Name: Frekans Bileşenleri kullanarak bir İyon Kanal IV Eğrisi, Rekapitülasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Öğrenin, frekans bileşenleri kullanarak iyon kanallarının IV eğrisini elektrofizyolojide eş zamanlı ölçmek için bu yenilikçi yöntemi. Farmakolojik ajan kullanmadan çoklu kanal tiplerini analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Dr. Poelzing verilen Sağlık hibe sayısı R21-HL094828-01 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.

1. Gürültü Fonksiyon ve Giriş Sinyali hazırlayın <ol><li> Istenilen frekans bileşenleri içeren bir gürültü işlev oluşturun. Bu frekans alanında istenilen frekans bileşenleri açıklayan ve daha sonra ters hızlı Fourier dönüşümü hesaplanması yapılabilir. Bu çalışmada, 1 - 15 kHz kullanılmıştır. Tüm Fourier dönüşümleri ve bu çalışmada açıklanan ters Fourier dönüşümleri Matlab'ın FFT ve IFFT fonksiyonları kullanılarak hesaplandı. </li><li> Uygun gürültü fonksiyonunun genliği Ölçeği. Bu çalışmada gürültü fonksiyonu sıfır gürültü fonksiyonunun genlik zirve için 50 veya 100 mV olduğu gibi yaygınlaştırılmıştır. </li><li> Kullanılan kazanım yazılım için uygun yöntemler kullanılarak bir uyarıcı dosya oluşturun. Clampex 8 için ilk önce uygun bir başlık ile bir metin dosyası oluşturun. Başlığın altında, tek bir süpürme için ilk sütunda zaman artışlarla yerleştirin. Zaman artışlarla ölçümlerinde kullanılan örnekleme aralığı aynı zamansal aralık olmalıdır. Gerilim adım protokolü her süpürme için her zaman bir adım istenen tam gerilim yerleştirin. Bu gürültü fonksiyonu içermelidir. </li></ol> 2. Gerilim Kelepçe Ölçümleri gerçekleştirin <ol><li> , Daha önce oluşturulan uyaran dosya ile uyumlu satın yazılım içinde bir ölçüm protokolü oluşturun. Clampex, kullanıcı mevcut protokolü ile bir uyarıcı dosya ilişkilendirmek için izin veren bir menü var. </li><li> Ölçüm ekipmanı hücreli bir model (ya da biyolojik) takın. </li><li> Planlandığı gibi deney yapın. Kontrol amaçları için, herhangi bir gürültü fonksiyonları içermez periyodik ölçümler dahil ettiğinizden emin olun. </li></ol> 3. Mesaj Deney Analizi <ol><li> Bireysel bir kayıt için IV eğrisi hesaplayın. Kayıt gürültü fonksiyonu uygulanan kararlı hal ise, IV eğrisi zamansal gürültü fonksiyonu aralığının dışında kayıt kararlı bir duruma kısmını kullanarak oluşturulabilir. Kayıt kararlı durum değilse, gürültü işlevi IV eğrisi hesaplama engel olabilir, gürültü fonksiyonu olmadan ikinci bir kayıt yapılmalıdır. </li><li> Hızlı Fourier dönüşümü gürültü fonksiyonu eklenmiş kayıt kısmı gerilim bir kayıt her adım için hesaplar. Amxn m FFT frekansları sayısı matris, ve n her bir gerilim adım için Fourier dönüşümü birleştirin gerilim adımları sayıdır. Bu yapılandırmada, matris her satır, tek bir frekans genlik deneyde tüm gerilim adımları temsil eder. </li><li> Her frekans için (yani Yukarıdaki matris her satır) 3.1 oluşturulan IV eğrisi ile satır korelasyon korelasyon katsayısı kaydedin. </li><li> IV eğrisi ile son derece ilişkilidir frekansları görselleştirmek için korelasyon katsayısı vs frekans çizilir. DC bileşeni FFT ilk frekansı içinde yer olduğundan, bu frekans için korelasyon katsayısı her zaman&gt; 0.99 olmalıdır. