Bina daha iyi Sivrisinek: Sıtma ve Dang Ateşi Direnç A. gambiae ve A. aegypti Sivrisinekler etkinleştirilmesi Genler belirlenmesi

Ben George Dimopoulos. Johns Hopkins Halk Sağlığı Okulu'nun Moleküler Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'ndeki Sıtma Araştırma Enstitüsü'nde yardımcı doçentim. Araştırma grubum, sıtmaya neden olan parazitleri taşıyan Anopheles gambiae sivrisinekleri üzerinde çalışıyor ve sivrisineklerin moleküler biyolojisini, özellikle de sıtma parazitlerini yok eden doğuştan gelen bağışıklık sistemlerine odaklanarak inceliyoruz.

Bu bağışıklık sisteminin nasıl çalıştığını ve paraziti öldürmek için hangi genlerin ve moleküllerin önemli olduğunu anlamak istiyoruz. Bu sistemin biyolojisini anlayarak, elde ettiğimiz bilgileri gelecekte Sıtma kontrol stratejileri geliştirmek için kullanabileceğimize inanıyoruz. Sıtma, dünyanın en ciddi hastalıklarından biridir.

Sıtma, aslında insanlıkla beraber her zaman var olmuştur ve hala mevcut olması üzücüdür. Sıtma her yıl 400 milyon insanı enfekte etmekte ve çoğunlukla Sahra Altı Afrika bölgesinde olmak üzere 2 milyon insanın ölümüne neden olmaktadır; ancak hastalığa Güney Amerika ve Asya'daki diğer gelişmekte olan ülkelerde de rastlanmaktadır. Sıtma, Plasmodium cinsine ait bir protozoon parazit tarafındana neden olur ve insanlarda sıtma yapabilen dört Plasmodium türü bulunmaktadır.

Bunların en önemlisi Plasmodium falciparum'dur. Plasmodium falciparum çoğunlukla Anopheles cinsine ait sivrisinekler tarafından bulaştırılır ve Sahra Altı Afrika'da sıtma bulaşması için en önemli vektör sivrisinekler Ous Gambia türler kompleksine aittir; bunlar temel olarak Afrika'nın Sahra Altı bölgesinde yayılış gösterirler. Deng virüsü bir flavivirüstür ve çoğunlukla Aedes aegypti sivrisineği tarafından bulaştırılır.

Coğrafi dağılımı sıtma ile oldukça benzerdir. Amerika kıtasında, Güneydoğu Asya'da ve Afrika'da görülür. Dengue virüsü hemorajik ateşe neden olur.

Yaklaşık 2,5 milyar insan dengue virüsü riski altındadır ve virüs her yıl milyonlarca kişide hemorajik ateşe neden olmaktadır. Dengue hemorajik ateşi, son 10 yılda ortaya çıkan en ciddi vektör kaynaklı hastalıklardan biri haline gelmiştir. Benzer şekilde, sıtma paraziti, insan konakçısı arasında iletimi sağlayan sivrisinek vektöründe ve insan konakçıda karmaşık bir yaşam döngüsüne sahiptir.

Araştırma grubum, sivrisineklerde sıtma iletiminin biyolojisini incelemektedir. Bir sivrisinek enfekte bir kan öğününü tükettiğinde, aynı zamanda plasmodium falciparum parazitlerini de bünyesine almış olur. Parazitin gametositleri orta bağırsakta dölleşir ve kan tüketiminden yaklaşık 18 ila 35 saat sonra bir MT tile veya kin üretir.

Bu ookinetler buradaki sivrisinek bağırsak epitelini istila edecektir. Ookinetlerin çoğu bu aşamada sivrisineğin bağışıklık sistemi tarafından öldürülür; çalışmalarımızı da bu noktaya odaklıyoruz ve bu görüntü, ookinetlerin konfokal mikroskopi görüntüsüdür. Orta bağırsağı geçmeyi başaran ookinetler burada bazal tarafta bir kist oluşturacak ve bu kist içinde binlerce sporozoit aşamasındaki parazit gelişecektir; bu sporozoit aşamaları, sivrisineğin kan öğününü almasından yaklaşık 15 gün sonra tükürük bezlerine göç edecektir ve sporozoitler tükürük bezlerinden yeni bir konakçıya iletilebilir. Sivrisineğin bağışıklık sistemi, sporozoitlerin sivrisineğin hemoselinde serbest kaldıkları bu aşamada onları öldürmede de rol oynar.

Sivrisinek genomu yakın zamanda, 2002 yılında dizilenmiş olup bu durum, mikro-diziler (microarrays) adı verilen yöntemle farklı enfeksiyon koşullarındaki tüm sivrisineklerin, yaklaşık 14.000 genin gen ekspresyonunu incelemek için yeni moleküler biyoloji ve genomik araçlar geliştirmemize olanak sağlamıştır. Birkaç yıl önce geliştirdiğimiz buradaki mikro-dizi, sivrisineğin tüm transkriptomunu, yani o dönemde bilinen tüm sivrisinek genlerinin yanı sıra plasmodium parazit genlerini de içermektedir. Böylece enfeksiyon sırasında hem sivrisinekteki hem de parazitteki gen aktivitesini eş zamanlı olarak analiz edebiliyoruz.

