Name: Mikro Termal Isı Yayımı kullanarak Rapid PCR Thermocycling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Keşfedin termal konveksiyon kullanarak hızlı PCR termosikling yöntemini. Bu yenilikçi yaklaşım, DNA amplifikasyonunu basitleştirir ve reaktiflerin sürekli sıcaklık bölgeleri arasında hareketini sağlayarak reaksiyon hızını artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz minnetle Lynntech A.Ş., T. Ragucci, B. Watkins, S. Wong, ve B. Wallek teknik yardım ve birçok faydalı tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma, hibe CBET-0933688 altında ABD Ulusal Bilim Vakfı (NSF) tarafından desteklenmiştir.

1. Konvektif thermocycler Temel Tasarım <ol><li> Biz sıcaklıklarda bağımsız (Şekil 2) 7 kontrol edilir iki alüminyum levhalar arasında sıkışmış değiştirilebilir plastik reaksiyon odasında "kartuşlar" oluşan basit bir konvektif thermocycling cihazı inşa ettik. </li><li> Silindirik reaktör kuyu, delik çapı ve istenilen boy oranları (yükseklik / çap = h / d) elde etmek için kullanılan plastik levha kalınlığı farklı kombinasyonları ile polikarbonat blokları delik işleme dizileri gömülür . İki farklı reaktör geometrileri Burada sunulan sonuçlar dikkate alınır: h / d = 9: h = 15.9 mm, d = 1.75 mm, 38.2 mcL hacim; h / d = 3: h = 6,02 mm, d = 1.98 mm, 18,5 mcL hacmi. </li><li> Reaktörün alt yüzeyi microprocesser odaklı bir sıcaklık kontrolörü ile arabirim kartuş ısıtıcıları içeren bir alüminyum blok kullanılarak ısıtılır. </li><li> Reaktörün üst yüzeyinde sıcaklık sirkülasyon su banyosuna bağlı bir alüminyum blok kullanılarak düzenlenir. </li><li> Tüm montaj karşı alüminyum bloklar arasındaki ısı iletkenliği sınırlamak için naylon vidaları kullanarak birlikte kelepçelenir. </li></ol> 2. PCR Reaksiyon karışımı hazırlanması ve yükleme <ol><li> 100 mcL tipik bir reaksiyon karışımının 10x tampon çözelti, 25 mM 6 mcL 10 mcL içeren MgCl 2, dNTP 10 mcL (2 mM her), DI su, β-aktin prob mcL 10, 10 mcL β 41.2 mcL -aktin ileri astar, 10 mcL β-aktin ters astar, 2 mcL insan genomik DNA (10 ng / ml) ve KOD DNA polimeraz (2.5 adet / ml) 0.8 mcL. </li><li> Reaktifler yüklemeden önce, ince bir alüminyum bant sayfasını kullanarak PCR odasının alt yüzeyi mühür. </li><li> Yağmur X anti-Fog takip bovine serum albumin, 10 mg / mL sulu çözelti ile reaktör kuyu durulayın. </li><li> Pipet uzun jel yükleme pipet uçları kullanarak reaktör kuyu içine reaktifler ve FEP Teflon bant ile üst yüzeyi mühür. </li></ol> 3. Konvektif PCR Reaksiyon Koşu <ol><li> Istenilen alt ve üst yüzey sıcaklıkları reaksiyon, ön ısıtma alüminyum bloklar hem başlamadan önce. </li><li> Sandviç plastik reaktör alüminyum ısıtma blokları arasındaki PCR yüklü ve hızlı bir şekilde naylon cıvatalar ile birlikte montaj kelepçe. </li><li> Sonra reaksiyon istenilen zaman ilerledi, ısıtıcılar kapatın ve hızla soğutulur ve konvektif akışını durdurmak için soğuk bir metal blok üst cihazın alt (sıcak) yüzey yer. </li><li> Plastik reaktör çıkarın ve bir sonraki analiz için kuyulardan (uzun jel yükleme ipuçlarını kullanarak) ürünler pipetle. </li></ol> 4. Jel Elektroforez Analizi yapılması <ol><li> Çözüm açık hale gelinceye kadar karıştırarak sıcak bir plaka üzerinde 1x tampon 500 mL 10 g agaroz ısıtma, 2 ağırlıkça% agaroz jel hazırlayın. </li><li> Agaroz jel döküm tepsisine yerleştirin ve tarak eklemek. ~ 30 dakika için jel seti alalım. </li><li> Tarak çıkarın ve jel batık kadar 1x TAE tamponu ekleyin. </li><li> Floresan boyanan DNA örnekleri 2 mcL 100x SYBR Green I çözümü, 2 mcL DNA örneği, 2 mcL 6x Portakal Yükleniyor Boya ve 4 mcL TAE tampon içerir. </li><li> DNA örnekleri kuyuların içine ekleyin ve 1 saat 60 V 100 bp DNA merdiveni boyutlandırma işaretleyici ile ayrılması çalıştırmak. </li><li> Jel çıkarın ve bir sonuç elde etmek için UV ışık altında fotoğraf. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Konvektif thermocyclers optimal tasarım reaktifler PCR sürecinde görev alan kilit sıcaklıklarda yoluyla taşıma kapasitesine sahip bir dolaşım akışı oluşturmak doğru reaktör geometri seçilmesi gerekir. Burada kabul edilen silindirik reaktörlerde çeşitli olabilir geometrik parametreleri yüksekliği (h) ve çapı (d) veya eşdeğeri, en boy oranı (h / d). Biz, içinde bir dizi hesaplamalı akışkanlar dinamiği (CFD) kullanarak farklı boy oranları üzerinde PCR reaktörler konvektif 3-D akış alanları araştırdı ve beklenmedik bir şekilde karmaşık desenler ortaya çıkabilir bulundu. Daha da önemlisi, bizim analiz ölçüde reaksiyon 12 hızlandırmak bu karmaşık akış alanları bir alt kümesi ortaya çıkardı. Bu geometrik etkileri açıkça