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Temsilcisi voltaj kelepçe ölçümleri olmadan (Şekil 1A) ve gerilim adım protokolü içine yerleştirilir (Şekil 1B) bir gürültü fonksiyonu ile bir model hücre için gösterilmiştir. IV eğrisi modeli hücre (Şekil 1C) hesaplandı. Her süpürme, Şekil 1 kayıtları, FFT gürültü fonksiyonu takılı olduğu zaman diliminde (Şekil 1A, 1B kırmızı kutuya bakın) üzerinden hesaplanmıştır. Şekil 2A ve 2B sırasıyla Şekil 1A ve 1B gösterilen kayıtları için hesaplanan FFTs göstermektedir. DC bileşeni (kırmızı vurgulanmıştır) görsel inceleme üzerine, IV eğrisinin şekli taklit etmek için görünür. Gürültü fonksiyonu olmadan, DC yukarıdaki tüm frekansları genlikleri sıfır (Şekil 2A) yakın olduğu görülmektedir. Gürültü fonksiyonu takıldığında, 1 ve 15 kHz frekansları arasında görsel fark genlikleri (Şekil 2B). Şekil 3 IV eğrisi karşı gerilim adımları aralığında ayrı frekans genlikleri ilişkilendirme sonucu gösterir. Şekil 3A-C, deney, kontrol koşulları (gürültü fonksiyonu) altında ve sırasıyla 50 ve 100 mV gürültü genlikleri ile yapıldı korelasyon katsayıları gösterir. Bildirim, tüm durumlarda DC bileşeni IV eğrisi ile ilişkilendirmek için neredeyse mükemmel bir şekilde görünür. Gerçekten de, tüm kayıtlar için, bu frekans için korelasyon katsayısı 0.99 (R = 0,9996 ± 1E-5, ortalama ± standart sapma) daha fazlaydı. Şekil 3A (kontrol koşulları) baktığınızda, amplitüdünün IV eğrisi ile ilişkilidir DC bileşeni dışında herhangi bir frekansları vardır. Özellikle, bu frekansları hiçbiri 0.5 daha yüksek korelasyon katsayıları var. Düşük genlik gürültü fonksiyonu (50 mV) takılması üzerine, bu aynı frekansları hala korelasyon katsayıları 0.5 'den daha az oldu. Için korelasyon katsayılarıgürültü genlik 100 mV arttı se frekansları da 0.5 'den büyük haline vermedi. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Model Hücre Kayıtlar: Gerilim kelepçe kayıtları olmadan (1A) ve gerilim adım protokolü (1B) bir gürültü fonksiyonu ile bir model hücre için gösterilmiştir. Her süpürme ilk ve son 20 ms için, potansiyel tutma potansiyeli (0 mV) tutuldu. Her gerilim adım 80 ms uzun ve gürültü fonksiyonu adım başladıktan sonra 40 ms yerleştirildi. 30 ms gürültü fonksiyonu bir süre vardı ve 1 ile 15 kHz arasındaki frekansları içeren. Gerilim, fro, 5 mV artışlarla -150 ile +50 mV adım oldu. Model hücre için bir IV eğrisi de (1C) gösterilir. Kayıtları okumak için daha kolay hale getirmek için, sadece her beşinci süpürme 1A ve 1B dahil edildi, ancak tüm tarama 1C dahil edildi. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Kayıtların FFT: FFT gürültü fonksiyonu (kırmızı kutu Rakamlar 1A, 1B ile sınırlı alan) eklenecek her süpürme 30 ms kısmı için hesaplanan oldu. Şekil 2A ve 2B FFTs sırasıyla gürültü fonksiyonu olmadan ve hesaplanan göstermektedir. Bir kez daha, netlik, her beşinci süpürme sadece FFT resimde dahil, ancak tüm tarama gelecek hesaplamaları kullanılmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 IV Frekans Korelasyonlar: bir kayıt IV eğrisi ve gerilim adımları aralığında bireysel frekansları genliği arasındaki korelasyon sonuçları gösterilir. Rakamlar 1A - 1C sırasıyla kontrol şartlar altında 0 - 20 kHz frekansları, ve 50 veya 100 mV gürültü fonksiyonlarının varlığı korelasyon katsayısı, göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 IV Eğrisi Yeniden Oluşturma: IV eğrisi modeli hücre (Şekil 1C olarak aynı) ve iki frekans büyüklüğü üst üste edildi. Ilk frekans DC bileşen (R = 0.995), ve düşük korelasyon (R = 0,3212) ile ikinci, rastgele seçilmiş bir frekans oldu. IV eğrisi yaklaşık olarak aynı genlik frekans genlikleri ölçekli edildi.

