Mikro Termal Isı Yayımı kullanarak Rapid PCR Thermocycling

Bu prosedürün genel amacı, termal konveksiyon yoluyla PCR Termodöngü prensibinin gerçek bir reaksiyonu yürütmek için nasıl uygulanabileceğini göstermektir. Bu, öncelikle doğal konveksiyon termodöngüsünün nasıl çalıştığı fikrinin temel tasarım prensipleriyle birlikte sunulmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise reaktör kartuşunun nasıl hazırlanacağını ve reaktiflerin içine nasıl yükleneceğini göstermektir.

Prosedürün üçüncü adımı, reaktör kartuşunun ısıtıcı üniteye yerleştirilmesi ve reaksiyonun başlatılmasıdır. Prosedürün son adımı ise reaksiyon sonrası reaktiflerin çıkarılması ve sonuçların jel elektroforezi ile kontrol edilmesidir. Nihayetinde, doğal konveksiyonlu PCR Termodöngü aracılığıyla hızlı DNA replikasyonu gerçekleştiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Texas A&M Üniversitesi'ndeki UGAs laboratuvarından Radha OU. Bugün size, lava lambasına benzer şekilde doğal konveksiyon kullanarak hızlı PCR Termodöngüleme gerçekleştirme prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, bu prensipten yararlanan termodöngüleme cihazlarının tasarımı ve optimizasyonunu incelemek amacıyla laboratuvarımızda kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Bu protokol, basit bir konvektif termosikleme cihazının tasarımı ve inşası ile başlamaktadır. Bu gösterim için kullanılan cihaz, sıcaklıkları bağımsız olarak kontrol edilen iki alüminyum plaka arasında sandviç şeklinde yerleştirilen, değiştirilebilir plastik reaksiyon odası kartuşlarından oluşmaktadır.

Silindirik reaktör kuyucukları, istenen en-boy oranlarına ulaşmak için farklı toplam çap ve plastik levha kalınlığı kombinasyonları kullanılarak polikarbonat bloklarda delik dizileri işlenerek oluşturulmuştur. Optimal tasarım, PCR sürecindeki temel sıcaklıklar boyunca reaktifleri taşıyabilen bir sirkülasyon akışı oluşturacak doğru reaktör geometrisinin seçilmesini içerir. Burada ele alınan silindirik reaktörlerde değiştirilebilen geometrik parametreler yükseklik ve çap veya buna eşdeğer olarak en-boy oranıdır.

Reaktörün alt yüzeyi, mikroişlemci kontrollü bir sıcaklık kontrol ünitesine bağlı kartuş ısıtıcılar içeren bir alüminyum blok kullanılarak ısıtılır. Reaktörün üst yüzeyindeki sıcaklık, sirkülasyonlu bir su banyosuna bağlı alüminyum bir blok aracılığıyla düzenlenir. Karşıt alüminyum bloklar arasındaki termal iletimi sınırlamak için tüm düzenek naylon vidalarla birbirine sabitlenir.

Her bir 100 µL'lik PCR reaksiyonunu; 10 kat konsantrasyonlu tampon çözeltisi, 25 mM magnezyum klorür, iki dNTP, distile su, beta aktin probu, ileri primer, geri primer, insan genomik şablon DNA ve K-O-D-D-N-A polimerazı karıştırarak hazırlayın. Reaktifleri eklemeden önce, PCR odasının alt yüzeyini ince bir alüminyum bant tabakasıyla mühürleyin; reaktör kuyucuklarını 10 mg/mL'lik sığır serum albümini sulu çözeltisiyle durulayın ve ardından Rain-X buğu önleyici uygulayın. Son olarak, reaktifleri jel yükleme uçları kullanarak reaktör kuyucuklarına pipetleyin ve üst yüzeyi FEP Teflon bant ile mühürleyin.

Reaksiyona başlamadan önce her iki alüminyum bloğu da istenen üst ve alt yüzey sıcaklıklarına kadar ön ısıtmaya tabi tutun. PCR reaktifleri yüklü plastik reaktörü alüminyum ısıtma bloklarının arasına yerleştirin ve düzeneği naylon vidalar kullanarak hızlıca birbirine sabitleyin. Reaksiyon istenen süre boyunca ilerledikten sonra ısıtıcıları kapatın ve konvektif akışı durdurup cihazı hızla soğutmak için cihazın alt ısıtmalı yüzeyini soğutulmuş bir metal bloğun üzerine yerleştirin.

