Lökotrien B Gerçek zamanlı görüntüleme ₄ Hücre aracılığı ile Göç ve β-arrestin BLT1 Etkileşimleri

Bu yazıda, özel ligandlar lökositlerin kemotaktik yanıt belirlemek ve hücre yüzey reseptörleri ve sitozolik proteinler canlı hücre görüntüleme teknikleri kullanarak arasındaki etkileşimleri tanımlamak için metodolojiyi tanımlamaktadır.

Lökotrien B dört, çeşitli enflamatuar hücreler üzerindeki G-proteinine bağlı reseptörler, BT bir ve BT iki yoluyla etkilerine aracılık eden bir pro-enflamatuar moleküldür. LTB dört B LT bir yolunun astım, artrit ve ateroskleroz dahil olmak üzere çeşitli enflamatuar hastalıklarda kritik olduğu gösterilmiştir. G-proteine bağlı reseptörler veya gpcr, kemotaksis, hücre içi kalsiyum salınımı ve gen regülasyonu gibi hücre içi yanıtlara yol açan hücre dışı sinyallerin transdüksiyonuna aracılık eder.

Hücre dışı ligand bağlanması, heterotrimerik G proteinlerinin aktivasyonuna yol açan bir dizi onaylayıcı değişikliğe neden olur. G-proteini daha sonra, gerçek zamanlı kemik iliği türevli dendritik hücrelerde veya B MDC'lerinde lökotrien B'nin dört aracılı hücre göçünü izlemek için siklik adenozin monofosfat, bir asetol tri fosfat ve DYL gliserol gibi ikinci haberci seviyelerini modüle eder. Migrasyonu değerlendirmek için hızlandırılmış görüntüleme yapılır.

Laboratuvarımız, bu canlı hücre gerçek zamanlı görüntüleme tekniklerini kullanarak, löko trend B'nin dört reseptörü BT bir'in dendritik hücreler üzerinde fonksiyonel olarak eksprese edildiğini keşfetti. Ayrıca fosforilasyon ve beta arresti ve BT one'ın içselleştirilmesine bağlı mekanizmaları da belirledik. Bu tekniklerin birçoğunu geliştiren laboratuvarımızdaki Dr.Jla ve yardımcı doçent, hem canlı hücre göçünü hem de reseptör içselleştirmesini gösterecek: Hücre göçü tahlilleri için kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri veya B MDC'leri hazırlamak için, FPS rekombinant G-M-C-S-F ve rekombinant FLT üçünü içeren RPMI 1640 kültür ortamında 0,5 milyon hücreyi 35 milimetrelik bir cam tabanlı tabakta plakalayın.

Kaplandıktan sonra, hücreleri 37 santigrat derecede 16 saat ve 16 saat sonra% 5 karbondioksitte inkübe edin. Üç mililitre PBS ekleyin ve ardından aspire edin. Son aspirasyonu takiben bu yıkamayı en az iki kez daha tekrarlayın, plakaya iki mililitre PBS ekleyin.

Hücreler artık deney için hazırdır ve 37 santigrat derecede tutulmalıdır. O zamana kadar, bu videodaki deneyler için kullanılan görüntüleme sistemi, bir ısıtma aşaması ve soğuk bir SNAP karargahı ile donatılmış bir Nikon eclipse TE 300 ters mikroskopa bağlı A-T-E-F-M epi floresan sisteminden oluşuyor. Dijital siyah beyaz CCD kamera.

Uyarma ve emisyon dalga boyları, filtre tekerlekleri ve bir Lambda 10 çizgi iki filtre tekerleği kontrolörü ile kontrol edilir. Donanım kontrolü ve edinim görüntüleri metamorph yazılımı tarafından kontrol edilir. Pipetleri tutmak için mikroskop aşamasına iki mikro manipülatör takılmıştır, bunlar ekteki metindeki talimatlara göre üretilebilir veya satın alınabilir.