<ol><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., Agnew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mu%5Dl+Na%2B+channels+expressed+transiently+in+human+embryonic+kidney+cells%3A+Biochemical+and+biophysical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">mu]l Na+ channels expressed transiently in human embryonic kidney cells: Biochemical and biophysical properties.</a> Neuron. 8, 663-676 (1992).</li>
<li>Abriel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Arrhythmogenic+Mechanism+Revealed+by+a+Long-QT+Syndrome+Mutation+in+the+Cardiac+Na%2B+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Novel Arrhythmogenic Mechanism Revealed by a Long-QT Syndrome Mutation in the Cardiac Na+ Channel.</a> Circ Res. 88, 740-745 (2001).</li>
<li>Giles, W. R., Imaizumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+potassium+currents+in+rabbit+atrial+and+ventricular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of potassium currents in rabbit atrial and ventricular cells.</a> J Physiol. 405, 123-145 (1988).</li>
<li>Lee, K. S., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+calcium+channel+blockade+by+verapamil%2C+D600%2C+diltiazem+and+nitrendipine+in+single+dialysed+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of calcium channel blockade by verapamil, D600, diltiazem and nitrendipine in single dialysed heart cells.</a> Nature. 302, 790-794 (1983).</li>
<li>Ozdemir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Inhibition+of+Na%2FCa+Exchange+Results+in+Increased+Cellular+Ca2%2B+Load+Attributable+to+the+Predominance+of+Forward+Mode+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Inhibition of Na/Ca Exchange Results in Increased Cellular Ca2+ Load Attributable to the Predominance of Forward Mode Block.</a> Circ Res. 102, 1398-1405 (2008).</li>
<li>Zhang, S., Zhou, Z., Gong, Q., Makielski, J. C., January, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Block+and+Identification+of+the+Verapamil+Binding+Domain+to+HERG+Potassium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Block and Identification of the Verapamil Binding Domain to HERG Potassium Channels.</a> Circ Res. 84, 989-998 (1999).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Poelzing, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+increased+right+ventricular+conduction+sensitivity+to+flecainide+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying increased right ventricular conduction sensitivity to flecainide challenge.</a> Cardiovasc. Res. 77, 749-756 (2008).</li>
<li>Goodman, M., Art, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+by+a+potassium-selective+inward+rectifier+enhances+tuning+in+vertebrate+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Positive feedback by a potassium-selective inward rectifier enhances tuning in vertebrate hair cells.</a> Biophysical Journal. 71, 430-442 (1996).</li>
<li>Han, A., Frazier, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+characterization+using+single+cell+impedance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Ion channel characterization using single cell impedance spectroscopy.</a> Lab Chip. 6, 1412-1414 (2006).</li>
<li>Hayashi, H., Fishman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+K%2B-channel+kinetics+from+analysis+of+the+complex+conductance+of+Aplysia+neuronal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier K+-channel kinetics from analysis of the complex conductance of Aplysia neuronal membrane.</a> Biophysical Journal. 53, 747-757 (1988).</li>
<li>Millonas, M. M., Hanck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequilibrium+response+spectroscopy+of+voltage-sensitive+ion+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Nonequilibrium response spectroscopy of voltage-sensitive ion channel gating.</a> Biophys. J. 74, 210-229 (1998).</li>
<li>Misakian, M., Kasianowicz, J., Robertson, B., Petersons, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+response+of+alternating+currents+through+the+Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics%22%5BJournal%5D)">Frequency response of alternating currents through the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin ion channel.</a> Bioelectromagnetics. 22, 487-493 (2001).</li>
<li>Sale, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Properties+of+hERG+1a%2F1b+Heteromeric+Currents+and+a+hERG+1b-Specific+Mutation+Associated+With+Long-QT+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Physiological Properties of hERG 1a/1b Heteromeric Currents and a hERG 1b-Specific Mutation Associated With Long-QT Syndrome.</a> Circ Res. 103, 81-95 (2008).</li>
<li>Blatz, A. L., Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+description+of+three+modes+of+activity+of+fast+chloride+channels+from+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative description of three modes of activity of fast chloride channels from rat skeletal muscle.</a> J Physiol. 378, 141-174 (1986).</li>
<li>Kuo, J. J., Lee, R. H., Zhang, L., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+the+persistent+sodium+current+in+spike+initiation+during+slowly+rising+inputs+in+mouse+spinal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Essential role of the persistent sodium current in spike initiation during slowly rising inputs in mouse spinal neurones.</a> The Journal of Physiology. 574, 819-834 (2006).</li>
<li>Thompson, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+potassium-channel+selectivity+revealed+by+Na%28%2B%29+and+Li%28%2B%29+binding+sites+within+the+KcsA+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of potassium-channel selectivity revealed by Na(+) and Li(+) binding sites within the KcsA pore.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1317-1324 (2009).</li>
</ol>

