Name: E18 Rat Brain Organotipik Dilim Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: Öğrenin, E18 sıçan beyni organotipik dilim kültürü hazırlama yöntemini. Disseksiyon, agaroz gömme, vibratom kesimi ve kültür bakımı adımlarını kapsar. Bu teknik, sinirbilim ve rejeneratif tıp alanlarında beyin gelişimi araştırmaları için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

e18 rat brain organotipik dilim kültür

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Embriyonik kemirgen beyinleri Organotipik kesit kültürlerinde yaygın beyin gelişimi incelemek için kullanılır. Genellikle bir in vivo sistem avantajları olmakla birlikte, Organotipik dilim kültürleri bir in vivo şu anda mümkün değildir manipülasyonlar bir dizi gerçekleştirmek için izin verir. Bugüne kadar, organtotypic embriyonik beyin dilim kültürler, bireysel hücrelerin zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak takip ganglion emanances (in-utero elektroporasyon hedef zor bir bölge) genlerin ifade işlemek için kullanılmış olan, yanı sıra farmakolojik için çalışmaları. Bu video protokol sıçan embriyonik gün 18 embriyolar Organotipik dilim kültürlerin nasıl göstermektedir. Protokol, embriyoların diseksiyon, onları düşük sıcaklıkta eriyen agaroz buz üzerinde gömme vibratome gömülü beyinleri dilimleme ve nihayet kültür yemekleri filtreler üzerine dilim kaplama içerir. Bu protokol, sıçanlar ve fareler, hem de farklı embriyonik yaştan Organotipik dilim kültürleri bugünkü şeklinde de uygulanabilir.

E18 Rat Brain Organotipik Dilim Kültür

Embriyonik kemirgen beyinlerinden elde edilen organotipik kesit kültürleri, beyin gelişimini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. İn-vivo bir sistemin genellikle avantajları olsa da...