boy oranları yüksek ve düşük reaktörlerde akış alanları karşılaştırarak görülebilir. Yüksek en-boy oranı durumda (h / d = 9; uzun boylu, sıska bir silindir), sıvı elementler aslında döngüler kapalı yollar izleme yörüngeleri boyunca advected, ve uzun süreler için de aynı yolu takip etmek kilitli (Şekil 3a). Sonuç olarak, f arasındaki alışverişi için çok az fırsat varPCR (reaktör üst ve alt yüzeylerinde tavlama ve denatüre uç arasında gidip) ve (merkezine yakın lokalize amplifikasyon katkıda değilsiniz kalan yörüngeleri çok daha büyük bir topluluk için termal koşulları en iyi dizisi reaktiflerin maruz düşük yörüngeleri reaktör). Akışkan elemanı yörüngeleri artık kapalı yolları (Şekil 3b) izleyin anlamda daha kaotik olma, akış alanının küçük boy oranı (daha kısa, daha geniş bir silindir y / d = 3) çok farklıdır . Böylece, reaktifler daha karmaşık bir sıcaklık profili tabi olsa bile, sıvı elementler reaktif hacmi optimum ısı profilleri deneyimi için bir fırsat daha böylece çok daha geniş bir yörünge keşfetmek mümkün. Bu sonuçlar Sezgilere ise bireysel akış yörüngeleri h / d = 9 sıcaklık profilleri üreten PCR için daha olumlu görünebilir öneririz geleneksel PCR, / saat akış alanının kaotik yapısından istihdam benzer "bakmak" d = 3, sonuçta reaktifleri, çok uzun süre olumsuz yörüngeleri sıkışıp kalmamak için geliştirilmiş alışverişi teşvik ederek küresel ölçekte hakim. Bu hipotezi test ve reaktör geometri PCR için daha elverişli olduğunu belirlemek için, bir insan genomik DNA şablondan β-aktin gen ile ilişkili 295 bp hedef PCR çoğaltma gerçekleştirmek için her ikisi de kullanılır. Enteresandır ki, biz rutin saatte sadece 10 dakika içinde doğru hedef ürün amplifikasyon elde / d = 3 y / d saptanabilir ürünleri en az 20 dakika önce aynı reaksiyonu gözlendi (Şekil 4a) = 9 (Şekil 4b) . Reaksiyon özgüllüğü de saatte daha büyüktür / d = 3 saat birden fazla nonspesifik ürünler üretilir tek bir PCR ürünü elde edilir / d = 9 akış alanının tuzakları uzun bir süre için olumsuz termal yörüngeleri sıvı unsurları . <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Termal konveksiyon alt ve üst yüzeyleri silindirik bir oda farklı sabit sıcaklıklarda tutulur. Alt yüzeyinde sıcaklık üst kısmında daha yüksek ise, dikey bir yoğunluk gradiyenti dolaşım akış paterni üretme yeteneğine sahip olan kapalı bir sıvı içinde kurulmuştur. Geometrik parametreleri (yüksekliği h ve çapı d) doğru bir seçim ile, konvektif akış alanının üst ve alt yüzeyleri sırasıyla sıcaklık, (yerçekimi dikey olarak aşağı doğru hareket eder) tavlama ve denatüre yakınlarındaki manintained PCR thermocycling harekete geçirmek için harnessed olabilir. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 (a), konvektif bir akış anahtar bileşenleri PCR thermocyler . Bir reaktör kartuşu, silindirik odaları bir dizi içeren bir polikarbonat blok oluşur. Dolaşan su banyosu ve gömülü ısıtıcılar içeren bir alt plaka bağlanmak üzere tasarlanmış bir üst plaka blok arasında sıkışmış. (B) PCR cihazı reaksiyonu gerçekleştirmek monte sonra yüklenir ve reaktör kartuş içinde mühürlü. Tamamlandığında, procucts kolayca sonraki analiz için dışarı pipetlenir olabilir. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 sıcaklıkları 53 ve 96 silindir reaktörler içinde oluşturulan 3-D konvektif akış alanları Hesaplamalı simülasyonları ° C, sırasıyla üst ve alt yüzeylerinde empoze. Sonuçlar, boy oranları gösterilmektedir (a) h / d = 9 (38.2 mcL reaktör hacmi) ve (b) h / d = 3 (18.5 mcL reaktör hacmi). 3D akış alanının yoluyla seyahat eden bir sıvı elemanı tarafından takip edilen temsili yörünge gösterilen yolun-üst ve yan projeksiyonları ile birlikte sol, sağ tarafta bir sıvı eleman aşağıdaki sıcaklık zamana karşılık gelen arsa gösterilir. H / d = 9 termal profili geleneksel PCR yakın görünür, ancak h / d = 3 kaotik akış alanının PCR Sezgilere daha uygundur. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. DNA replikasyonu Şekil 3 (yüzeyler sırasıyla 53 ve 96 ° C'de muhafaza edildi, üst ve alt) gösterilen reaktör geometrileri elde edilen sonuçlar. (A) PCR büyük ölçüde reaksiyon süresi sadece 10 dakika sonra (100 baz puan (bp) merdiveni, şerit 1-4: 4 farklı silindirik odaları paralel reaksiyonlar ürün M) görünür güçlü ürünler olarak ortaya h / d = 3 hızlanır. (B h / d = 9 gerçekleştirilen aynı reaksiyon görülebilir ürünler gözlenmektedir önce en az 20 dakika gerektirir ve birden çok bantlar istenilen ürüne ek olarak non-spesifik hedef DNA açıkça belirten çoğaltma: 100 bp merdiven , şeritleri 1-2: 2 farklı silindirik odaları paralel reaksiyonlar ürünler).