Daha sonra ne kadar mevcut her bir kanal tipi atfedilen olmalıdır belirlenmesi amacı ile aynı anda birden fazla iyon kanalı türleri ölçme halen araştırmacıların teknik engeller vardır. Bu sınırlama nedeniyle, iyon kanalları genellikle voltaj, akım, ve aksiyon potansiyel kelepçe gibi teknikler kullanarak tek tek okudu. Bireysel kanal tipleri, heterolog ifade sistemleri sıklıkla kullanılır incelemek için 1 2 kardiyomiyositler gibi dokusundan izole edilen hücreler , çalışırken başka yollarla çeşitli iyon kanalları engellemek için kullanılması gerekir. Örneğin, sodyum kanalları yavaş bir depolarizan gerilim rampası inaktive olabilir, 3 içe giderilmesi potasyum kanalları ekstrasellüler BaCl2 ile bloke edilebilir, 4 ve kalsiyum kanalları verapamil kullanılarak bloke edilebilir. 5 Kısmen bu sınırlama üstesinden kullanılan bir yöntem, ölçüm uygun bir ajan ile seçici bir kanal tipi engelleme sonra tekrar, aynı anda iki kanal türleri arasında mevcut akı ölçmek. Iki ölçüm Çıkarma sonra bloke edildi kanal tipi mevcut atfedilebilir miktarını tahmin etmek için kullanılır. 6 Bununla birlikte, bu tekniğin iki önemli sınırlamalar vardır. İlk olarak, kimyasal maddeler, seçici olarak her bir iyon kanalı engelleyebilirsiniz belirlenmiştir ve yaygın olarak kullanılan bazı ilaçlar, diğer kanal tipleri ile non-spesifik etkileşimlere sahip değil 5,7 İkincisi, bu tekniğin bir kanal başka bir modüle olup olmadığını belirlenecek olamaz kanal. Örneğin, sağ ventrikül yüksek Kır 2.1 ifade iletim hızı deprese böyle NAV 1.5 ve Kır 2.1 heterojen ifade kobay ventriküller gösterildiği olmuştur ve bu iki kanal arasında sinerjik bir ilişki var olduğu ileri sürülmektedir. Halen 8 , bu doğrulanmış olamaz. Bu çalışmada, biz bu empedans spektroskopi, eş zamanlı olarak ölçülür birden fazla iyon kanalı türleri çalışmak için yararlı bir araç olabileceğini düşündürmektedir. Sunulan yöntem akımları aynı anda iki kanal ölçülen türlerinden ayırt etmek için kullanılan olmamıştı rağmen, empedans spektroskopi iyon kanalı fonksiyonu diğer yönlerini bir dizi çalışma olmuştur. Goodman ve Sanat akım pensi protokolleri bir hücre farklı frekanslara ayarlamak için modifiye ve transmembran potansiyel salınımlar içe giderilmesi K + kanal ve Ca 2 + kanal arasında bir etkileşim nedeniyle olabilir ki kaplumbağa işitsel saç hücreleri kullanarak gösterdi. 9 Han ve Frazier empedans geniş bir frekans aralığında (100 Hz - 5 MHz) üzerinden tek bir hücrenin ölçülebilir gösterdi ve K + veya Ca 2 + kanalları bloke edildi basit bir araç olabilir empedans artış gözlenmiştir yüksek kapasiteli ilaç ekranlarında kanal blok tespit 10 Hayashi ve Fishman içe giderilmesi K + kanal 11 Diğer gruplar farklı kanal türleri gerilim kelepçe protokol tek bir frekans yerleştirilir ve kinetik özelliklerini incelemek için karmaşık iletkenlik gösterdi bazı frekanslarda değil, diğerleri için beklenen yanıt gözlenen frekans tepkisi ile anlaştı. 12,13 Millonas ve Hanck bazı frekanslar beklenen yanıt Markov modeli birden fazla hız sabitleri varlığı vermedi nedenle önerilen bu gibi 12 Çalışmaları diğerleri gibi, hem iyonik akımlar empedans spektroskopi kullanarak, iyon kanalları ölçülen teorik frekans tepkisi ile aynı fikirde değilim durumlarda olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada yöntemin amacı bağımsız membran elektrik devresi dayandığı varsayımları geçerli genliği ile korele frekanslarını tespit etmek çünkü bu çalışmada bir endişe değil. Furtheremore geçerli genliği, onları içine takılan herhangi bir gürültü işlevleri olmayan kayıtları bölümlerini hesaplanır. Diğer çalışmaların sayısı da çok sayıda iyon kanalları mevcut modeller kendi hız sabitleri ile çok sayıda iletken ve tel olmayan devletlerin sergileyen 14,15,16 Thompson ve ark KcsA kanal seçiciliği filtresi Na için farklı bağlanma yerleri olduğunu gösterdi +, Li +, ve K +, ve seçicilik filtresi ile bir iyon hamle olarak başka bir bağlayıcı sitesi hareketli enerjik maliyetleri kanal tercihen, gözenek ile K + iyonları yürütmek kılan ne.. 17 Bu çalışmada biz bir dizi takılı bir gerilim adım protokol frekansları (gürültü fonksiyonu) ve genliği çok genel geçerli genliği ile korele frekanslar için baktı. Güçlü kanıtlar öne sunulan bu yana birden fazla hız sabitleri, ayırıcı yoluyla iyonların iletim bir rol oynayabilirt kanalları, bu oran sabitleri ile ilişkili frekansları giriş belirli frekanslarda rezonansa ya da son derece geçerli genliği, aksi halde olmazdı ile korele neden olabilir. Bu çalışmada gösterilmiştir tekniği, genellikle gerilim kelepçe devresi ve satın alma ekipmanları test etmek için kullanılan bir paralel RC devresi, bir model hücresi, yapılır. DC dışında herhangi bir frekanslar mevcut büyüklüğü ile ilişkili olacağını ve bu verileri gösterilir. Ayrıca gürültü fonksiyonunun yanı sıra, herhangi bir frekansları son derece geçerli genliği ile korele neden olmadığını göstermektedir. Bu iki bulgu, ölçüm cihazları ve gürültü fonksiyonu, herhangi bir frekanslar geçerli genliği ile ilişkilendirmek için neden kendileri olmadığını gösteriyor, çünkü kritik öneme sahiptir. Gelecekteki çalışmalar iyon kanalları içeren membranlar kullanarak ölçümler yaparken, kullanılan kanal bağlı olarak, seçicilik filtresi ya da muhtemelen gözenek hız sabitleri karşılık frekansları kanal frekans cevabı etkisi ve frekanslar, yüksek hangi etkilemez, bu bekleniyor geçerli genliği ya da düşük korelasyon. Bu yöntem iyon kanalları çalışmak için yeni bir teknik olduğu için, gelecek çalışmaları takip yönde bir dizi vardır. İlk olarak, teknik belirli izole kanallarının frekans tepkisi karakterize etmek için kullanılmalıdır. Ek iş, aynı zamanda mevcut genlikleri frekans genlikleri kalibre etmek için yapılması gerekiyor. Birden fazla kanal ayrı ayrı karakterize sonra, birden fazla kanal türleri aynı anda ölçülmelidir. Bu teknik, aynı zamanda aksiyon potansiyeli kelepçe, kelepçe akımı, ve alan stimülasyonu çalışmaları kullanmak için adapte olabilir. Bu yeni bir teknik olmasına rağmen, daha önce mümkün değildi elektrofizyolojik ölçümler yapmak ve iyon kanalları fizyolojik rolü içine değerli yeni anlayışlar sağlamak için güçlü bir yol ne olabilir gösterir.

