E16 Rat Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

Merhaba, benim adım William Ti. Arnold Creek Stein Laboratuvarı'ndan geliyorum. Bugün, ben ve diğer çalışma arkadaşlarım size E 16 sıçan embriyolarına yapılan intrauterin enjeksiyonu göstereceğiz. Merhaba, benim adım Laura Elias.

Bugün sizlere mikroenjeksiyon pipetlerinin nasıl hazırlanacağını ve bugün gerçekleştireceğimiz intraventriküler enjeksiyonlar ile elektroporasyon için pipetlerin nasıl doldurulacağını göstereceğim. Ayrıca, E16 sıçan embriyolarında intraventriküler enjeksiyonların ve elektroporasyonun nasıl yapılacağını da göstereceğim. Sıçanlarda utero içi enjeksiyonlar ve elektroporasyon özellikle yararlıdır; çünkü sıçan, genetik manipülasyonların kolayca yapılamadığı bir sistemdir.

Tamam, bu işlem için kullandığımız bir dizi cerrahi alet bulunmaktadır. Bir freer, bir çift adson pensi (biri tırtıklı, diğeri ucunda küçük bir dişi olan) ve bir çift hemostat kullanıyoruz.

Bu bir makastır ve ardından bu iki zımbayı kullanıyoruz. Bunlardan büyüğü sıçanlar için kullandığımızdır. Diğeri ise fareler için kullandığımız daha küçük olanıdır; biri 7 numara zımba kullanır, diğeri ise 9 numara zımba kullanır ve her ikisi de yaylıdır.

Cerrahi işlemlere yardımcı olmak için burada kullandığımız bazı araçlar arasında, çift başlıklı basit bir fiber optik ışık kaynağı bulunmaktadır. Ortamı sıcak tutmak için içinden sıcak su sirkülasyonu yapan ısıtmalı bir ped kullanıyoruz. Çalışma yüzeyi için ise BTX tarafından üretilen bu elektroporasyon sistemini kullanmaktayız.

Embriyoların büyüklüğüne göre kullandığımız birkaç farklı boyutta spatula bulunmaktadır. Mavi taraf pozitif taraftır. Tamam, şimdi enjeksiyon pipetlerimizi eğimli hale getireceğiz.

Bu durum oldukça önemlidir; pipetinizin DNA'yı yükleyebilmeniz için yeterince geniş bir açıklığa sahip olması, ancak aynı zamanda enjeksiyon sırasında embriyoya zarar vermemesi için çok keskin olması gerekir. Enjeksiyon sırasında embriyoya zarar verirseniz, çok daha yüksek bir mortalite oranıyla karşılaşırsınız ve bu da istenmeyen bir durumdur.

Bu, bu cerrahi işlemde aslında çok önemli bir süreçtir. İlk olarak, burada dönmekte olan pah kırma taşına biraz su dökeceğiz. Ardından, şuradan, sadece bir çubuk alacağız.

Şimdi az önce çektiğimiz pipeti bir çubuğun üzerine bantla sabitleyeceğiz. Pipeti belli açıya getirmek ve burada sabit tutmak için bu mikromanipülatörlerden birini kullanacağız. Cihazı yerleştireceğiz ve pipetin ucunu görüntülemek için mikroskoptan yararlanacağız.

Ardından, biraz basınç oluşması için parçayı suyun içine, daha önce hazırlanan eğimin tam üzerine yerleştireceğiz. Ucun taşa doğru baskı yaptığını görebilirsiniz. En az 15 dakika boyunca eğim oluşturmasına izin verin.

Onları, bilirsiniz, bir saat boyunca bile bekletmeyi severim. Bazen gerçekten çok keskin hale gelirler, ancak pipetlerin ne kadar süre boyunca eğimlendirileceği kesinlikle kişiden kişiye değişir. Tamam, burada yukarıda, çekilmiş ancak henüz eğimlendirilmemiş bir pipet görebilirsiniz.

Böylece, ucu keskin olsa da DNA'nızı yükleyebileceğiniz herhangi bir açıklığa sahip değildir. Şimdi ise alt pipetin ucu eğimlendirilmiş; bu güzel açılı açıklığı görebilirsiniz. Bu, DNA'nızı yüklemenize olanak tanır, ancak herhangi bir hasar yaratmadan enjeksiyon yapabilmeniz için ucu hâlâ keskindir. Tamam, şimdi enjeksiyon pipetlerini DNA ile dolduracağız.