Plastik reaktörü çıkarın ve sonraki analizler için kuyucuklardaki ürünleri pipetle alın. 10 gram agarozu 500 mililitre 1x tampon çözelti ile, çözelti berraklaşana kadar karıştırıcılı sıcak plakada ısıtarak %2'lik bir agaroz jel hazırlayın. Agaroz jeli döküm kalıbına aktarın ve tarağı yerleştirin.

Jelin yaklaşık 30 dakika boyunca donmasını bekleyin. Tarağı çıkarın ve jel tamamen örtülene kadar 1X TAE tamponu ekleyin. 2 µL 100X cyber green kullanarak floresan boyalı DNA örnekleri hazırlayın.

İki mikrolitre DNA örneği, iki mikrolitre altı katı turuncu yükleme boyası ve dört mikrolitre TAE tamponu karıştırılarak bir çözelti hazırlayın. 100 baz çiftlik DNA merdiveni boyut belirleyiciyi ve DNA örneklerini jelin kuyucuklarına yükleyin. Jeli 60 volt değerinde bir saat boyunca çalıştırarak DNA'yı ayırın.

Jeli çıkarın ve sonucu elde etmek için UV ışığı altında fotoğraflayın. Konvektif PCR reaktörlerinin içindeki 3B akış alanları, hesaplamalı akışkanlar dinamiği veya CFD kullanılarak farklı en-boy oranları aralığında incelenmiştir. Bu veriler, karmaşık modellerin ortaya çıkabileceğini ve bu karmaşık akış alanlarının bir kısmının reaksiyonu önemli ölçüde hızlandırabileceğini ortaya koymuştur.

Bu geometrik etkiler, yüksek ve düşük en-boy oranına sahip reaktörlerdeki akış alanlarının yüksek en-boy oranlı bir reaktörle karşılaştırılmasıyla net bir şekilde görülebilir. Akışkan elemanları yörüngeler boyunca etkilenerek, esasen kapalı döngüler oluşturan ve uzun süreler boyunca aynı yolları izlemeye mahkum olan rotalar çizerler. Sonuç olarak, reaktifleri PCR için optimal termal koşullar dizisine maruz bırakan akış yörüngeleri ile amplifikasyona katkıda bulunmayan çok daha büyük sayıdaki geri kalan yörüngeler arasında değişim gerçekleşme olasılığı oldukça düşüktür.

Akış alanı, daha küçük bir en-boy oranında çok daha farklıdır. Akış alanı, akışkan eleman yörüngelerinin artık kapalı yollar izlememesi nedeniyle daha kaotiktir. Reaksiyonlar daha karmaşık bir sıcaklık profiline maruz kalsa da, akışkan elemanlar çok daha geniş bir yörünge aralığını keşfedebildikleri için reaktif hacminin daha büyük bir kısmı optimal termal profilleri deneyimleme fırsatı bulur.

Bu sonuçlar, H/D oranı dokuz olduğunda bireysel akış yörüngelerinin, geleneksel bir termosayklerda kullanılanlara benzer sıcaklık profilleri oluşturarak PCR için daha uygun görünebileceğini düşündürmektedir. Ancak H/D oranı üç olduğunda akış alanının kaotik doğası, gelişmiş değişimi teşvik ederek reaktiflerin uygunsuz yörüngelerde çok uzun süre hapsolmamasını sağlar ve nihayetinde küresel ölçekte baskın hale gelir. Bu hipotezi test etmek ve hangi reaktör geometrisinin PCR için daha uygun olduğunu belirlemek amacıyla, her iki silindir de insan genomik DNA şablonundan beta actin geni ile ilişkili 295 baz çiftlik bir hedef dizinin PCR replikasyonunu gerçekleştirmek için kullanılmıştır; doğru hedef ürünün amplifikasyonu, H/D oranı üç olduğunda yalnızca 10 dakika içinde defalarca sağlanmıştır.

Aksine, H/D oranı dokuz olduğunda saptanabilir ürünlerin gözlemlenmesi için aynı reaksiyonun en az 20 dakika sürmesi gerekmiştir. Reaksiyon özgünlüğü, tek bir PCR ürününün elde edildiği H/D oranı üç değerinde de çok daha yüksektir. Akış alanının akışkan elemanlarını uzun süreler boyunca uygun olmayan termal yörüngelerde hapsettiği H/D oranı dokuz değerinde ise çok sayıda özgün olmayan ürün oluşmaktadır.

Konvektif akışlı bir termosaykler kullanarak PCR reaksiyonunun nasıl yürütüleceğini göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, reaktör haznesi içerisindeki reaktiflerin hava boşluğu bırakılmadan mühürlendiğinden emin olmak önemlidir. Hava boşlukları, içerideki akış alanını bozarak reaksiyonu inhibe edecektir.

Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.