<ol><li>Spitzack, K. D., Ugaz, V. M. Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpitzack%2C+KD+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Minteer, S. D. , Humana Press. Vol. 321 (2005).</li>
<li>Krishnan, M., Ugaz, V. M., Burns, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+in+a+Rayleigh-B%C3%A9nard+convection+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">PCR in a Rayleigh-Bénard convection cell.</a> Science. 298, 793-793 (2002).</li>
<li>Braun, D., Goddard, N. L., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exponential+DNA+replication+by+laminar+convection%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Exponential DNA replication by laminar convection.</a> Physical Review Letters. 91, 158103-158103 (2003).</li>
<li>Chen, Z., Qian, S., Abrams, W. R., Malamud, D., Bau, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermosiphon-based+PCR+reactor%3A+experiment+and+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Thermosiphon-based PCR reactor: experiment and modeling.</a> Analytical Chemistry. 76, 3707-3715 (2004).</li>
<li>Wheeler, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convectively+driven+polymerase+chain+reaction+thermal+cycler%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Convectively driven polymerase chain reaction thermal cycler.</a> Analytical Chemistry. 76, 4011-4016 (2004).</li>
<li>Krishnan, M., Agrawal, N., Burns, M. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactions+and+fluidics+in+miniaturized+natural+convection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactions and fluidics in miniaturized natural convection systems.</a> Analytical Chemistry. 76, 6254-6265 (2004).</li>
<li>Ugaz, V. M., Krishnan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+convective+flow+based+approaches+for+high-throughput+PCR+thermocycling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Laboratory+Automation+%28JALA%29%22%5BJournal%5D)">Novel convective flow based approaches for high-throughput PCR thermocycling.</a> Journal of the Association for Laboratory Automation (JALA). 9, 318-323 (2004).</li>
<li>Yao, D. J., Chen, J. R., Ju, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-Rayleigh-Benard+convection+polymerase+chain+reaction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micro-Nanolithography+MEMS+and+MOEMS%22%5BJournal%5D)">Micro-Rayleigh-Benard convection polymerase chain reaction system.</a> Journal of Micro-Nanolithography MEMS and MOEMS. 6, 043007-043007 (2007).</li>
<li>Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pocket-sized+Convective+PCR+Thermocycler%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A Pocket-sized Convective PCR Thermocycler.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46, 4316-4319 (2007).</li>
<li>Yariv, E., Ben-Dov, G., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction+in+natural+convection+systems%3A+A+convection-diffusion-reaction+model%5BTitle%5D)+AND+%22Europhysics+Letters%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction in natural convection systems: A convection-diffusion-reaction model.</a> Europhysics Letters. 71, 1008-1014 (2005).</li>
<li>Allen, J. W., Kenward, M., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+flow+and+reaction+during+natural+convection+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Coupled flow and reaction during natural convection PCR.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 6, 121-130 (2009).</li>
<li>Muddu, R., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+Biochemistry+by+Chaotic+Stirring%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Accelerated Biochemistry by Chaotic Stirring.</a> , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