Benim adım Laura Elias. Arnold K Stein'ın laboratuvarında çalışan bir nörobilim yüksek lisans öğrencisiyim. Burada, UCSF'deki Rejenerasyon Tıbbı Enstitüsü'ndeyiz ve bugün size E 18 sıçan beyinlerinin organotipik dilim kültürünün nasıl yapılacağını göstereceğim.Bu prosedür; beyinlerin diseksiyonla çıkarılmasını, düşük erime noktalı agar içine gömülmelerini, ardından vibratomda dilimlenerek koronal kesitlerin alınmasını ve son olarak bu kesitlerin dilim kültürü sistemine yerleştirilmesini içerir. Bu dilim kültürü prosedüründe kullandığımız birkaç önemli araç ve reaktif bulunmaktadır. Beyinlerin diseksiyonla çıkarılması için bir diseksiyon mikroskobuna ihtiyacınız olacaktır.Ayrıca bu V'yi, kesitlerinizi almak için iyi bir sistem olan VT 1000 S vibram gibi kullanıyoruz. Kullanılan yapıştırıcı önemli olabilir. Beyinleri çok iyi yapıştıran bu kilit tipini kullanıyoruz çünkü bazen yanlış tipte bir yapıştırıcı kullandığınızda, kesmeye çalışırken beyinler yerinden çıkabilir ve bu durum sorun yaratabilir.Ayrıca, dilimlerimizi kültürde tutarken üzerlerine yerleştirdiğimiz şu milli cell filtrelerini kullanıyoruz ve bu da sürecin önemli bir parçasıdır. Tamam, dilim kültürü işlemine başlamadan önce halletmeniz gereken birkaç adım var. İlk olarak, A CSF hazırlamanız gerekiyor ve A CSF hazırlama işlemini bitirdikten sonra, hem soğuması için onu buz üzerine koymalı hem de karbogen ile havalandırmaya başlamalısınız.Ayrıca %4'lük agarozunuzu da hazırlamanız gerekecektir. Bunun için düşük erime noktalı agaroz kullanmalı, bunu CSF içerisinde çözmeli, mikrodalga fırında ısıtmalı ve beyinleri gömene kadar 50 °C'de tutmalısınız. Ayrıca dilim kültür medyumunu da hazırlamanız gerekir; medyum hazırlandıktan sonra, dilimleri eklediğinizde doğru sıcaklıkta olması için önceden ısınmaya başlaması amacıyla 37 °C'ye yerleştirmelisiniz.Bu noktada, araçlarınızı toplayıp dilim kültürü işlemine başlamaya hazır olmalısınız. Pekala, şimdi embriyonik 18. gün sıçan embriyolarının beyinlerinden dilim kültürleri oluşturacağız. İlk olarak, ayak parmak sıkıştırma testiyle annenin tamamen anestezi altında olduğunu kontrol edeceğim.Burada, ayağını sıktığımda sıçanın hala küçük bir refleksi olduğu ve arka bacağını biraz geri çektiği bir örnek görüyoruz. Bu nedenle ya daha uzun süre beklememiz ya da biraz daha yeniden anestezi uygulamamız gerekecek; artık herhangi bir reaksiyon görmüyoruz. Şimdi, embriyoları almak için hayvanı açmaya geçiyorum.Temiz bir kesi yapabilmek için deriyi yukarı kaldırmak istiyorum. Buradaki bazı embriyoları çıkaracağım ve onları keserek alacağım. İki embriyo arasından kesmeye başlayıp ardından boyunca devam edeceğiz.Şimdi bu embriyoyu çıkarabilir ve plasentanın hemen yanından bir insizyon yaparak onu plasentadan ayırabiliriz. Şimdi embriyoyu soğuk A CSF'ye taşıyacağız ve buradaki kesenin geri kalanını çıkaracağız. Evet, işte oradan kesiyoruz.Böylece artık bu embriyo hazır ve beyin kesitleri almaya geçeceğiz. Pekala, şu an embriyomuz elimizde ve şimdi makasla baş kısmını çıkaracağım. Tamam, şimdi beyni diseke etmeye hazırım.Öncelikle başı immobilize etmemiz gerekiyor; bunu göz çukurlarına ve arka beyne pinler yerleştirerek yapıyoruz. Bu işlem, beynin kapta immobilize edilmesine yardımcı olur. Böylece burada gördüğünüz gibi, kabımızda immobilize edilmiş bir beyne sahibiz; öncelikle arka beyne bir insizyon yaparak başlayacağız ve ardından daha rostrale doğru ilerleyeceğiz.Serebellum yakınından bir insizyon yaparak başlayacağım. Makaslarımı deri ve kafatasının altına yerleştirip insizyonumu rostral bölgeye doğru genişleteceğim. Ardından, korteksin en ucuna yakın, serum meum yakınlarında lateral olarak iki insizyon daha yapacağım.Lateral yönde o yöne doğru bir kesi ve ardından oraya bir kesi yapacağım. Daha sonra kafatasını bu şekilde soyup çıkarmak için penslerimi