Sivrisinek plasmodium parazitleri ile enfekte olduğunda hangi genlerin aktive olduğunu belirledikten sonra, bu genlerin paraziti öldürmede rol oynayıp oynamadığını test etmemiz gerekir ve bunu RNA interferans gen susturma adlı bir yöntemle yaparız. Temel olarak hedeflemek istediğimiz genler için RNA enjekte ederiz ve bu çift zincirli RNA, sivrisinekte hedeflediğimiz genlerin mRNA'larını parçalayacaktır; böylece bu genler protein üretmeyecektir. Ardından sivrisineği bir parazit ile enfekte edeceğiz.

Şimdi, eğer sivrisinekte belirli bir geni susturduysak veya etkisiz hale getirdiysek ve bu susturma sonucunda parazit, işlem görmemiş sivrisineklere kıyasla normalden daha yüksek bir enfeksiyon kurabiliyorsa, bu durum söz konusu genin malaria parazitlerini öldürmede bir şekilde kullanıldığını gösterir. Sivrisinekteki genlerin parazitleri öldürmede rol oynayıp oynamadığını test etmek için kullandığımız temel yöntem budur.

Plasmodium parazitlerinin çoğu sivrisinek içerisinde öldürülür ve sivrisineklerin doğuştan gelen bağışıklık sisteminin bu öldürme işleminden temel olarak sorumlu olduğuna dair güçlü kanıtlarımız vardır. Laboratuvarımız ve iş birliği yaptığımız laboratuvarlar, bu süreçte rol oynayan çeşitli genler tanımlamıştır. Parazit öldürme mekanizmasıyla ilgili olarak, doğuştan gelen bağışıklık savunma mekanizmaları aracılığıyla orta bağırsaktaki tüm parazitleri öldürdükleri için sıtmayı iletmeyen, genetik olarak seçilmiş sivrisinek suşları da mevcuttur.

Görünüşe göre sivrisineklerin, paraziti hedeflemek için çeşitli farklı bileşenlere ve mekanizmalara sahiptir ve günümüzdeki en büyük zorluk, bu fonksiyonların nasıl çalıştığını anlamak ve dirençli sivrisinekler geliştirmek için bunları nasıl manipüle edebileceğimizi çözmektir. GTI sivrisineği, dengue virüsü enfeksiyonunu kontrol etmek için Anopheles gambiae'nin kontrol ettiği odium enfeksiyonundan farklı mekanizmalar kullanmaktadır. Aegypti sivrisineği, tüm ökaryotlarda olduğu gibi, RNA interferansı olarak adlandırılan RNA bağımlı bir savunma mekanizmasına sahiptir.

Bu, temel olarak virüsün RNA'sını hedef alıp yıkabilen bir savunma mekanizmasıdır ve bu sayede organizmayı virüs enfeksiyonuna karşı korur. Bu savunma mekanizmasını anlamaya ve virüse dirençli sivrisinekler üretmek amacıyla bunu nasıl manipüle edebileceğimize odaklanıyoruz. Geçtiğimiz 10 yıl içinde moleküler biyoloji, özellikle de araştırmalarımızı muazzam ölçüde hızlandıran metodolojik gelişmelerle birlikte oldukça çarpıcı ilerlemeler kaydetti.

Başlıca ilerlemelerden biri, tüm genomların yüksek kapasiteli dizilemesine olanak tanıyan dizileme teknolojileridir. Bu teknolojiler sayesinde, artık Anopheles gambiae ve Anopheles arabiensis sıtma sivrisineği genomları tamamen dizilenmiş durumdadır. Bu durum, enfeksiyonların kontrolünde rol oynayan genleri eskisinden çok daha kolay bir şekilde tanımlamamıza imkan tanımaktadır.

Fonksiyonel genomik alanındaki diğer çok önemli ilerlemelerden biri, mikroarray kullanılarak yapılan yüksek throughput gen ekspresyon analizidir. Mikroarraylar, üzerlerine binlerce DNA fragmanının immobilize edildiği küçük cam lamlar olup, bu DNA çipleri olarak adlandırılan yapıları çok sayıda genin ekspresyonunu izlemek için kullanabiliriz. Alandaki bir diğer çok önemli ilerleme ise, genleri hedefleyip sivrisinekte onları inaktive etmemize olanak tanıyan RNA interferans gen susturma metodolojisidir; böylece gen fonksiyonunu ve ilgilendiğimiz genlerin paraziti öldürmede nasıl bir öneme sahip olduğunu incelemek için ters genetik yaklaşım olarak adlandırılan yöntemden yararlanabiliriz.