Akış ve kimyasal reaksiyon arasındaki etkileşimi kaotik adveksiyon etkisi altında önemli ölçüde değiştirebilir. Ama bu karmaşık akış devletler, özellikle 3D efektleri önemli hale gerçekçi geometrileri, çalışma zorlu. Saat Rayleigh-Benard konveksiyon / d&gt; 1 sadece bu olayları araştırmak için uygun bir platform sağlar, PCR işlemi gerçekleştirmek için uygulama probed olmak akışı ve kimyasal tepkimeler arasındaki kaplin sağlar. Bu benzersiz yeteneği kaotik etkileri hareket (Sezgilere) DNA replikasyon oranı hızlandırmak için en iyi akışı seçmek için mümkün kılar.

<table><tbody><tr><td>KOD DNA Polimeraz kiti</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>71085-3</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan &amp;#946;-aktin Kontrol Reaktifleri kiti</td><td>Applied Biosystems</td><td>401846</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum bant</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-AS-200</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X Buğu Önleyici</td><td>SOPUS Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uzun Jel Yükleme Pipet Uçları</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-151</td><td></td></tr><tr><td>FEP Teflon bant</td><td>McMaster-Carr</td><td>7562A17</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz jel</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3107</td><td></td></tr><tr><td>TAE yürütme tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>141-0743</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>6x Turuncu Yükleme Boyası</td><td>Fermentas</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA merdiven boyutlandırma belirteci</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8202</td><td></td></tr></tbody></table>