kullanacağım. Şu an beyni açığa çıkardık; şimdi onu kafadan bu şekilde çıkaracağım.Böylece tamamen diseke edilmiş beyinleriniz hazır. Şimdi bu beyinleri agaroz içine gömeceğiz; önceden %4'lük düşük erime noktalı agaroz hazırladım. Bunu bir CSF içinde hazırlayıp mikrodalgada ısıtın ve sıvı kalması için yaklaşık 50 derece civarında tutun.Ve şimdi gömme işlemine başlayacağım. Bu agarozdan bir miktar alıp şu kaplara koyacağım ve bu kapları neredeyse ağzına kadar dolduracağız. Tamam, böylece ilk adım, beyinleri alıp temel olarak bir agaroz kabında durulamaktır.Beyinler üzerinde fazla sıvı olmasını istemezsiniz çünkü bu durum, onların agroslara iyi yerleşmesini ve iyi yapışmasını engeller. Bu nedenle, ilk adımda onları iyi yıkamazsanız, viome üzerinde dilimlemeye çalıştığınızda agroslardan düşme eğilimi gösterirler. Bu yüzden, fazla sıvıyı uzaklaştırmak için onları sadece hafifçe çalkalıyoruz.Ardından, bu beyinleri burada gösterilen %4'lük agrozla dolu diğer kaplara aktaracağız. Şu anda beyinleri agrozların içine yerleştiriyoruz. Bu aşamada, beynin her yönden agrozla çevrelenmesi için kabın tabanına veya üstüne çok yakın olmamasına dikkat etmelisiniz.Ardından, kapağı bu kabın üzerine yerleştirip kapatacağız ve ardından ris'in sertleşmesi ve beynin agar içine düzgünce gömülmesi için bu kabı buz üzerine yerleştireceğiz; agar yaklaşık beş veya 10 dakika içinde sertleşmelidir. Tamam, şimdi beyinleri agar içine gömmüş olduk ve şimdi dilim kültürü için kullanacağımız yaklaşık 300 mikron kalınlığında kesitler oluşturmak amacıyla onları buradaki vibrotomda kesmeye başlayacağız. Bu işlemi ve daha önce yaptığımız tüm diğer işlemleri, karbogen ile havalandırılan bu soğuk yapay BOS (CSF) içerisinde gerçekleştireceğiz.Ve böylece başlamaya hazırız. Pekala, şimdi beyni agar bloğundan çıkararak başlayacağız. Burada üst kısmı çıkaracağız ve bazen agar bloğunun üstten çıktığından emin olmak için yardımcı olmanız gerekebilir.Bakalım. Şöyle, onu doğrudan alt kısma yerleştirebilirsiniz. Şimdi agarımız hazır; yapacağımız şey, temel olarak beyni çıkarmak için agarın içine kesikler atmak.Şimdi dört kesi yapacağım; birini ortadan, birini en ön kısımdan ve iki tanesini de yanlardan. Temel olarak beyni, gömdüğümüz şekliyle çıkarıyorum. Böylece insizyonları yaptık ve beynimizi bloklar halinde kestik.Böylece artık beyni temel olarak agar kalıbından çıkarabilmeliyiz. Beynimiz hemen çıktı ve agar içine gömülü durumda. Şimdi yapıştırıcıyı alıp buradaki küçük sahnenin üzerine yerleştireceğiz. Tamamdır.Şimdi az miktarda yapıştırıcı süreceğiz ve beynimizi doğrudan bu yapıştırıcının üzerine yerleştireceğiz. Temel olarak cerebellum, yani beyincik kısmı yapıştırıcıya bakacak; koku soğanı (olfactory bulb) veya rostral uç ise doğrudan yukarıya bakacak şekilde konumlandırılacaktır. Ardından bunu Vibram haznesine taşıyacağız.Şimdi beyni, kesitler alacağımız vibrotomun içine aktarıyorum. İşte başlıyoruz. Beyni vibrotoma yerleştiriyoruz ve bu şekilde sıkıca sabitliyoruz.Ardından, burada buz üzerinde tuttuğum soğuk, kabarcıklı A CSF ekleyeceğiz. Bu işlem aynı zamanda yapıştırıcının sertleşmesini sağlar ki bu da önemlidir. Böylece beynimiz vibratome içindeki plakaya sabitlenmiş olacaktır.Şimdi beyni vibratomda kesitlere ayırmaya başlayabiliriz. Buradaki fazla agarın bir kısmını temizleyeceğim. Bu yüzden sadece bir insizyon yapıp onu çıkaracağız.Şu anda beynimiz burada. Bıçağı vibratom kafasına yerleştireceğim. Bıçak buraya takılacak ve vibratoma yerleştirilecek.Ayrıca, dilimleri kestikten sonra onları alabilecek kadar büyük olması için buradaki küçük pipeti keseceğim. İşte böyle. Artık kesmeye başlamaya hazırız.Belirttiğim gibi, bunun için 300 mikronluk kesitler kullandım. Bu yüzden, sahneyi yukarı kaldırarak bıçağımızı beyne doğru hareket ettireceğiz. Tamam, şimdi önce bıçağımızı dokunun hemen öncesine konumlandırıyoruz; ilk birkaç kesik ya sadece agarda ya da belki çok yüzeysel alanlarda olacak, ancak bu işlem aslında sadece bıçağımızı konumlandırmak içindir.Titreşim yaklaşık yedide ve hızımız yaklaşık beşte. Kortikal koronal kesitler yapmak için burada kesim yapıyoruz. Beynin en rostral ucundan başlıyoruz ve şu anda aslında beynin içine henüz çok az girmiş durumdayız.