<table><tbody><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>n/a</td><td>Natick, MA</td></tr><tr><td>Clampex 8</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 8</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Entegre Patch Clamp Amplifikatörü</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Kafa Katı (Headstage)</td><td>Molecular Devices</td><td>CV202</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>16-Bit Veri Toplama Sistemi</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1322A</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Model Hücre</td><td>Molecular Devices</td><td>Patch 1 Model Hücre</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr></tbody></table>

frekans bileşenleri kullanarak bir İyon kanal iv eğrisi, rekapitülasyon

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

GİRİŞ: Halen, aynı anda birden fazla iyon kanalı türleri ölçmek ve her kanal tipi atfedilebilecek parçaya ölçülen akım ayrıştırmak için kurulan yöntemleri vardır. Bu çalışmada, yüksek gerilim kelepçe deneyler sırasında ölçülen kararlı durum geçerli genliği ile korele belirli frekanslarda empedans spektroskopi tanımlamak için kullanılır nasıl olabilir göstermektedir. Bu yöntem, belirli frekanslarda gerilim adım protokolü içeren bir gürültü fonksiyonu ekleyerek içerir. Sunulan çalışmada, bir model hücre yüksek korelasyon hiçbir iyon kanalları mevcut gürültü fonksiyonu kendisi herhangi bir yüksek korelasyon tanıtmak olmadığını gerilim kelepçe devresi tarafından tanıtıldı ve olduğunu göstermek için kullanılır. Bu doğrulama tekniği iyon kanalları içeren preparatlar uygulanabilir önce gereklidir. Sunulan protokolün amacı, bir gürültü fonksiyonu tek bir iyon kanal tipi frekans tepkisini karakterize nasıl göstermek için. Belirli frekansları tek bir kanal tipi tespit edildikten sonra, onlar, kararlı hal akımı gerilim (IV) eğrisi üretmek için kullanılabilir. Daha sonra yüksek bir kanal türü ile ilişkilidir ve minimal diğer kanal türleri ile korele Frekanslar, eş zamanlı olarak ölçülür birden fazla kanal türleri geçerli katkısını tahmin etmek de kullanılıyor olabilir. YÖNTEM: Gerilim kelepçe ölçümleri, standart bir gerilim adım protokolü (-150 ile +50 mV, 5mV adım) kullanarak bir model hücre yapıldı. 1-15 kHz frekansları (sıfır tepe genlikleri: 50 veya 100mV) eşit büyüklükleri içeren Gürültü fonksiyonları gerilim her adım içine yerleştirildi. Çıkış sinyali Hızlı Fourier dönüşümü (FFT) gerçek bir bileşeni olan ve her adımı potansiyelini için gürültü olmadan hesaplanmıştır. Her frekansın bir fonksiyonu olarak gerilim adım büyüklüğü ilgili gerilimler geçerli genliği ile orantılı idi. SONUÇ VE ÖNERİLER: gürültü olmaması (kontrol), DC bileşeni dışındaki tüm frekansları büyüklükleri korelasyon zayıf (| R | &lt;0.5) IV eğrisi ile, tüm ölçümlerde korelasyon katsayısı 0,999 &#39;den büyük bir DC bileşeni oysa. Bireysel frekansları ve IV eğrisi arasındaki korelasyon kaliteli bir gürültü fonksiyonu gerilim adım protokolü eklendiğinde bir değişiklik olmadı. Aynı şekilde, gürültü fonksiyonunun genliği artan bir ilişki artırmak vermedi. Kontrol ölçümleri tek başına gerilim kelepçe devre 0 Hz üstünde frekansları son derece kararlı durum IV eğrisi ile ilişkilendirmek için neden olmadığını göstermektedir. Aynı şekilde, gürültü fonksiyon varlığı ölçümleri, gürültü fonksiyonu, hiçbir iyon kanalları zaman herhangi bir 0 Hz üstünde frekansları kararlı durum IV eğrisi ile ilişkilendirmek için neden olmadığını göstermektedir. Bu doğrulama yöntemi artık genlikleri özellikle bu kanal tipi ile korelasyon tespit frekansları amacı ile tek bir iyon kanal tipi içeren preparatlar uygulanabilir.

Aynı anda birden fazla iyon kanalları aracılığıyla mevcut akı ölçüm teknik engeller ve transmembran akım daha sonra seçici hangi bölümünü her kanal tipi nedeniyle. Bu ihtiyacı karşılamak için, bu yöntem belirli frekans bileşenleri kullanarak tek tek kanal türleri IV eğrisi oluşturmak için bir yol sunar.