mikro termal isı yayımı kullanarak rapid pcr thermocycling

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Birçok moleküler biyoloji deneyleri, başlangıçta seyreltik bir hedef DNA saptanabilir bir konsantrasyon seviyesini yükseltmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bir şekilde bağlıdır. Ancak geleneksel PCR thermocycling donanım tasarımı, ağırlıklı olarak, sıcaklık termoelektrik ısıtıcılar tarafından düzenlenir ciddi ulaşılabilir reaksiyon hızı 1 sınırlar büyük metal ısıtma blokları dayanmaktadır . Önemli ölçüde elektrik gücü, aynı zamanda taşınabilir bir formatta bu araçları dağıtmak için yeteneğini sınırlayan reaktif karışımı tekrar tekrar ısıtmak ve soğutmak için gereklidir. Termal konveksiyon bu sınırlamaları aşmak için 2-9 potansiyeline sahiptir, gelecek vaat eden bir alternatif thermocycling bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır . Konvektif akımları Dünya&#39;nın atmosfer, okyanuslar, ve iç, dekoratif ve renkli lav lambaları arasında değişen ayarları çeşitli bir dizi gündelik bir olay. Akışkan hareket her iki durumda da aynı şekilde başlatılır: kaldırma kuvveti tahrikli bir istikrarsızlık, sınırlı bir sıvı hacmi mekansal bir sıcaklık gradyanı maruz kaldığında ortaya çıkar. Bu aynı olgunun PCR thermocycling gerçekleştirmek için çekici bir biçimde sunuyoruz. Uygun olarak tasarlanan bir reaktörde, geometri boyunca statik bir sıcaklık gradyanı uygulayarak, sürekli bir dolaşım akışı, denatüre tavlama ve reaksiyon (Şekil 1) uzantısı aşamaları ile ilgili sıcaklık bölgeleri boyunca tekrar tekrar PCR taşıyacak kurulabilir. Thermocycling nedenle cihazın tekrar tekrar ısıtmak ve soğutmak için tamamen ihtiyacını ortadan kaldırarak, sadece sabit sıcaklıklarda iki karşıt yüzey tutarak bir pseudo-izotermal şekilde harekete olabilir. Konvektif thermocyclers tasarımı karşı karşıya kaldığı temel güçlüklerden biri, tam reaktifler sırayla 10,11 zaman yeterli bir süre için doğru sıcaklık bölgeleri işgal sağlamak için reaktör içinde mekansal hız ve sıcaklık dağılımları kontrol etmek için ihtiyaç vardır . Burada tam 3-D hız ve sıcaklık dağılımları microscale konvektif thermocyclers 12 prob çabalarımız sonuçlarını açıklar. Beklenmedik bir şekilde, karmaşık akış yörüngeleri reaktifler optimum sıcaklık profillerinin tam kapsamlı örnek için geliştirilmiş bir fırsat sağladığı akış yolları arasında (1) sürekli döviz sinerjik bir kombinasyonu nedeniyle PCR için son derece elverişli bir alt kümesi keşfedilen ve ( 2) artan zamanlı PCR adım sınırlayıcı uzantısı sıcaklık bölgesi içindeki oranı geçirdi. Son derece hızlı DNA amplifikasyonu kez (10 dk altında) bu akışları oluşturmak için tasarlanmış reaktörlerde ulaşılabilir.

Biz, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile DNA replikasyonu gerçekleştirmek için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Termal konveksiyon sabit sıcaklıkta reaktör yüzeyler karşı koruyarak, denatüre, tavlama ve kullandırım koşullarının arasında sürekli mekik reaktifleri koşulmuştur. Bu doğal olarak basit tasarımı, hızlı PCR daha erişilebilir hale getirmek için vaat ediyor.

Mikro Termal Isı Yayımı kullanarak Rapid PCR Thermocycling

Birçok moleküler biyoloji analizi, başlangıçta seyrelmiş olan bir hedef DNA örneğini saptanabilir bir düzeye getirmek için bir şekilde polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanır...

