygulanabilir. Bu görüntüleme türü, floresan protein etiketli moleküllerle birleştirildiğinde, canlı hücrelerde moleküllerin hareketlerini ve etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılabilir.

Burada, floresan etiketli lökotrien B4 reseptör 1 ile beta-arrestin arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak gösteriyoruz. RBL 2 H3, ATCC'den temin edilebilen ve Wistar sıçanlarından izole edilmiş bir sıçan bazofilik lösemi hücre hattıdır. Bu hücreler birçok kemokin reseptörünü eksprese etmezler ancak kemokin bağımlı sinyal yolaklarını yönetebilecek hücresel bileşenlere sahiptirler.

BT1'in liganda bağlı internalizasyonunu gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için RBL-2H3 hücreleri BT1-RFP ve beta-arrestin-GFP ile transfekte edilir. Zaman ayarlı görüntüleme sırasında plakaya ligand eklenir. Bu proteinlerin lokalizasyonundaki değişiklikler görüntü analizi ile değerlendirilebilir.

G PCR R internalizasyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için, beraberindeki metinde yer alan talimatlara uygun olarak RBL iki H üç hücrelerine B LT bir RFP ve beta arrestin ve GFP transfekte edin. Ardından, elektropore edilmiş hücreler ve düzenli büyüme besiyeri karışımının 300 mikrolitresini, iki mililitre düzenli büyüme besiyeri içeren 35 milimetrelik fluro kaplara aktarın. Hücrelerin kabın tabanına yapışmasını sağlamak için hücreleri 37 derece Celsius sıcaklıkta, %95 hava ve %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosfere yerleştirin.

Bir saat sonra, transfeksiyon ortamını standart büyüme ortamıyla değiştirin ve hücreleri 18 ila 24 saat daha inkübatöre geri yerleştirin. İnkübasyonun ardından, plakaya doğrudan 10 millimolar hippies içeren iki mililitre ılık fenol kırmızısı içermeyen RPMI ekleyip ortamı aspire ederek hücreleri iki veya üç kez yıkayın. Ardından 1,8 mililitre daha ekleyin.

Ardından, kültür kabını ısıtmalı mikroskop tablasına yerleştirin. 60x yağ daldırma objektif kullanarak 600x büyütmede görüntüler toplayın. Daha sonra uygun floresan filtreye geçiş yapın.

Hücre yüzeyinde HBL BT one RFP eksprese eden sağlıklı bir hücre seçin ve görüntüyü burada yakalayın. RFP filtresini kullanarak GFP filtresine geçiş yapın, beta arrest ve GFP'nin sitoplazmada eksprese edildiğinden emin olun ve görüntüyü yakalayın. Ardından, yanlış hizalama sonucunda meydana gelebilecek floresan sızıntısını (bleed through) doğrulamak için birleştirilmiş psödo renkli görüntüleri inceleyin.

RFP ve GFP arasında reseptör hedeflemesi gerçekleşmez. Ardından, zaman ayarlı görüntüleme için parametreleri buraya girin. 16 bit görüntüler, kamera bükme ayarı tek tek olarak belirlenmişken elde edilir.

Kırmızı ve yeşil floresan görüntüler, bir R-F-P-G-F-P ışın dağıtıcı aracılığıyla RFP ve GFP florokrom filtreleri kullanılarak ardışık olarak yakalanır. Yazılımı, bir saat boyunca 32. saniye aralıklarla görüntüleri yakalayacak şekilde yönlendirin. Benzer dinamik aralıklar elde edilecek şekilde kamera pozlama sürelerini ayarlayın.

RFP ve GFP'nin floresans yoğunluğu için. Bir dakika boyunca görüntü toplayın, ardından t sıfır anında. Plakayı sarsmadan 200 µL ligandı doğrudan plakanın içine ekleyin.

Floresan görüntüleme işlemini 60 dakika boyunca sürdürün. Ligand eklendikten sonra, görüntüler elde edildikçe ardışık dosya adlarıyla otomatik olarak TIFF görüntüleri şeklinde kaydedilecektir. Dosyalar daha sonra yazılım kullanılarak tekil veya birleştirilmiş görüntüler olarak görüntülenebilir.

Son olarak, tüm hücre görüntüleri elde edildikten sonra, aynı ayarları kullanarak hücre içermeyen düz besiyeri ile görüntüler alın. Bu dosyaları, görüntüleri analiz etmek için arka plan görüntüleri olarak kullanmak üzere kaydedin. Yukarıda elde edilen gerçek veri görüntülerinden arka planı çıkarmak için Metamorph'taki görüntü çıkarma (image subtract) fonksiyonunu kullanın.