Bizim ve iş birliği yaptığımız araştırmacıların bu çalışmaların çoğunu üzerinde yürüttüğü sivrisinekler, 30 yıldır laboratuvar koşullarında tutulan sivrisinek kolonilerinden gelmektedir. Bu sivrisinekler, doğada bulduğumuz sivrisineklerden belirgin şekilde farklılaşmıştır. Doğadaki sivrisinekler, laboratuvarımızdaki oldukça stabil koşullara kıyasla, sahada çok değişkenlik gösteren farklı mikroplar ve diğer parametreler nedeniyle sürekli bir seçilim baskısı altındadır.

Bu nedenle, çalışmalarımızın muhtemelen doğrudan saha sivrisinekleri üzerinde gerçekleştirilmesinin çok daha bilgilendirici olacağı savunulabilir. Ne var ki, bunu yapmak o kadar kolay değildir. Belirtildiği üzere, sahada gerekli altyapıya sahip değiliz ve ayrıca sahadan sivrisinek toplamak ve bu sivrisineklerden koloniler geliştirmek oldukça karmaşıktır.

Bu nedenle, günümüzde sahip olduğumuz en iyi biyolojik modeller laboratuvar modelleridir; ancak elbette bir noktada sahaya inip laboratuvar sivrisineklerimizle yaptığımız keşiflerden elde ettiğimiz temel bulguları doğrulamamız ve teyit etmemiz gerekecektir. Sivrisineklerin savunma sistemlerinin, bu böceklerin bulaştırdığı insan patojenlerini öldürmede rol oynadığını biliyoruz. Artık bu öldürme işleminin nasıl gerçekleştiğini, hangi genlerin ve hangi mekanizmaların rol oynadığını anlayabilirsek, bunları potansiyel olarak manipüle edebilir ve bu manipülasyonu patojeni bulaştıramayan genetiği değiştirilmiş sivrisinekler geliştirmek için kullanabiliriz.

Bu tür genetik olarak modifiye edilmiş sivrisinekleri geliştirdikten sonra, onları sahaya nasıl aktarabileceğimizi ve duyarlı sivrisineklere karşı nasıl baskın bir tür haline getirebileceğimizi düşünmeye başlayabiliriz. Bunu başarmak için yaygın olarak tartışılan bir strateji, temel olarak doğal popülasyonlara, sivrisinekleri patojenlere karşı dirençli kılacak dirençli genlerin yayılmasıdır ve bunun sözde genetik sürücü (gene drive) mekanizmaları aracılığıyla gerçekleştirilmesi gerekir. Günümüzde birçok araştırma, bu tür genetik sürücü mekanizmalarının geliştirilmesine odaklanmıştır.

Elbette, herhangi bir genetiği değiştirilmiş organizmanın doğaya salınmasıyla ilgili gözetilmesi gereken birçok etik husus vardır. Genetik modifikasyonun sahada sürekli olarak doğal yollarla gerçekleştiğini hatırlamak önemlidir. Yapılan üç mutasyon nedeniyle, bir patojeni daha iyi iletecek veya başka istenmeyen özelliklere sahip olacak bir sivrisinekle karşı karşıya kalacağımıza inanmak için çok az neden vardır.

Olabilecek en kötü şey, patojenin bir noktada bu transgenik sivrisineğe karşı direnç geliştirmesidir; elbette, sahaya genetiği değiştirilmiş bir sivrisinek salmayı düşünmeden önce çok sayıda saha testi ve laboratuvar testi yapmamız gerekecektir. Ayrıca, insanları bu kontrollü stratejiler konusunda eğitmemiz ve herkesin bu tür bir stratejiden rahat hissettiğinden ve bunu desteklediğinden emin olmamız gerekecektir. Patojenin sivrisinek vektöründe engellenmesine dayalı bir hastalık kontrol stratejisine ulaşmamız için hâlâ birçok engel bulunmaktadır.

Bu engellerin bazıları, çözmemiz gereken teknik sorunlar ve deneysel meselelerle ilgilidir. Örneğin, bu dirençli genlerin popülasyonlar içinde verimli bir şekilde yayılmasına olanak sağlayacak genetik sürücü mekanizmalarının geliştirilmesi bir engel teşkil etmektedir. Hastalık vektörleri biyolojisi bilim alanı, son 10 ila 15 yılda, özellikle böcek-patojen etkileşimi biyolojisinin anlaşılmasının kontrol stratejileri geliştirmemize aslında yardımcı olabileceğinin fark edilmesiyle birlikte, çok hızlı bir ilerleme kaydetmiştir.

Ve bu tanınırlık, bu alandaki araştırmalara yönelik finansmanın artmasını sağlamıştır. Elde ettiğimiz ivmeyi koruyabilmemiz ve vektör-patojen etkileşiminin biyolojisini anlayarak, hastalıkları kontrol altına alacak stratejiler geliştirmek için bu biyolojiyi nasıl kullanabileceğimizi kavrayıp görevimizi tamamlayabilmemiz adına, bu finansmanın ve kararlılığın sürdürülmesi son derece önemlidir.