Bu nedenle, DNA'nızı enjekte ederken herhangi bir lipopolisakkarit enjekte etmemek için DNA'nızı endotoksin içermeyen bir şekilde hazırlamanız önemlidir. Şimdi DNA'mızı alacağız ve burada parafilmi hazır hale getireceğiz. Burada parafilminizi hazırlayacak ve DNA'nızı toplayıp bu parafilmin üzerine küçük bir nokta şeklinde yerleştireceksiniz.

Ardından, genellikle 1,5 ila 1,7 µg/µL konsantrasyonda kullandığım DNA'mın her 10 µL'si için yaklaşık 1 µL fast green boya ekliyorum. Bu işlem, enjeksiyon bölgemizi belirlememize ve ventriküle başarılı bir şekilde enjekte ettiğimizden emin olmamıza yardımcı olur.

Ardından, bu hızlı yeşil boyayı DNA ile karıştıracağım. Sonra, enjeksiyon elektrodunu alıp pistonu geri çekerek pipeti dolduracağız. Burada görebileceğiniz üzere, eğer pipet doğruysa ve yeterince büyük bir açıklığa sahipse, DNA oldukça kolay bir şekilde yüklenecektir.

Sürekli olarak pistonu ileri geri hareket ettirerek doğru şekilde yüklenmesine yardımcı olmanız gerekebilir. Ardından pipeti bu şekilde doldurabilirsiniz. Böylece DNA'yı pipete tamamen yüklemiş olduk ve enjeksiyona hazır hale getirdik.

Tamam, şimdi hayvanı anesteziye alacağım. Bu dek capi konilerini kullanıyoruz. Tutmayı kolaylaştırmak için kenarını şöylece geriye doğru kıvırıyorum.

Öyleyse başlayalım. Genellikle, onun içine girebilmesi için şu şekilde kafesin kenarına güzel, küçük bir tünel yapacak şekilde yerleştiririm. Tamam, bu hayvan yatmış görünüyor.

Bunu doğrulamak için bir ayak parmağı sıkıştırma testi yapacağız; sadece parmağı tutup iyice sıkıştırmanız yeterlidir. Çok sert yapmayın. Hayvana zarar vermek istemezsiniz, sadece uyuduğundan emin olmanız gerekir.

Ve bu hayvan kesinlikle etkisiz hale geldi. Bu yüzden karnını tıraş edeceğim. Meme uçlarının uçlarını kesmemek için onlardan kaçınmak istiyorum.

Bunun hayvan için çok ağrılı olabileceğini düşünüyorum. Bu nedenle hayvan tıraş edilir. Şimdi onu çekerende (steril kabin) çalışmaya alacağım.

Hayvanı yıkayıp prosedüre başlayacağız. Tamam, hayvanın tekrar uyutulduğunu teyit ettik ve önce onu yıkamaya hazırız. Şimdi her bir göze, kurumayı önlemek için biraz göz pomadı sürmek istiyorum.

Ardından, alkollü temizleme pedleri ve iyotlu pedlerle dönüşümlü olarak yıkama işlemi gerçekleştireceğiz. Bu işlemi üç kez, yani üç kez dönüşümlü silme şeklinde yapıyoruz. Bunu yaparken embriyolara zarar vermemek için çok nazik olmalısınız.

Yani sadece düz aşağıya doğru kaydırmak, sadece düz geri çekmek istiyorsunuz. Birincisi bu. Silme işlemlerini yapabilmem için önce onu iyice ıslatmam gerekiyor. Güzel.

Bu iki, bu da üç oldu. Tamam, sterilizasyona yardımcı olması için kapağı kapattık ve şimdi hayvanı açma işlemine geçiyorum. Hadi keselim.

Pekala, öncelikle yapmam gereken şey steril eldivenleri giymek. Steril eldivenleri giydik ve burayı açmaya hazırız. Hayvanın hâlâ anestezi altında olduğundan her zaman emin olmak isteriz.

Şimdi bir ayak parmağı sıkıştırması daha yapacağım ve prosedür boyunca bunları uygulamaya devam edeceğiz. Genellikle yaptığım işlem, dokudan küçük bir parçayı sıkıştırmaktır. Hızlı bir insizyon yaparım, üstten kavrar ve aşağı doğru keserim, ardından diğer forseps çiftini tutup dokuyu birbirinden ayırırım.

Ardından istediğiniz kası tutun, herhangi bir damara veya sinire zarar vermemek için tam orta hattan kesin. Yanlış yeri tutmamaya dikkat edin. Evet, burada güzel bir verim elde etmiş görünüyoruz.