Şimdi başlıyoruz. Bu ilk kesitimiz, ancak şu an oldukça rostral bir konumda. Bu yüzden elimdeki kesitleri tutmaya devam edeceğim.Kesitler çıktıkça, onları ayağımla alıp oda sıcaklığındaki, kabarcıklanan A CSF içerisine yerleştiriyorum. Embriyonik beyinlerle çalışırken her şeyi daha soğuk tutmak için bu bölmeye buz eklemek de opsiyoneldir. İlk buz kültürü.A CSF buz gibi olduğu sürece mükemmel bir şekilde hayatta kaldıkları görülmektedir. Ancak diğer deneyler için veya beyin dokularınız biraz daha eskiyse, her şeyi son derece soğuk tutmak amacıyla haznenize buz eklemek isteyebilirsiniz. Böylece şu an dilimlerimiz fıkırdayan A CSF içerisinde yer almaktadır.Burada yaklaşık bir saate kadar kalabilirler, ancak onları doğrudan dilim kültür sistemimize de yerleştirebiliriz. Tamam, şimdi hazırladığımız dilimleri inkübe edebilmek için kapları ve kültür sistemini hazırlamaya hazırız. Bunun için bir adet altı kuyucuklu plaka alacağız.Ve bu kuyucukların her birine, önceden hazırladığımız ve 37 °C'ye ısıttığımız dilim kültür ortamından yaklaşık 1,5 mL koyacağız; her bir kaba yaklaşık 1,5 mL. Ardından filtrelerimi alacağım. Aslında beyin kesitlerini bu filtrelerin üzerine yerleştireceğiz, ancak öncesinde bu filtreler buradaki ortamın üzerine gelecek.Şimdi filtreleri, kurtulmak istediğiniz medyumun üzerine yerleştireceğiz ve kabarcıkları en azından kenara çekeceğiz. Filtrenin altında kabarcık kalmasını istemezsiniz. Bu filtreler, dilimlerin temel olarak boğulmamaları için havaya maruz kalmaya devam ederken medyumdaki besinleri emmelerini sağlar.Şu an filtrelerimiz kapta ve kesitlerimizi alıp filtrelerin üzerine aktarmaya hazırız. Kesitlerimiz burada, bu kabın içinde ve A CSF'nin çoğunu uzaklaştırdım. Şimdi, kesitleri temel olarak A CSF'den çıkarıp kesit kültür ortamına aktarmak istediğimiz için, kültür ortamını hızla eklemek istiyorum.Şimdi, kesitlerime buraya kültür ortamı ekleyeceğim. Kesitlere çok fazla zarar vermemek için bunu nazikçe yapmaya çalışacağım. Artık kesitlerim kültür ortamı içerisinde ve şimdi onları buradaki üç filtreye aktarmak istiyorum.Şimdi pipetimi kullanarak kesiti alacağım ve filtre üzerine yerleştireceğim. Aynı filtreye birkaç kesit koyabileceğiniz gibi, isterseniz sadece tek bir kesit de koyabilirsiniz. Ben bu filtreye birkaç kesit yerleştireceğim.Ardından, aktardığınız bu fazla medyumu buradan uzaklaştırmak önemlidir. Bu nedenle, kesitlerle birlikte aktardığım fazla medyumu temel olarak buradan alacağım; çünkü bu kaplarda çok fazla medyum istemezsiniz, aksi takdirde kesitler medyumla kaplanır ve yeterli oksijen alamayacakları için bekledikleri kadar uzun süre dayanmazlar. Böylece fazla medyumu uzaklaştırmış oldum ve şu an kesitlerim bu kabın içinde duruyor, inkübatöre girmeye hazırlar.Pekala, artık bu kesitler 37 °C'lik inkübatöre yerleştirilmeye hazırdır. Beş ila yedi gün boyunca uygun durumda kalacaklardır. Ayrıca, yaklaşık her üç günde bir medyanın yarısını değiştirip yerine yeni medya ekleyerek medya değişimi yapıyoruz.Şimdi bu kültürleri inkübatöre yerleştireceğim. Tamamdır, bu kadar. Hepsi bitti.Bu tekniği laboratuvarımızda, progenitör bölünmeleri ve nöronal migrasyon da dahil olmak üzere kortikal gelişimin çeşitli yönlerini incelemek için kullanıyoruz. Bu teknik, özellikle time-lapse mikroskobu ile birlikte kullanıldığında oldukça faydalıdır; böylece dilim kültürünüzdeki hücrelerin bölünmesini ve göç etmesini bireysel olarak takip edebilirsiniz.

