Keten içinde değişiklikler Kalıtsal Çevre İndüklenmiş

Bu prosedürün genel amacı, kalıtsal genomik varyasyonla sonuçlanan koşullar altında indüklenebilir bir keten çeşidinin yetiştirilmesi için bir yöntem göstermektir. Ayrıca, genomik değişiklikler izlenir ve indüklenen bitkilerin sonraki nesillerde büyümesi çeşitli ortamlarda gözlemlenir. Bunu başarmak için, keten çeşitli indükleyici koşullar altında yetiştirilir.

Yaprak ve Maris kök dokusu daha sonra bitkilerin çeşitli ortamlarda büyümesi sırasında çeşitli zamanlarda toplanır. Daha sonra, doku örneklerinden DNA ve RNA izole edilir. Prosedürün son adımı, farklı çevresel koşullar altında büyümeden kaynaklanan genomik değişiklikleri ve gen ekspresyonu değişikliklerini tanımlamak için DNA örneklerini kullanarak PCR ve izole edilmiş RNA'yı kullanarak Q-R-T-P-C-R gerçekleştirmektir.

Sonuç olarak, tedavi edilmiş bitkilerin dokularından izole edilen nükleik asit ile gerçekleştirilen PCR ve R-T-P-C-R ile görselleştirildiği gibi, genomda belirli bir noktada LIS bir ekleme elemanının görünümü ve bu elementin varlığı ile ilişkili ekspresyon farklılıkları ile büyüme koşullarına genomik yanıtı göstermek için sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ben Case Western Reserve Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden Chris Cull. Ben Cull Lab'den Cory Johnson.

Ve ben Tiffany Moss, aynı zamanda itlaf laboratuvarından. Ve ben Marshall Lucas. Cull laboratuvarında lisans araştırması için yaz programında bir lisans öğrencisi.

Laboratuvarımızda, büyüme ortamındaki değişikliklerden kaynaklanan genom ve gen ekspresyonundaki değişiklikleri incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Teşvik edici koşullar altında keten yetiştirmek için, beş inçlik saksıları toprakla doldurarak ve sıkılaştırarak başlayın.

Bir sonraki bitki, saksı başına üç keten tohumu, çeyrek inç derinliğinde. Daha sonra indükleyici olmayan kontrol koşulları için topraktan tohumların üzerine. Bitkileri 100 mililitre 10. güç mucizesi yetiştirme çözeltisi ile sulayın.

Bitkileri yüksek besin koşulları altında 100 mililitre tam güçle tedavi edin. Mucize büyümek. Sonunda başvur.

Düşük besinli bitkilere sadece musluk suyu. Bitkiler büyüdükçe yaz aylarında bitkileri doğal ışık altında büyütün. Tüm bitkileri günde iki kez beş dakika boyunca otomatik bir püskürtme sistemi ile sulayın.

Büyüme koşullarını haftada bir kez bitkilere uygulayın. Yaprakları haftalık aralıklarla mari saplarına toplayın. DNA ekstraksiyonu için altı yaprak toplanır ve toplamayı takiben RNA ekstraksiyonu için üç me sapına ihtiyaç vardır, bitki materyalini bir kriyo şişesine yerleştirin, hızlı bir şekilde sıvı nitrojen içinde dondurun ve numuneleri ekstrakte edilene kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Üç genotip, koşullara bağlı olarak farklı nispi oranlarda büyür. Kontrol koşulları altında, kendi içinde yetiştirilmiş keten çeşidi fırtınası veya PL hattı en iyi şekilde büyür. Bu ebeveynden, büyük veya L çeşidinin küçük veya S çeşidinden daha kuvvetli olduğu birkaç hat türetilmiştir.

Bununla birlikte, düşük besinler altında S, L veya pl'den daha iyi büyür. Ve yüksek besin koşulları altında, L, S'den sadece biraz daha iyi büyüyen pl'den daha iyi büyür, üç farklı tedavi altında yetiştirilen hatların her biri arasında yapılan bir karşılaştırma, PL'nin kontrol koşulları altında en iyi şekilde büyüdüğünü ortaya koymaktadır. L, yüksek besin koşulları altında en iyi şekilde büyür ve S, hem yüksek besin hem de kontrol koşulları altında benzer şekilde büyür.

Bu veriler, üç çizginin, üç ortamdaki büyümelerine bağlı olarak ayırt edilebileceğini göstermektedir. PL ve L belirli ortamlarda daha iyi büyürken, S her üç koşulda da yaklaşık olarak aynı şekilde büyür. S, iyileştirilmiş besin koşullarından yararlanamaz, ancak çok düşük besin koşulları altında daha iyi büyüyebilir.