Pro-inflamatuar ligand lökotrien B dördü veya LTB dördünün 100 nanomolar stoğunun 1,5 mililitresini 1,5 mililitrelik bir füj tüpüne aktarın. Mikro pipet ucunu solüsyonun içine yerleştirerek ve solüsyonun bu yükleme yöntemine girmesine izin vererek mikro pipeti geri doldurmak, mikro pipetin ucunda hava kabarcıklarının oluşmasını önleyecektir. Daha sonra, bir mililitre LTB dört ile bir mikro doldurma iğnesine bağlı bir santimetreküp tüberkülin şırıngası yükleyin.

Ardından, bir mikro pipeti üstten yavaşça doldurmak için kullanın ve hortumu LTB dört dolgulu mikro pipete takın. Ardından mikro pipeti ve tüpü, yine ligand ile doldurulmuş bir mililitrelik şırıngaya bağlı 21 gauge bir buçuk inçlik bir iğneye bağlayın. Şimdi kemik iliğinden türetilmiş dendritik hücrelerin canlı hücre görüntülemesini gerçekleştirmek için ligand dolu mikro pipeti mikroskop aşamasındaki mikro manipülatörlerden birine dikkatlice sabitleyin.

LTB dört ligandın uygulanmasına yanıt olarak, kaplanmış olgunlaşmamış b MDC'leri inkübatörden çıkarın ve mikroskobun ısıtılmış aşamasına yerleştirin. 60 x yağa daldırma lensi kullanarak hücreleri görünür hale getirin. Hücrelerin aşırı kalabalık olmadığı, göçün düzgün bir şekilde izlenebileceği bir alan bulun.

Kapağı floro kabından çıkarın. Daha sonra kaba manuel manipülatörü kullanarak, ligand yüklü pipeti dikkatlice indirin ve içeri getirin. Hidrolik ince mikro manipülatörü kullanarak hücrelere yakınlığı kapatır.

Pipeti odak noktasına getirin. LTB dört ligandın uç ligandından yavaş salınımını başlatmak için şırıngadan az miktarda basınç uygulayın, difüzyon yoluyla ortama yavaşça yayılmalıdır. Ardından, metamorf yazılımı kullanarak, iki saat boyunca her 15 saniyede bir parlak alan görüntüsü elde etmek için görüntü elde etme parametrelerini ayarlayın.

Ligand'a doğru göçün ilerlemesi için her beş dakikada bir izlemeye devam edin. Bu protokolde tarif edilen yöntem, lökotrien B dördüne doğru dendritik hücre göçünü belirlemek için kullanıldı. Burada, fare kemik iliği 100'e doğru dendritik hücre göçünü türetmiştir.

Nan Animal veya LTB dört görülüyor, bu zaman atlamalı görüntüleme videosu, B MDC'lerin ltb'ye doğru canlı hücre göçünü gösteriyor. Birçok hücre tipinin çeşitli kemoterapi cezbedici maddelere kemotaktik yanıtını belirlemek için dört benzer yöntem uygulanabilir. Floresan protein etiket molekülleri ile kombinasyon halinde bu tür görüntüleme, canlı hücrelerde moleküllerin hareketlerini ve etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılabilir.

Burada, floresan etiket lökotrien B'nin, dört reseptörünün, bir tanesinin, beta arrestin ile gerçek zamanlı olarak etkileşimlerini gösteriyoruz. RBL iki H üç, Wister sıçanlarından izole edilen ve A TCC'den elde edilebilen bir sıçan bazofilik lösemi hücre hattıdır. Bu hücreler pek çok kemokin reseptörünü eksprese etmez, ancak kemokine bağımlı sinyal yollarına aracılık edecek hücresel bileşenlere sahiptir.

BT'nin ligand kaynaklı içselleştirilmesini değerlendirmek için, gerçek zamanlı olarak bir, RBL, iki H, üç hücre BT ile transfekte edilir, bir RFP ve GFP'de beta arresti yapılır. Hızlandırılmış görüntüleme sırasında plakaya ligand eklenir. Bu proteinlerin lokalizasyonundaki değişiklikler görüntü analizi ile değerlendirilebilir.

