Western Blot: Numune Hazırlama Algılama

Bu prosedürün genel amacı, uygun ürünleri kullanırken bir Western lekesi gerçekleştirmenin kolaylığını göstermektir. Numune hazırlandıktan sonra, proteinler boyutlarına göre ayrılır ve daha sonra katı bir faza aktarılır. Proteinler daha sonra antikorlarla incelenir ve uygun protokollerin kullanımı tespit edilir ve yüksek kaliteli, uygun maliyetli reaktifler, gelişmiş western blotlama sonuçları üretir.

Merhaba, ben Jesse Luhan, San Diego, California'daki EMD Chemicals'ta r ve d bilim adamıyım. EMD, Almanya'nın Dharm stat kentinde bulunan Merck, KGAA'nın bir iştirakidir. Bugün size bir batı lekeleme prosedürü göstereceğiz.

Öyleyse başlayalım. Western blotlamada ilk adım numune hazırlamadır. Yerçekiminin 2.500 katı basınçta beş dakika gibi düşük hızlı santrifüjleme kullanarak hücreleri peletleyerek numune hazırlamaya başlayın.

Santrifüjlemeyi takiben hücre peletlerini boşaltın. Altı hücreye 10 başına 150 mikrolitre kullanarak hücreleri cyto buster protein ekstraksiyon reaktifinde yeniden süspanse edin. Numuneyi oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Daha sonra, santrifüjlemeyi takiben numuneyi dört santigrat derecede yerçekiminin 16.000 katında beş dakika döndürün. Temizlenmiş SNA'yı yeni bir tüpe aktarın ve analize devam edin. Numunenin protein konsantrasyonu değerlendirildikten sonra, proteini denatüre etmek için numuneyi jeli yüklemeye hazırlayın.

Sodyum doil sülfat veya SDS gibi onik denatüre edici bir deterjan içeren bir numune tamponu kullanın. Karışımı 95 ila 100 santigrat derecede beş dakika kaynatın. Ticari olarak temin edilebilen bir prekast jel kullanılarak, proteinler moleküler ağırlığa göre hızlı bir şekilde ayrılabilir.

Elektroforez ünitesini, Omni PU kimyasal hattı aracılığıyla sunulan reaktiflerden yapılabilen çalışma tamponu ile doldurun. Kuyunun ilk şeridini iz karışımı protein işaretleyicisi ile yükleyin. Bu işaretleyici, elektroforez sırasında izlemeye izin veren üç referans bandına sahiptir.

Jel lekelendikten sonra, 10 ila 225 kilo Dalton arasında değişen 10 bant görünür. Denatüre edilmiş numuneyi kalan kuyucuklara yükleyin. Jeli bir saat boyunca 220 voltta çalıştırın.

Proteinler ayrıldıktan sonra, proteinlerin DS kullanmaya hazır olmayan hızlı leke ve ultra hassas boya kullanarak eşit ve homojen bir şekilde göç ettiğinden emin olmak için jeli kumasi mavisi ile boyayın. Boyama gereklidir, tıpkı elektrik yüküne sahip proteinlerin bir elektrik alanındaki bir jelden geçmeye teşvik edilebilmesi gibi, proteinler bir elektrik alanında jelden NITROSELÜLOZ veya PVDF gibi bir zara aktarılabilir. PVDF membranları kullanırken, membranı birkaç dakika metanol içinde bekletin, ardından beş dakika boyunca buz gibi soğuk transfer tamponunda bir dengeleme yapın. Ayrıca jeli buz gibi soğuk transfer tamponunda birkaç dakika bekletin, E dengesi transfer sırasında jelin büzülmesini önler.

Islak bir transfer için, sünger ve kağıt arasına jel ve zardan oluşan bir sandviç monte edin. Ardından, jel ve zar arasında hava kabarcığı oluşmadığından emin olduktan sonra düzeneği sıkıca birbirine kenetleyin. Sandviçi transfer tamponuna batırın ve bir elektrik alanı uygulayın.

Negatif yüklü proteinler, pozitif yüklü elektrota doğru hareket edecektir. Zar daha sonra onları durdurur, bağlar ve devam etmelerini engeller. Transfer tamamlandıktan sonra, hava cebi olmadan eşit transferi sağlamak için proteinleri görselleştirin.

Bu, kırmızı alarm Western blot boyası ile kolayca yapılabilir. Bu leke kullanıma hazırdır ve su ile kolayca lekelenme işlemi yapılabilir. Bu, zarın antikor ile kanıtlanabilmesi için su ile yıkanarak lekelendikten sonra jeldir, zar bloke edilir.

Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için, zarı yüksek kaliteli bloke edici reaktiflerle bloke edin. Hafif çalkalama altında oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici çözelti içinde inkübe ederek artan bir arka planı önlemek için, inkübasyondan sonra zarı TBST veya PBST'de üç kez yıkayın. Bu tamponlar, sırasıyla TBS ara tabletleri ve PBS ara tabletleri kullanılarak kolay ve rahat bir şekilde yapılabilir.

Membran bloke edildikten ve yıkandıktan sonra, birincil antikor ile inkübe edilebilir. Birincil antikoru, sinyalin önemli ölçüde arttırılmasını sağlayan sinyal artırma solüsyonundan birini kullanarak uygulayın. Primer antikoru birinci solüsyonda hazırlayın ve zarı bir saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra başka bloke edici ajanlar eklemeye gerek yoktur. Membranı TBST ile yıkayın. Daha sonra, zarı, sinyal artışının ikinci çözeltisinde seyreltilmiş ikincil antikor ile bir saat boyunca inkübe edin.

Son olarak, konjuge HRP için membranı TBST ile birkaç kez tekrar yıkayın. Gelişmiş kemilüminesans veya ECL ile ikincil antikorların tespiti geleneksel olarak burada kullanılır. ECL reaktifi hızlı adımı, luminol veya güçlendiricinin karıştırılmasını gerektirmediği için kullanılır.

Membranı birkaç kez püskürtün, iki dakika inkübe edin ve x-ışını filmi kullanarak geliştirin. Rapid Step, düşük pikogram hassasiyetinin yanı sıra alt tabaka eklendikten sonra iki saate kadar daha hafif bir görev sunar. Trail mix protein belirteçleri, standart Western blot protokolleri ile karşılaştırıldığında elektroforez sırasında protein takibine izin verir.

Signal Boost, daha fazla dinamik aralık ve hassasiyet sağlar. Son olarak, geleneksel ECL reaktifleri yerine Rapid step kullanılarak üstün hassasiyet elde edilebilir. Size kapsamlı bir ürün yelpazesiyle Western körlemeyi verimli ve uygun maliyetli bir şekilde nasıl gerçekleştireceğinizi gösterdik.

Sonuçlarınızın kalitesinin reaktiflerinizin kalitesine bağlı olduğunu unutmayın. Bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.