Bu prosedürün genel amacı, termal konveksiyon yoluyla PCR Termodöngü prensibinin gerçek bir reaksiyonu yürütmek için nasıl uygulanabileceğini göstermektir. Bu, öncelikle doğal konveksiyon termodöngüsünün nasıl çalıştığı fikrinin temel tasarım prensipleriyle birlikte sunulmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise reaktör kartuşunun nasıl hazırlanacağını ve reaktiflerin içine nasıl yükleneceğini göstermektir.Prosedürün üçüncü adımı, reaktör kartuşunun ısıtıcı üniteye yerleştirilmesi ve reaksiyonun başlatılmasıdır. Prosedürün son adımı ise reaksiyon sonrası reaktiflerin çıkarılması ve sonuçların jel elektroforezi ile kontrol edilmesidir. Nihayetinde, doğal konveksiyonlu PCR Termodöngü aracılığıyla hızlı DNA replikasyonu gerçekleştiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben Texas A&amp;M Üniversitesi'ndeki UGAs laboratuvarından Radha OU. Bugün size, lava lambasına benzer şekilde doğal konveksiyon kullanarak hızlı PCR Termodöngüleme gerçekleştirme prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, bu prensipten yararlanan termodöngüleme cihazlarının tasarımı ve optimizasyonunu incelemek amacıyla laboratuvarımızda kullanıyoruz.Öyleyse başlayalım. Bu protokol, basit bir konvektif termosikleme cihazının tasarımı ve inşası ile başlamaktadır. Bu gösterim için kullanılan cihaz, sıcaklıkları bağımsız olarak kontrol edilen iki alüminyum plaka arasında sandviç şeklinde yerleştirilen, değiştirilebilir plastik reaksiyon odası kartuşlarından oluşmaktadır.Silindirik reaktör kuyucukları, istenen en-boy oranlarına ulaşmak için farklı toplam çap ve plastik levha kalınlığı kombinasyonları kullanılarak polikarbonat bloklarda delik dizileri işlenerek oluşturulmuştur. Optimal tasarım, PCR sürecindeki temel sıcaklıklar boyunca reaktifleri taşıyabilen bir sirkülasyon akışı oluşturacak doğru reaktör geometrisinin seçilmesini içerir. Burada ele alınan silindirik reaktörlerde değiştirilebilen geometrik parametreler yükseklik ve çap veya buna eşdeğer olarak en-boy oranıdır.Reaktörün alt yüzeyi, mikroişlemci kontrollü bir sıcaklık kontrol ünitesine bağlı kartuş ısıtıcılar içeren bir alüminyum blok kullanılarak ısıtılır. Reaktörün üst yüzeyindeki sıcaklık, sirkülasyonlu bir su banyosuna bağlı alüminyum bir blok aracılığıyla düzenlenir. Karşıt alüminyum bloklar arasındaki termal iletimi sınırlamak için tüm düzenek naylon vidalarla birbirine sabitlenir.Her bir 100 µL'lik PCR reaksiyonunu; 10 kat konsantrasyonlu tampon çözeltisi, 25 mM magnezyum klorür, iki dNTP, distile su, beta aktin probu, ileri primer, geri primer, insan genomik şablon DNA ve K-O-D-D-N-A polimerazı karıştırarak hazırlayın. Reaktifleri eklemeden önce, PCR odasının alt yüzeyini ince bir alüminyum bant tabakasıyla mühürleyin; reaktör kuyucuklarını 10 mg/mL'lik sığır serum albümini sulu çözeltisiyle durulayın ve ardından Rain-X buğu önleyici uygulayın. Son olarak, reaktifleri jel yükleme uçları kullanarak reaktör kuyucuklarına pipetleyin ve üst yüzeyi FEP Teflon bant ile mühürleyin.Reaksiyona başlamadan önce her iki alüminyum bloğu da istenen üst ve alt yüzey sıcaklıklarına kadar ön ısıtmaya tabi tutun. PCR reaktifleri yüklü plastik reaktörü alüminyum ısıtma bloklarının arasına yerleştirin ve düzeneği naylon vidalar kullanarak hızlıca birbirine sabitleyin. Reaksiyon istenen süre boyunca ilerledikten sonra ısıtıcıları kapatın ve konvektif akışı durdurup cihazı hızla soğutmak için cihazın alt ısıtmalı yüzeyini soğutulmuş bir metal bloğun üzerine yerleştirin.Plastik reaktörü çıkarın ve sonraki analizler için kuyucuklardaki ürünleri pipetle alın. 10 gram agarozu 500 mililitre 1x tampon çözelti ile, çözelti berraklaşana kadar karıştırıcılı sıcak plakada ısıtarak %2'lik bir agaroz jel hazırlayın. Agaroz jeli döküm kalıbına aktarın ve tarağı yerleştirin.Jelin yaklaşık 30 dakika boyunca donmasını bekleyin. Tarağı çıkarın ve jel tamamen örtülene kadar 1X TAE tamponu ekleyin. 