Frekans Bileşenleri kullanarak bir İyon Kanal IV Eğrisi, Rekapitülasyon

GİRİŞ: Günümüzde, birden fazla iyon kanalı tipini eş zamanlı olarak ölçmek ve ölçülen akımı ... şeklinde ayrıştırmak için belirlenmiş yöntemler bulunmamaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, birden fazla kanal tipinden geçen akım akısını eş zamanlı olarak ölçmek amacıyla iyon kanallarının frekans yanıtını karakterize etmeye yönelik bir tekniği göstermektir; bu işlem, öncelikle voltaj basamak protokolüne dahil edilecek gürültü fonksiyonunun oluşturulması ve ClampX yazılımıyla özel dalga formlarının kullanılabilmesi için bu fonksiyonun bir stimülasyon dosyasına eklenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, yeni oluşturulan voltaj basamak protokolünün standart tüm hücre voltaj klemp teknikleri kullanılarak model bir hücreye uygulanması ve ortaya çıkan akımın kaydedilmesidir. Prosedürün üçüncü adımı ise hücrenin IV eğrisinin ve her bir süpürmenin gürültü fonksiyonunu içeren kısmının FFT'sinin hesaplanmasıdır.Prosedürün son adımı, her bir frekansın tüm voltaj basamaklarındaki genliğini, söz konusu hücrenin IV eğrisiyle tek tek korele etmektir. Sonuçlar, model hücrenin IV eğrisiyle yüksek korelasyon gösteren herhangi bir frekans olmadığını göstermektedir. Bu tekniğin, standart tüm hücre voltaj klempleme gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, farmakolojik bloklayıcı ajanlar veya aktivasyon protokollerinde voltaj kullanımı gerekmeksizin birden fazla iyon kanalı tipini eş zamanlı olarak ölçme imkanı sunabilmesidir.Bu yöntem, bir iyon kanalı tipinin ekspresyon düzeyinin, aynı dokudaki diğer iyon kanalı tiplerinin aktivitesi üzerinde nasıl bir etkiye sahip olduğu gibi, iyon kanalı fizyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Protokolün ilk adımı, istenen frekans bileşenlerini içeren bir gürültü fonksiyonu oluşturmaktır. Bunu yapmak için önce, istenen frekans bileşenlerini frekans domeninde tanımlayın.Bu çalışmada, 1 ile 15 kilohertz arasındaki frekans bileşenleri kullanılmıştır. Ardından, seçilen frekansları zaman alanına dönüştürmek için MATLAB'ın IFFT fonksiyonu kullanılarak ters hızlı Fourier dönüşümü hesaplanır; sonrasında gürültü fonksiyonunun genliği uygun şekilde ölçeklendirilir.Bu çalışmada, gürültü fonksiyonu iki kez ölçeklendirilir; birincisinde gürültü fonksiyonunun sıfır-tepe genliği 50 millivolt, ikincisinde ise sıfır-tepe genliği 100 millivolt olacak şekilde ayarlanır. Bir sonraki adım, matlab gibi bir program kullanarak bir stimülasyon dosyası oluşturmaktır. Stimülasyon dosyası, clamp X eight veri toplama yazılımına her zaman noktasında tam olarak hangi voltajın kullanılacağını bildiren bir başlığa sahip basit bir metin dosyasıdır.Uyarıcı dosyasını oluşturmak için öncelikle uygun başlığı içeren bir metin dosyası oluşturun; başlığın altına, ilk sütuna tek bir tarama için zaman artışlarını ekleyin; zaman artışları, ölçümlerde kullanılan örnekleme aralığıyla aynı zamansal aralığa sahip olmalıdır. Bu protokolde 200 kilohertz örnekleme hızı kullanılmaktadır. Her tarama için, her bir zaman adımında istenen tam voltaj değerlerini girin.Her sütun ayrı bir tarama olarak kabul edilir; bu nedenle, -150 millivolt'tan +50 millivolt'a 5 millivolt'luk artışlarla ilerleyen bir protokol için, zaman sütunundan sonra 41 sütun eklenmelidir. Belirtilen voltajlar, clamp X'teki gürültü fonksiyonunu içermelidir. Her deney için bir protokol oluşturulmalıdır, bu nedenle bir sonraki adım, daha önce oluşturulmuş bir stimülasyon dosyasıyla uyumlu bir ölçüm protokolü oluşturmaktır. clamp X'te, bir stimülasyon dosyasını mevcut protokolle ilişkilendirmenize olanak tanıyan acquirer edit protocol wave zero menü seçeneğini belirleyin.Bir sonraki adım, tanımlanan stimülüsün hücreye uygulanmasıdır. Bu protokol, paralel bir RC devresine sahip bir model hücre kullanmaktadır. Model hücreyi ölçüm ekipmanına bağlayın, kayıt düğmesine tıklayın ve işlemi gerçekleştirmek için clamp X'i kullanın.Deney, kontrol amaçlı olarak planlanmıştır. Verileri topladıktan sonra, gürültü fonksiyonlarını içermeyen periyodik ölçümler eklediğinizden emin olun; bir sonraki adım IV eğrilerini oluşturmak ve hızlı fourier dönüşümlerini gerçekleştirmektir. Tek bir kayıt için IV eğrisini hesaplamak amacıyla, akım genliğini ölçmek için kaydın gürültü fonksiyonu aralığının zaman açısından dışında kalan kararlı durum kısmını kullanın.Gürültü fonksiyonu uygulandığında kayıt kararlı durumda değilse, gürültü fonksiyonu IV eğrisi hesaplamasını etkileyebilir; bu durumda kontrol kaydı kullanılmalıdır. Bir kayıttaki her voltaj adımı için IV eğrisini hesaplamak yerine, gürültü fonksiyonunun yerleştirildiği kayıt kısmının FFT'sini hesaplayın. Her voltaj adımı için Fourier dönüşümünü, M'nin FFT'deki frekans sayısı ve N'nin bu konfigürasyondaki voltaj adımı sayısı olduğu M x N boyutunda bir matriste birleştirin.Matrisin her bir satırı, deneydeki tüm voltaj basamaklarında tek bir frekansın FFT genliğini temsil eder. Bir sonraki adım, her bir frekans için korelasyon katsayılarını