organotypic-slice-culture-of-e18-rat-brains

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Organoptypic hipokampal kesit kültürü...

Nöronal Sakatlık incelenmesi için Organotipik Hipokampal Dilim Kültür Modeli

Bu protokol, postnatal beyin ve rostral göçmen akışı neuroblast göç yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için optimize edilmiş bir Organotipik dilim tahlil açıklamaktadır.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Bu piramidal nöronların elektriksel kayıtlar yapma amaçlı bir Organotipik kültür neokortikal dilim hazırlama hazırlamak ve sürdürmek için bir protokoldür.

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

E12.5 fare embriyonik Ortabeyin Organotipik dilimler oluşturmak için bir yöntem açıklanmıştır. Organotipik dilim kültürleri dopaminerjik nöronlar veya diğer ventral orta beyin nöronları davranışını gözlemlemek için kullanılabilir.

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

Serebral kortekse bir gelişme genlerin işlevine hızlı bir değerlendirme yapmak için, ilgili yöntemler...

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

Bu video, bir sıçan yavrusunun beyninden organotipik hipokampal dilim kültürleri hazırlamak için bir yöntem göstermektedir. Hipokampal dilimlerde hücre canlılığını ve büyümesini teşvik etmek için gerekli olan hipokampusun diseksiyonu, dilimleme ve kültür koşullarında yer alan adımları ana hatlarıyla belirtir ve sonuçta organotipik dilim kültürleri oluşturur.

Bir Sıçan Yavrusunun Hipokampusundan Organotipik Dilim Kültürlerinin Hazırlanması

Video, bir sıçan yavrusunun beyninden rinal korteks-hipokampus dilimleri elde etmek ve bunları daha fazla analiz için ortamla doldurulmuş çok kuyulu bir plaka içinde zarlı ekler halinde kültürlemek için bir yöntemi göstermektedir.

Bir Sıçan Yavrusu Beyninden Rhinal Cortex-Hipokampus Dilimlerinin Hazırlanması

Ön beyin ve beyincik dilim kültür sistemini kullanarak NG2 hücrelerini ve oligodendrositleri incelemek için bir teknik açıklanmıştır.  Bu yöntem, doku sitomimarisini korurken hücre dışı ortamın kolayca manipüle edilebildiği oligodendrosit soyu içindeki hücrelerin çoğalma ve farklılaşma dinamiklerinin incelenmesine izin verir.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Bu yöntem, yetişkin nöron in vitro müdahale edilebilmesini sağlar ve kültürlenmiş hipokampus farmakolojik maddelerin doğrudan uygulama için izin verir.

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Fare ön beyninin organotipik dilim kültürlerinde genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı sensör ATeam1.03YEMK'ın hücre tipi spesifik ekspresyonu için bir protokol tanımladık. Ayrıca, nöronlar ve astrositlerde hücresel ATP düzeylerinin dinamik görüntülemeiçin bu sensörünasıl kullanılacağını gösteriyoruz.

FRET tabanlı Sensör ATeam1.03YEMK kullanılarak Fare Beyninin Organotipik Doku Dilimlerinde Hücre İçi ATP'nin Görüntülenmesi

Burada, renal korteks-hipokampus organotipik dilimlerin hazırlanmasını anlatıyoruz. Serumun kademeli ve kontrollü yoksunluğu altında, bu dilimler gelişen epileptik benzeri olayları tasvir eder ve epileptogenezin ex vivo modeli olarak kabul edilebilir. Bu sistem, spontan aktivitenin dinamiklerini izlemek ve epileptogenez boyunca nöroinflamatuar özelliklerin ilerlemesini değerlendirmek için mükemmel bir aracı temsil eder.

Renal Korteks-Hipokampus Organotipik Dilim Kültürlerinde Epileptogenez Modeli

Öğrenin, E18 sıçan beyni organotipik dilim kültürü hazırlama yöntemini. Disseksiyon, agaroz gömme, vibratom kesimi ve kültür bakımı adımlarını kapsar. Bu teknik, sinirbilim ve rejeneratif tıp alanlarında beyin gelişimi araştırmaları için temel oluşturur.

E18 Rat Brain Organotipik Dilim Kültür

Daha fazla video keşfet