Bu işlem, ortamdan kaynaklanan herhangi bir arka plan veya otofloresensi hesaba katacaktır. Ardından, dosya menüsü altında, oluşturulan son yığın dosya seçeneğini açın ve görüntülerin bireysel yığınlarını açın. Daha sonra, bölge ölçümleri altında eclipse region trace region seçeneğini belirleyin ve ilgi bölgelerini çizin; BLT1 ve beta arrestin translokasyonuna karşılık gelen RFP ve GFP floresan yoğunluğunu ölçmek için yüzey ve sitozolik bölgeleri seçin.

Excel'e otomatik olarak bağlanan veri kaydı seçeneğini kullanarak, floresan yoğunluk miktarlarını zamanın bir fonksiyonu olarak grafikleyin. Bu grafik, belirli bir molekülün translokasyon kinetiği hakkında bilgi sağlayacaktır. Görüntü analizi, GPCR'nin ve sitozolik proteinlerin çekirdekteki ve sitoplazmadaki lokalizasyonunu ortaya çıkarabilir.

Burada bir RBL 2 H 3 hücresinin yüzeyinde BT1-RFP ekspresyonu görülmektedir. Bu görüntü, aynı hücrenin sitozolünde beta-arrestin ve GFP lokalizasyonunu göstermektedir ve burada çekirdekte pNuke-CFP görülmektedir. Burada gösterilen birleştirilmiş renkli görüntü, her bir florokromun belirgin hücresel lokalizasyonunu belirtmektedir; yüzey GPCR'larının sitozolik proteinlerle ligand tetiklemeli etkileşimi de buradan değerlendirilebilir.

Ligandla indüklenen BLT1 reseptörü ve beta arrestin translokasyonu. Bu video, BLT1 RFP ve beta arrestin GFP eksprese eden bir hücrenin canlı görüntülemesini göstermektedir. 1 µM LTB4 ilavesinin ardından, translokasyon paternlerinin kantifikasyonu metamorph yazılımı kullanılarak izlenebilir.

T sıfır anında, temsilci bir hücredeki floresan yoğunluklarının bir çizgi taraması gösterilmiştir. BT1 RFP membran üzerinde, beta arrestin GFP ise sitozolde görülmektedir. Ligand eklendikten sonra RFP ve GFP çizgilerinin çakıştığı gözlemlenmiş olup, bu durum reseptör ve beta arrestinin kolokalizasyonuna işaret etmektedir.

Ek olarak, protein hareketinin kinetiği burada belirlenebilir. Reseptör internalizasyonu ve beta arrestin translokasyonunun kinetiği, bir mikromolar LTB4 ilavesinin ardından incelenmiştir.

Floresans yoğunlukları, hücrenin membran ve sitozolik bölgelerinde zamanın bir fonksiyonu olarak ölçülmüştür. B LT 1 RFP ve beta arrestin 1 GFP transfekte edilmiş RRB 2 H 3 hücrelerine LTB 4 ligandının eklenmesi, beta arrestin 1 GFP'nin sitozolden membrana translokasyonuna yol açar ve bu durum bir dakika içinde sarı bir halkanın oluşumuyla gözlemlenebilir. Beta arrestin 1 GFP ile etkileşime girdiğinde, BT 1 RFP bir reseptör beta arrestin 1 GFP kompleksi oluşturur ve beş dakika içinde sarı punktaların belirmesinden anlaşıldığı üzere, endozomlar formunda sitozol boyunca transloke olur. Bu yöntemler kullanılarak, liganda bağımlı reseptör aktivasyon durumu ve reseptör aktivasyonunda yer alan kritik motifler veya süreçler belirlenebilir.

Deneydeki en önemli nokta, işlem sırasında plaktaki tampon çözeltiyi takip etmektir. Deney, geliştirilmesinden bir saat sonra devam eder. Bu teknik, kemokinler ve reseptörler alanındaki araştırmacıların, çeşitli memeli hücre tiplerinde hücre göçünü ve reseptör ligand etkileşimlerini incelemek için ortaya çıkmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, kemokinler, bunların reseptörleri ve beta-arrestinler gibi sitozolik proteinlerle olan etkileşimlerini içeren gerçek zamanlı görüntüleme deneylerinin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.