hesaplamak, satırı daha önce oluşturulan IV eğrisiyle ilişkilendirmektir. Korelasyon katsayısını kaydedin.Ardından, IV eğrisi ile yüksek korelasyon gösteren frekansları görselleştirmek için korelasyon katsayısının frekansa karşı grafiğini oluşturun. Gürültü fonksiyonu eklenmeden yapılan voltaj klemp ölçümlerinin sonuçları burada gösterilmiştir. Her taramanın ilk ve son 20 milisaniyesinde, potansiyel sıfır milivoltluk tutma potansiyelinde sabitlenmiştir.Bu süreçte voltaj, -150 millivolt'tan +50 millivolt'a 5 millivolt'luk artışlarla kademeli olarak yükseltilmiştir. Her voltaj adımı 80 milliseconds sürmüştür; şeklin daha kolay okunabilmesi için yalnızca her beş taramadan biri şekle dahil edilmiştir. Kırmızı kutu, bu taramalarda bir gürültü fonksiyonu olsaydı, gürültü fonksiyonunun ne zaman uygulanmış olacağını göstermektedir.Bu şekil önceki şekle benzerdir, ancak gürültü fonksiyonu voltaj basamağı protokolüne voltaj basamağının başlangıcından 40 milisaniye sonra eklenmiştir; kırmızı kutu gürültü fonksiyonunun nereye eklendiğini göstermektedir. Gürültü fonksiyonu 30 milisaniye süreliydi ve bir ile 15 kilohertz arasındaki frekansları içeriyordu. Bu şekil, model hücre için hesaplanan IV eğrisini göstermektedir.Bu IV eğrisi lineerdir; model hücre basit bir paralel RC devresi olduğu için bu durum beklenmektedir. Bu şekil, her tarama için gürültü fonksiyonu olmadan elde edilen FFT sonucunu göstermektedir. Model hücre kayıtlarında FFT, gürültü fonksiyonunun eklendiği zaman aralığı üzerinden hesaplanmıştır.Kırmızı ile vurgulanan DC bileşeni, IV eğrisinin şeklini taklit ediyor gibi görünmektedir. DC üzerindeki tüm frekansların genlikleri sıfıra yakın görünmektedir; netlik sağlamak amacıyla ş야kile her beş taramanın FFT'si dahil edilmiştir. Gürültü fonksiyonu eklenmiş kayıtlar için FFT hesaplandığında, bir ile 15 kilohertz arasındaki frekansların belirgin genlikleri vardır. Voltaj klemp deneylerinde normalde mevcut olmayan bu yüksek frekansların varlığı, bu frekansların herhangi birinin büyüklüğünün akım genliği ile orantılı olarak değişip değişmediği sorusunu gündeme getirmektedir.Sıradaki üç şekil, bireysel frekans genliği ile kaydın IV eğrisi arasındaki korelasyon katsayısını göstermektedir. İlk şekilde herhangi bir gürültü fonksiyonu kullanılmamıştır. İkinci şekilde, gürültü fonksiyonunun tepe genliği 50 millivolt'tur ve üçüncü şekilde, gürültü fonksiyonunun tepe genliği 100 millivolt'tur.Tüm durumlarda DC bileşeninin, diğer bir ifadeyle sıfır hertzteki tepkinin korelasyon katsayısının 0,99'dan büyük olduğu ve bu nedenle IV eğrisiyle neredeyse mükemmel şekilde korele göründüğü dikkat çekmektedir. Ayrıca, her üç şekilde de diğer frekansların hiçbirinin korelasyon katsayısının 0,5'ten büyük olmadığına dikkat edin. Ek olarak, 50 veya 100 milivolt genliğindeki gürültü fonksiyonunun eklenmesi bu örüntüyü değiştirmedi.Bu sonuçlar, voltaj klembi devresinin ve gürültü fonksiyonunun kendisinin IV eğrisinde yüksek korelasyonlara yol açmadığını göstermektedir. Bu doğrulama, bu tekniğin iyon kanalları içeren preparatlara uygulanabilmesi için önemlidir. Bu şekil, iki farklı frekans veri setindeki korelasyonu veya korelasyon eksikliğini göstermek için IV eğrisini yeniden oluşturmaktadır.Bu şekilde gerçek IV olarak etiketlenen model hücrenin IV eğrisi, kırmızı kesikli çizgiyle üst üste biniyormuş gibi görünen noktalı çizgidir. Kırmızı kesikli çizgi, gerçek IV çizgisiyle 0,995 korelasyon katsayısına sahip olan DC bileşenini göstermektedir. Görüntülenen üçüncü eğri olan tırtıklı çizgi ise düşük korelasyona sahip, rastgele seçilmiş 4,399 kilohertz frekansını göstermektedir.Bu doğrunun IV eğrisi ile korelasyon katsayısı 0.3212'dir. Bu sonuçlar, ölçüm ekipmanının ve gürültü fonksiyonunun tek başlarına herhangi bir frekansın akım genliği ile korelasyonuna neden olmadığını göstermektedir; bu doğrulamaya dayanarak, voltaj klemp deneyleri sırasında voltaj basamaklarına bir gürültü fonksiyonu ekleyen burada sunulan yöntem, önce tek bir iyon kanalı tipi içeren membran preparasyonlarına ve ardından birden fazla kanal tipi içeren preparasyonlara uygulanabilir. Tekli iyon kanalı deneylerinden elde edilen sonuçlar, burada önerilen FFT ve korelasyon analizi kullanılarak analiz edilebilir.Bu analiz, genlikleri belirli bir kanal tipiyle spesifik olarak ilişkili olan frekansların belirlenmesi için kullanılabilir. İyonların farklı kanallar aracılığıyla iletiminde birden fazla hız sabitinin rol oynadığını öne süren güçlü kanıtlar sunulmuştur. Bu nedenle, frekanslar belirlendikten sonra, bunlar bir kanal tipiyle yüksek derecede, diğer kanal tipleriyle ise minimum düzeyde ilişkilidir.Bu frekanslar daha sonra, bu prosedür takip edilerek eş zamanlı olarak ölçülen çoklu kanal türlerinin mevcut katkısını tahmin etmek için kullanılabilir. İyon kanalları bloklanmış veya inaktif konformasyondayken kanal frekans yanıtının nasıl davrandığı gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla farmakolojik bloklama ve ön darbeler gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