Kurumasını önlemek için iyice yağlandığından emin olmak istiyorum. Her şeyin yolunda olduğundan emin olmak için bir token daha ekleyeceğim ve görünüşe göre hazırız. Bunları her zaman Laura için şu şekilde konumlandırırım; genellikle yaptığım şey veya her zaman yaptığım şey, tekdüzelik sağlamak adına embriyonun başını anne sıçanın sağ tarafına gelecek şekilde yerleştirmektir.

Ve şimdi başlıyorum. Burada embriyoyu görebiliyoruz. Burada kuyruğu ve arka lensi, daha yukarıda ise başı görebiliyoruz.

Burada bu embriyonun başına bakıyoruz. Koyu renkli çizgi şeklinde olan orta hattı görebilirsiniz. Sol hemisferi ve sağ hemisferi, ayrıca bir arka beyni de görebilirsiniz.

Şimdi enjeksiyonla sol hemisferi hedefleyeceğim. Pipetle enjekte ediyorum, biraz geri çekiyorum ve boyayı enjekte ediyorum. Gördüğünüz gibi, boya şu an sol lateral ventriküle yayılıyor.

Ve böylece bu, başarılı bir enjeksiyon gibi görünüyor. Pekala, şimdi ventriküllerin güzelce dolduğunu görüyoruz. Boya aslında sol ventrikülden sağ ventriküle geçti.

Böylece her iki ventrikülde de D ve DNA'ya sahip olduk. Bu noktada, elektroporasyon elektrotlarını alıp pozitif elektrot sol tarafa gelecek şekilde beynin karşılıklı taraflarına yerleştireceğim. Böylece DNA, progenitörlere ve sol hemisferin kortikal duvarına girecektir.

Ve şimdi akımı geçiriyorum. Elektrik akımını geçirmeye başladığımızda, elektrodun negatif ucunda bazı köpükler gördüğünüzü fark edersiniz. Bu durum, doğru kontakları kurduğunuzu onaylayan rahatlatıcı bir belirtidir.

Tamam, embriyolara elektroporasyon uyguladığımıza göre, şimdi onları geri yerleştirip dikişle kapatacağım. Şimdi ona 10 ml antibiyotikli cerrahi suter vereceğim. Blok dikiş kullanmayı tercih ediyorum.

Bundan sonra, cilt zımbalayıcı ile cildi zımbalayacağız. Tamam mı? Tamam. Uyandığında herhangi bir ağrı çekmemesini sağlamak için ona bir doz buprenorphine verdim. Şimdi onu inkübatöre koyacağım; böylece uyanırken sıcak kalmasını sağlayacak ve hipotermi yaşamadığından emin olacağız.

Tamam, böylece size uterus içi, intraventriküler enjeksiyonların ve elektroporasyonun nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Sıçanlarda birçok farklı madde enjekte edebilirsiniz. Lentivirüs veya retrovirüs dahil olmak üzere bir virüsü doğrudan ventrikül içine enjekte edebilirsiniz.

Bu durumda, virüs hücrelere entegre olacağı için elektroporasyon yapmanıza gerek kalmayacaktır. Bugün yaptığımız gibi plazmit DNA plazmitleri enjekte ederseniz, plazmitlerin ventrikül duvarını döşeyen hücrelere girmesini sağlamak için elektroporasyon gerçekleştirmeniz gerekecektir. Dolayısıyla, bu vektörleri birçok farklı olasılık için kullanabilirsiniz.

Bunları sadece hücreleri takip etmek ve GFP eksprese etmek için kullanabilir, böylece bu öncül hücrelerin bölünmesini ve göçünü izleyebilirsiniz. Bu vektörleri hücreleri manipüle etmek için de kullanabilirsiniz; böylece shRNA saç tokası yapıları eksprese edebilir ve böylelikle spesifik genleri susturabilirsiniz.

Ayrıca belirli genleri aşırı ifade edebilir ve bu sayede elektroporasyon yaptığınız veya virüsle enfekte ettiğiniz hücreleri manipüle edebilirsiniz. Bu, ilgilendiğiniz süreçte belirli proteinlerin rolünü incelemek için oldukça güçlü bir teknik olabilir. Özellikle sıçanlarda genetik manipülasyonların farelerde olduğu kadar kolay yapılamaması nedeniyle, bu yöntem sıçan çalışmaları için çok önemlidir.