2 µL 100X cyber green kullanarak floresan boyalı DNA örnekleri hazırlayın.İki mikrolitre DNA örneği, iki mikrolitre altı katı turuncu yükleme boyası ve dört mikrolitre TAE tamponu karıştırılarak bir çözelti hazırlayın. 100 baz çiftlik DNA merdiveni boyut belirleyiciyi ve DNA örneklerini jelin kuyucuklarına yükleyin. Jeli 60 volt değerinde bir saat boyunca çalıştırarak DNA'yı ayırın.Jeli çıkarın ve sonucu elde etmek için UV ışığı altında fotoğraflayın. Konvektif PCR reaktörlerinin içindeki 3B akış alanları, hesaplamalı akışkanlar dinamiği veya CFD kullanılarak farklı en-boy oranları aralığında incelenmiştir. Bu veriler, karmaşık modellerin ortaya çıkabileceğini ve bu karmaşık akış alanlarının bir kısmının reaksiyonu önemli ölçüde hızlandırabileceğini ortaya koymuştur.Bu geometrik etkiler, yüksek ve düşük en-boy oranına sahip reaktörlerdeki akış alanlarının yüksek en-boy oranlı bir reaktörle karşılaştırılmasıyla net bir şekilde görülebilir. Akışkan elemanları yörüngeler boyunca etkilenerek, esasen kapalı döngüler oluşturan ve uzun süreler boyunca aynı yolları izlemeye mahkum olan rotalar çizerler. Sonuç olarak, reaktifleri PCR için optimal termal koşullar dizisine maruz bırakan akış yörüngeleri ile amplifikasyona katkıda bulunmayan çok daha büyük sayıdaki geri kalan yörüngeler arasında değişim gerçekleşme olasılığı oldukça düşüktür.Akış alanı, daha küçük bir en-boy oranında çok daha farklıdır. Akış alanı, akışkan eleman yörüngelerinin artık kapalı yollar izlememesi nedeniyle daha kaotiktir. Reaksiyonlar daha karmaşık bir sıcaklık profiline maruz kalsa da, akışkan elemanlar çok daha geniş bir yörünge aralığını keşfedebildikleri için reaktif hacminin daha büyük bir kısmı optimal termal profilleri deneyimleme fırsatı bulur.Bu sonuçlar, H/D oranı dokuz olduğunda bireysel akış yörüngelerinin, geleneksel bir termosayklerda kullanılanlara benzer sıcaklık profilleri oluşturarak PCR için daha uygun görünebileceğini düşündürmektedir. Ancak H/D oranı üç olduğunda akış alanının kaotik doğası, gelişmiş değişimi teşvik ederek reaktiflerin uygunsuz yörüngelerde çok uzun süre hapsolmamasını sağlar ve nihayetinde küresel ölçekte baskın hale gelir. Bu hipotezi test etmek ve hangi reaktör geometrisinin PCR için daha uygun olduğunu belirlemek amacıyla, her iki silindir de insan genomik DNA şablonundan beta actin geni ile ilişkili 295 baz çiftlik bir hedef dizinin PCR replikasyonunu gerçekleştirmek için kullanılmıştır; doğru hedef ürünün amplifikasyonu, H/D oranı üç olduğunda yalnızca 10 dakika içinde defalarca sağlanmıştır.Aksine, H/D oranı dokuz olduğunda saptanabilir ürünlerin gözlemlenmesi için aynı reaksiyonun en az 20 dakika sürmesi gerekmiştir. Reaksiyon özgünlüğü, tek bir PCR ürününün elde edildiği H/D oranı üç değerinde de çok daha yüksektir. Akış alanının akışkan elemanlarını uzun süreler boyunca uygun olmayan termal yörüngelerde hapsettiği H/D oranı dokuz değerinde ise çok sayıda özgün olmayan ürün oluşmaktadır.Konvektif akışlı bir termosaykler kullanarak PCR reaksiyonunun nasıl yürütüleceğini göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, reaktör haznesi içerisindeki reaktiflerin hava boşluğu bırakılmadan mühürlendiğinden emin olmak önemlidir. Hava boşlukları, içerideki akış alanını bozarak reaksiyonu inhibe edecektir.Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.