recapitulation-of-an-ion-channel-iv-curve-using-frequency-components

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

BK kanalları İyonik akım yama klemp teknikleri kullanılarak kaydedildi. BK kanalları ifade edilmiştir.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

Memeli koklea iç saç hücresi şerit sinaps işitsel sinir lifi dendritler Tüm hücre yama klemp kayıtları.

Koklear İç Saç Hücreleri Ulaşın Afferent Dendritler postsinaptik Kayıtlar: Şerit Synapse Multivesicular Yayın İzleme

Biz su kaplan semender (gelen ince retina dilim hazırlanması...

Bir Amfibi Retina Dilim hazırlanması Fotoreseptörler ve İkinci dereceden nöronlar eş zamanlı tam hücreli Kayıtlar

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

electroformation ve jel destekli şişme - dev tek tabakalı veziküller (GUVs) içine transmembran protein, KvAP, şifreden iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri için gösterilmiştir. Her iki yöntemde de, protein içeren küçük tek lamelli kesecikler, sonra, flüoresans mikroskopisi ve yama klempi elektrofizyoloji ile incelenebilir GUVs oluşturmak üzere bir araya birleştirilir.

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Bu makale, channelrhodopsinin iyon seçiciliğinin, HEK293 hücreleri kullanılarak elektrofizyolojik tam hücre yama-klemp kayıtlarıyla nasıl belirlendiğini açıklamaktadır. Burada, anyon seçici bir channelrhodopsinin klorür seçiciliğini araştırmak için deneysel prosedür gösterilmiştir. Bununla birlikte, prosedür farklı seçiciliğe sahip diğer channelrhodopsinlere aktarılabilir.

Channelrhodopsins&#39;teki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları

Bu makale, iyon kanallarındaki yapısal yeniden düzenlenmeleri araştırmak için maleimid boyaları yerine Floresan Doğal olmayan Amino Asitlerin (fUAA) kullanıldığı klasik Voltaj-Kelepçe Florometrisinin (VCF) geliştirilmesini anlatıyor. Prosedür, Xenopus oosit DNA enjeksiyonu, RNA / fUAA koinjeksiyon ve eşzamanlı akım ve flüoresans ölçümlerini içerir.

Voltaj kelepçesi florometrisi<em&gt; Xenopus</emFloresan Doğal Olmayan Amino Asitler Kullanan Oositler

İletişim kuralı küçük molekül lipid ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) ile arıtılmış hEAG1 iyon kanal protein etkileşimleri açıklar. Ölçüm BLI roman küçük molekül iyon kanal ligand tarama için potansiyel bir yöntem olabilir gösterir.

Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama

Bu protokol, tüm hücre yama kelepçesi tekniğini kullanarak H9c2 kardiyomiyositlerinde voltaj kapılı potasyum (Kv) kanal akımlarının gerçek zamanlı ve dinamik olarak elde edilmesi için etkili bir yöntem tanımlamaktadır.

Tüm Hücre Yama-Kelepçe Tekniği ile H9c2 Kardiyomiyositlerine Voltaja Bağlı Potasyum Akımı Kaydı

Dinamik kelepçe elektrofizyolojisi, nöronal ateşleme eksiklikleri ile iyon kanalı disfonksiyonu arasında nedensel bağlantılar kurabilir. Fare serebellar Purkinje nöronlarında dinamik kelepçe yöntemlerini ve protokollerini açıklıyoruz, faydalı kaynaklara ve teknik hususlara dikkat çekiyoruz. Temsili bir çalışmada, tekrarlayan ateşlemeyi kurtarmak için Tsc1-/- Purkinje nöronlarına modellenmiş sodyum iletkenliği ekliyoruz.

Otizmle İlişkili Bozulmuş Nöronal Uyarılabilirliği Araştırmak için Dinamik Kelepçe Yöntemleri

Gramicidin A-doped damlacık arayüz çift katmanlarını bir yere toplamak, elektriksel olarak uyarmak ve analiz etmek için deneysel bir protokol sunulur. Lipid-protein yapı-fonksiyon ilişkileri, membran alanı, iyonik akı ve tek kanal iletkenliğindeki değişiklikler ölçülerek ve bu yanıtların, elektriksel sinapslardan ilham alan bir membran modelinde iyonik iletkenlikteki plastisite benzeri değişikliklerle ilişkilendirilmesiyle nicelendirilir.

Damlacık Arayüz Bilayerları Kullanarak Lipid-Protein Zar Yapı-Fonksiyon Karakterizasyonu

Öğrenin, frekans bileşenleri kullanarak iyon kanallarının IV eğrisini elektrofizyolojide eş zamanlı ölçmek için bu yenilikçi yöntemi. Farmakolojik ajan kullanmadan çoklu kanal tiplerini analiz edin.

Frekans Bileşenleri kullanarak bir İyon Kanal IV Eğrisi, Rekapitülasyon

Daha fazla video keşfet