DNA ekstraksiyonu için tampon ekleyin, Qiagen, DNEZ bitkisinden bir AP, DNA hazırlık kiti bir mikro füj tüpünde steril kumlu altı yaprağa ekleyin, dokuyu hiçbir topak görünmeyene kadar bir mikro havaneli ile öğütün. RNA ekstraksiyon transferini, üç maris sapını ve çevredeki bazı yaprakları bir depolama kriyo şişesinden bir mikro füj tüpüne başlatmak için belirtildiği gibi kit talimatlarını izleyerek ekstraksiyona devam edin. Tüpe steril kum ekleyin ve dokuyu ince bir şekilde öğütülene kadar bir mikro havaneli kullanarak öğütün.

Lizise yardımcı olmak için numuneyi 15 saniye vorteksleyin, ardından kum ve kalıntıları toplamak için 13.000 RPM'de bir dakika döndürün. SNAT'ı döndürme sütununa ekleyin ve üreticinin talimatlarına göre RNA hazırlığına devam edin. RNA doku transferinden ekstrakte edildikten sonra, reaksiyona RNA numune hacminin 10'da birinde 10 XDNA tamponu ekleyin.

Ve 30 birim DN'de, reaksiyonu 37 santigrat derecede 30 dakika, ardından beş dakika boyunca 70 santigrat derecede inkübe edin. Uygulanan biyosistem RNA'dan CD'ye NA kitini kullanarak ters transkripsiyon gerçekleştirin. Üreticilere ve S talimatlarına göre, reaksiyonu bir saat boyunca 37 santigrat derecede ve ardından beş dakika boyunca 95 santigrat derecede inkübe edin.

Son olarak, verimi belirlemek için beş mikrolitre CDNA'yı %1.5'lik bir AROS jeli üzerinde çalıştırın. Keten CD NA hazırlandıktan sonra QPCR için kullanılır. QPCR'yi bir A BI Step one sistemi kullanarak gerçekleştirin.

Her çalıştırma için tüm tahlilleri üç nüsha halinde gerçekleştirin ve QPCR reaksiyonlarını hazırlamak için temizlik hizmetleri Gene Acton'ı bir kopya numarası kontrolü olarak kullanın. Her tüpe uygun astar çiftinden bir mikrolitre ekleyin. CD NA'yı uygun konsantrasyona seyreltin ve her tüpe dokuz mikrolitre ekleyin.

Son olarak, her tüpe iki x cyberg green PCR ana karışımından 10 mikrolitre ekleyin. Ardından, amplifikasyonu takiben amplifikasyon programını ayarlayın. Birinci adım yazılımındaki varsayılan parametreler tarafından belirlenen ve amplifikasyon eğrilerinin incelenmesiyle onaylanan eşik için döngü numarasından göreceli ifade seviyelerini hesaplayın.

Gövde boyunca çeşitli pozisyonlarda yapraklardan izole edilen DNA'dan PCR amplifikasyonu, bitkiler indükleyici koşullar altında yetiştirildiğinde, tek bir kopya 5.7 kilobaz, çizgi ekleme dizisi olarak adlandırılan DNA fragmanı veya LIS birin görünümünü gösterir. LIS bir, PL düşük besin indükleyici koşullar altında büyütüldüğünde ortaya çıkar ve sonunda homozigot hale gelir. Burada. Bir ila altı yaprak numunesi haftalık aralıklarla izole edildi ve birinci numune dikildikten sonra en erken olan numune oldu, DNA daha sonra numunelerden ekstrakte edildi.

PCR amplifikasyonu, ilki hariç tüm örneklerde LAS'ın her iki terminalinin bir varlığını ortaya koymaktadır. Bu, yerleştirilen unins bölgesinin kaybolmasına karşılık gelir ve beşinci yaprak QPCR tarafından buna dair hiçbir kanıt yoktur. Sonuçlar, indüksiyonla ilişkili LAS bir veya diğer genomik değişikliklerin varlığının, bir S'nin hemen yakınındaki genlerin ekspresyonunu etkilediğini göstermektedir.

Burada gösterilen altı genin tümü PL ve S'de diferansiyel olarak ifade edilir, genlerin dördü pl'de daha yüksek ekspresyona sahiptir, bu da LIS birine sahip değildir. Tersine, ikisinin S'de daha yüksek ifadesi vardır, bu da LIS'e sahiptir, Size az önce indüklenebilir keten çizgilerinin nasıl büyütüleceğini gösterdik. Böylece genom, büyüme ortamına ve sonraki nesillerin büyüme özelliklerine yanıt olarak değişir.

Bu prosedürü yaparken, değişikliklerin tekrarlanabilir indüksiyonu için büyüme koşullarının tekrarlanması gerektiğini hatırlamak önemlidir. İşte bu kadar. Birçoğunuzun bu fenomene şüpheyle yaklaştığını biliyorum, ancak şimdi gözlemleri kendiniz için yeniden üretebilirsiniz.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.