G PCR R içselleştirmesini gerçek zamanlı olarak incelemek için, ekteki metindeki talimatlara göre B LT, bir RFP ve beta arrest ve GFP'yi RBL'ye, iki H'ye, üç hücreye transfekt. Daha sonra 300 mikrolitre elektroporasyonlu hücreleri ve düzenli büyüme ortamı karışımını, iki mililitre düzenli büyüme ortamı içeren 35 milimetre floro kabına aktarın. Hücreleri 37 santigrat derecede% 95 hava,% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosfere yerleştirin ve yemeğin dibine yapışmalarını sağlayın.

Bir saat sonra, transfeksiyon ortamını normal büyüme ortamıyla değiştirin ve hücreleri 18 ila 24 saat daha inkübatöre geri koyun. İnkübasyonu takiben, 10 milimolar hippi içeren iki mililitre ılık fenil kırmızısı serbest RPMI'yi doğrudan plakaya ekleyerek ve ortamı aspire ederek hücreleri iki veya üç kez yıkayın. Sonra 1.8 mililitre daha ekleyin.

Ardından, kültür kabını ısıtılmış mikroskop aşamasına yerleştirin. 60 x yağa daldırma lensi kullanarak 600 x büyütmede görüntü toplayın. Ardından uygun floresan filtresine geçin.

Hücre yüzeyinde HBL, BT, bir RFP ifade eden sağlıklı bir hücre seçin ve burada görüntü yakalanır. RFP filtre anahtarını GFP filtresine kullanarak, beta tutuklaması ve GFP'nin sitoplazmada ifade edildiğinden emin olun ve görüntüyü yakalayın. Ardından, buğu sonucu oluşabilecek bir floresan yoluyla kanama olduğundan emin olmak için birleştirilmiş sahte renkli görüntüleri inceleyin.

Reseptörlerin hedeflenmesi RFP ve GFP arasında gerçekleşmez. Ardından, hızlandırılmış görüntüleme parametrelerini buraya girin. 16 bit görüntüler, kamera bükülmesi tek tek ayarlandığında elde edilir.

Kırmızı ve yeşil floresan görüntüleri, bir R-F-P-G-F-P ışın sıçraması yoluyla RFP ve GFP florokrom filtreleri kullanılarak sırayla yakalanır. Yazılımı, bir saat boyunca 32. zaman aralıklarında görüntü yakalamaya yönlendirin. Kamera pozlama sürelerini, benzer dinamik aralıklar elde edilecek şekilde ayarlayın.

RFP ve GFP'nin floresan yoğunluğu için. Görüntüleri bir dakika boyunca toplayın, ardından t'de sıfıra eşittir. 200 mikrolitre ligandı rahatsız etmeden doğrudan tabağa ekleyin.

60 dakika boyunca floresan görüntüleri toplamaya devam edin. Ligandı ekledikten sonra, görüntüler elde edildikçe, otomatik olarak sıralı dosya adlarına sahip TIFF görüntüleri olarak saklanacaktır. Dosyalar daha sonra yazılım kullanılarak tek tek veya birleştirilmiş görüntüler olarak görüntülenebilir.

Son olarak, tüm hücre görüntüleri elde edildikten sonra, aynı ayarları kullanarak hücre içermeyen düz ortamlı görüntüler elde edin. Görüntüleri analiz etmek için dosyaları arka plan görüntüleri olarak kullanmak üzere kaydedin. Yukarıda elde edilen gerçek veri görüntülerinden arka planı çıkarmak için metamorfta görüntü çıkarma işlevini kullanın.