rapid-pcr-thermocycling-using-microscale-thermal-convection

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Thermo Scientific Matrix çok kanallı pipet ile el gibi bir robot kullanarak qPCR için 96-iyi dizileri Biz ön microRNA kurulum ve analiz gösterecektir.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

PCR birçok moleküler biyoloji laboratuvarlarında yaygın bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Pek çok geleneksel PCR protokolleri için hızlı bir kılavuzdur burada sağlanan. Her bir reaksiyon benzersiz bir deneyde, bir ürün üretmek için gerekli değişir uygun koşullar olmasıdır. Bir reaksiyonla değişkenlerini anlama büyük ölçüde böylece istenilen sonucu elde etmek şansı artan giderme verimi artıracaktır.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Temel Protokol Plus, Sorun ve Optimizasyon Stratejileri

Protein misfolding siklik amplifikasyon (PMCA) Prion dönüşüm ve zorlanma ve tür engellerin çalışma için bir in vitro testtir. Aynı zamanda, bir prion saptama sistemi olarak da kullanılabilir.

Prionlar protein misfolding Döngüsel Amplifikasyon

Pyrosequencing, bakteri türleri tespit bakteri suşları ayrım ve anti-mikrobiyal ajanlara karşı direnç kazandıran genetik mutasyonları tespit etmek için kullanılabilir mikrobiyal genom dizileme kolaylaştıran bir çok yönlü bir tekniktir. Bu videoda, mikrobiyal amplikon üretimi, amplikon pyrosequencing ve DNA dizi analizi için prosedür gösterilecektir.

Mikrobiyal Tanımlama ve Karakterizasyonu için Pyrosequencing

Biz beyin omurilik sıvısı (BOS) microRNA profili gerçek zamanlı PCR bir protokol açıklar. RNA ekstre etme protokolleri hariç, prosedür diğer vücut sıvıları, kültürlenmiş hücreler ya da doku örneklerinden elde edilen RNA ile uzatılabilir.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

Bu iletişim kuralı kritik adımlar ve yama-kelepçe sonra tek hücre multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için gereken önlemleri açıklar. Bu teknik ifade profil genler tarafından yama-kelepçe kayıtları ile karakterize bir tek hücreden önceden belirlenmiş bir dizi analiz etmek için basit ve etkili bir yöntemdir.

Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

cDNA'nın kinetik çapraz bağlanması ve analizi, canlı hücrelerdeki protein-RNA etkileşimlerinin dinamiklerinin yüksek zamansal çözünürlükte araştırılmasını sağlayan bir yöntemdir. Burada protokol, maya hücrelerinin büyümesi, UV çapraz bağlama, hasat, protein saflaştırma ve yeni nesil dizileme kütüphanesi hazırlama adımları dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

Bu protokol, bir mikroakışkan çipe dayalı bir sürekli akışlı polimeraz zincir sisteminin nasıl oluşturulacağını ve laboratuvarda bir kapiler elektroforez sisteminin nasıl oluşturulacağını açıklar. Laboratuvarda nükleik asitlerin analizi için basit bir yöntem sunar.

Escherichia coli'nin Sürekli Akış-PCR Mikroakışkan Çipinde Amplifikasyonu ve Kapiler Elektroforez Sistemi ile Tespiti

Doku sindirim ve PCR okuma da dahil olmak üzere bir fare kuyruğu örnek tam genotipleme, bir ve bir buçuk saat Sigma'nın SYBR Green Özü-N-Amp Doku PCR kiti kullanılarak yapılır.

Sigma&#39;nın Özü-N-Amp Doku PCR Kit kullanarak Fare Doku hızlı Genotiplendirme

Solaris qPCR Gen İfadesi Tahlilleri testinin özgüllük ve sağlamlık ödün vermeden qPCR sürecini kolaylaştırmak için tasarlanmış yeni önceden tasarlanmış qPCR primer / prob kombinasyonları.

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

Keşfedin termal konveksiyon kullanarak hızlı PCR termosikling yöntemini. Bu yenilikçi yaklaşım, DNA amplifikasyonunu basitleştirir ve reaktiflerin sürekli sıcaklık bölgeleri arasında hareketini sağlayarak reaksiyon hızını artırır.

Mikro Termal Isı Yayımı kullanarak Rapid PCR Thermocycling

Daha fazla video keşfet