Bu, ortamdan gelen herhangi bir arka plan veya otofloresan için hesaba katılacaktır. Ardından, dosya menüsü altında, oluşturulan son yığın dosyası seçeneğini açın ve tek tek görüntü yığınlarını açın. Ardından, bölge ölçümleri altında tutulma bölgesi izleme bölgesini seçin ve ilgilenilen bölgeleri çizin, BLT bir ve beta arrestin translokasyonuna karşılık gelen RFP ve GFP'nin floresan yoğunluğunu ölçmek için yüzey ve sitozolik bölgeleri seçin.

Excel'e otomatik olarak bağlanan günlük verileri seçeneğini kullanarak, floresan yoğunluklarının miktarını zamanın bir fonksiyonu olarak ayarlayın. Bu grafik, belirli bir molekülün translokasyon kinetiği hakkında bilgi sağlayacaktır. Görüntü analizinde G, PCR, R ve sitozolik proteinlerin ve çekirdeğin lokalizasyonunu ortaya çıkarabilir.

Burada bir RBL iki H üç hücreli yüzeyde BT bir RFP ifadesi görülmektedir. Bu görüntü, aynı hücrenin sitozolünde beta dinlenme ve GFP lokalizasyonunu göstermektedir ve burada çekirdekte p nükleer CFP görülmektedir. Burada gösterilen renk birleşik görüntü, yüzey GPCR'lerinin sitozolik protein ile etkileşiminin neden olduğu her bir florokrom ligandının farklı hücresel lokalizasyonunu gösterir.

Ligand, BLT bir reseptörünün ve beta arrestinin translokasyonunu indükledi. Bu video, B LT bir RFP ve beta arrestin GFP eksprese eden bir hücrenin canlı görüntülemesini göstermektedir. Bir mikromolar LTB dört eklendikten sonra, translokasyon modellerinin nicelleştirilmesi metamorf yazılımı kullanılarak izlenebilir.

Temsili bir hücredeki floresan yoğunluklarının bir çizgi taraması, T'nin sıfıra eşit olduğu gösterilir. Membranda BT bir RFP, sitozolde ise GFP'de beta arrest görülür. Ligandın eklenmesi üzerine, RFP ve GFP hatlarının örtüşmesi gözlenir, bu da reseptörün ve beta arrestinin kolokalizasyonunu düşündürür.

Ek olarak, protein hareketinin kinetiği burada belirlenebilir. Reseptör içselleştirme ve beta arrestin translokasyon kinetiği. Bir mikromolar LTB eklendikten sonra dört tanesi incelendi.

Floresan yoğunlukları, hücrenin membran ve sitozolik konumlarında zamanın bir fonksiyonu olarak ölçüldü, LTB'ye dört ligand, LT'ye dört ligand, bir RFP ve beta arrestin, bir GFP Transfekte RRB, iki H, üç hücre, beta arrestinin translokasyonuna yol açar, bir GFP, sitozolden membrana bir dakika içinde sarı bir halka oluşumu olarak gözlemlenebilir. Bir GFP'de beta arrest ile etkileşime girdiğinde, BT bir RFP, bir GFP kompleksinde bir reseptör beta arrestin oluşturur ve beş dakika içinde sarı punkta'nın görünümünden de anlaşılacağı gibi sitozol boyunca endozomlar şeklinde yer değiştirir. Bu yöntemler kullanılarak, ligand bağımlı reseptör aktivasyon durumu ve reseptör aktivasyonunda yer alan kritik motifler veya süreçler belirlenebilir.

Deneydeki en önemli şey, çalıştırılırken plakadaki tampona göz kulak olmaktır. Deney, geliştirilmesinden sonra bir saatin ötesine geçtiği için. Bu teknik, kemokinler ve reseptörler alanındaki araştırmacılar, çeşitli memeli hücre tiplerinde ocat göçü ve reseptör ligand etkileşimlerini araştırmak için ortaya çıktı.

Bu videoyu izledikten sonra, kemokinleri ve reseptörlerini içeren gerçek zamanlı görüntüleme deneylerinin nasıl kurulacağını ve bunların beta kısıtlamaları gibi sitozolik proteinlerle etkileşimlerini iyi anlamış olmalısınız.