Sıçanlarda Aktif Gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH) İndüksiyon ve İzlenmesi

Merhaba, ben Christine Beaton. UCI'daki Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'nde, George Chandy laboratuvarında çalışıyorum. Bugün size sıçanlarda aktif DTH'nin nasıl indükleneceğini göstereceğim.

Bunun için, antijenim olan KLH'nin Freon adjuvan içindeki bir emülsiyonunu hazırlayacağım. Ardından bu emülsiyonu Lewis sıçanlarının kuyruk tabanına enjekte edeceğim. Bu işlem, sıçanların KLH'ye karşı bağışıklık kazanmasını sağlayacak. Bir hafta sonra sıçanları KLH ile challenge edeceğim ve DTH reaksiyonunu, şişliği ölçerek belirleyeceğim.

Burası meydan okuma bölgesidir ve PO kanal blokerlerinin DTH gibi enflamatuar reaksiyonlar üzerindeki etkisini gözlemlemek için laboratuvarda bunu kullanıyoruz. İşte emülsiyonu hazırlamak için kullanacağım eksik Freund adjuvanı. Ayrıca tam Freund adjuvanı da kullanabilirdim.

Bugünküle antijenim olan KLH kuvarsları burada ve burada ml başına iki miligramlık bir çözeltim var. PBS içinde, eksik tamamlanmış trans adjuvanı çıkarmak ve 15 mil tüpe aktarmak için bu 5 ml'lik şırıngayı kullanacağım. Ardından tüpü vortekse yerleştireceğim ve vorteksleme işlemi sırasında, antijenimi damla damla adjuvana ekleyeceğim.

Ardından, beş dakika daha vorteksleyeceğim. Bu işlem tamamlandıktan sonra, bu 5 M'lık cam şırıngayı karışımla dolduracağım; adjuvant plastikleri aşındırma eğiliminde olduğu için cam şırınga kullanılması gerekmektedir. Emülsiyon hazırlamak için bulduğumuz 5 M'lık şırıngaların en uygun olduğunu gördük.

Daha küçük veya daha büyük olanlar o kadar iyi değildir. Şırıngamı karışımla doldurduğumda, bu cam şırıngayı başka bir beş mil'lik cam şırıngaya bağlamak için bu metal köprüyü kullanacağım. Ardından, emülsiyon iyice sertleşene kadar karışımın bir şırıngadan diğerine mümkün olduğunca hızlı geçmesini sağlamak için şırıngalara basınç uygulayacağım ve böylece enjeksiyona hazır hale gelecektir.

Şimdi 2,5 mL adjuvan ekleyeceğim. Adjuvanı daha kolay alabilmek için önce hava enjekte ediyorum ve ardından adjuvanın tamamını tüpüme aktarıyorum. Şimdi yapacağım işlem, bunlardan 2,5 mL alıp vorteks cihazında karıştırarak eklemek olacak.

Adjuvanın 2,5 µL'sini aldığım için, KLH'den de 2,5 µL alacağım. Damla damla ekledikçe, karışımın renginin değiştiğini ve beyazladığını göreceksiniz. Böylece tüm antijeni adjuvana eklemiş oldum.

Şimdi yapacağım işlem, karışımı beş dakika daha vortekslemektir. Ancak tüpü beş dakika boyunca elimde tutmak istemediğim için, tüpü vorteks cihazına bantlayacağım. Tüpün içinde vorteks oluşturmak için mümkün olan en yüksek hızı ayarlamanız gerekir; ancak karışımın taşmamasına dikkat etmelisiniz. Bu şekilde beş dakika boyunca bırakacağım.

Böylece beş dakika doldu. Şimdi vorteksi durduracağım ve karışımım beyaz renkte. Bu yüzden tüpü dışarı çıkarıyorum. Eyvah.

Karışım şu an tamamen beyaz ancak hâlâ oldukça sıvı. Enjeksiyon için daha katı bir yapı istediğimden, tüm karışımı 5 mL'lik bir cam şırıngaya aktaracağım.

Bu şırıngalar otoklavlanmıştır. Bu nedenle, bir şırıngayı komple köprüme bağlıyorum. Diğer şırıngadan ise sadece gövde kısmını bağlıyorum.

Pistonu dışarıda bırakıyorum ve ardından karışımımı üst şırıngaya döküyorum. Her şeyi alt şırıngaya aktaracağım. Sonrasında ise burada oluşan hava kabarcığını itmem gerekiyor.

Şimdi üstteki şırıngayı ayıracağım ve hava kabarcığını dışarı iteceğim. Kabarcığı görmek zor ancak tam burada. Bu yüzden hava kabarcığını dışarı itiyorum.

Karışımı köprüden dışarı itiyorum ve ardından üst şırıngayı yeniden bağlıyorum. Her şeyin sıkıca bağlandığından emin oluyorum ve ardından karışımı bir şırıngadan diğerine aktarıyorum. Başlangıçta bu işlem kolaydır, ancak kısa süre sonra karışım sertleşmeye başlayacaktır.

Bu nedenle bu gece işlem zorlaşıyor ve köprüyü bozmak istemiyorum, bu yüzden sadece şırıngalarımı çeviriyorum. Bazen daha uzun sürüyor. Emülsiyondan emülsiyona farklılık gösterir.

Muhtemelen sıcaklığa ve ayrıca nem seviyesine bağlıdır. Ancak emülsiyonumun hazır olduğunu düşünüyorum. Döktüğüm zamankinden çok daha kıvamlı görünüyor.

Tamamen beyazdır. Ve sadece tek bir faz vardır. ACO fazının yağdan ayrılması asla gerçekleşmemelidir.

Artık enjekte edilmeye hazır. Artık imersiyon enjekte edilmeye hazır. Enjekte etmek için her hücreye 200 µL enjekte edeceğim.

Bunun için üç ml'lik şırıngalar kullanacağım. Emülsiyon çok yoğun olabilir ve enjekte etmesi zorlaşabilir, bu nedenle iğnenin yerinden çıkmadığından emin olmak için Luer-lock uçlu şırıngalar kullanıyorum. İğneler konusunda ise, emülsiyonun geçişine izin veren mümkün olan en küçük iğneleri kullanmaya çalışıyorum.

Ve bu emülsiyon için 20 G 3G'liklerin yeterli olduğunu gördüm. Daha kıvamlı emülsiyonlar için daha büyük şırıngalar kullanmanız gerekebilir. Uygulama yöntemimiz ise şöyledir; bir kişi sıçanı tutarken diğer kişi enjeksiyonu gerçekleştirir.

Ve maksimum güvenlik için, sıçanlar çok sakin olmalarına ve tutulmaya alışkın olmalarına rağmen, sıçanları tutan kişi maksimum güvenlik adına kemirgen dişlerine dayanıklı eldivenler kullanır; sıçan tarafından ısırılmak istemeyiz. Böylece tüm emülsiyonu bir cam şırıngaya koyuyorum ve boş cam şırıngayı köprüden ayırıyorum. Onun yerine 3 ml'lik plastik Luer lock şırıngamı yerleştiriyorum.

Şimdi, bir emülsiyon hattı için ihtiyacımdan fazlasını transfer ediyorum. Hava kabarcığını dışarı itiyorum. Her hat başına 200 µL enjekte edeceğim için, şırıngamda 300 µL bırakıyorum.

Köprüyü ayırıyorum, iğneyi plastik şırıngama takıyorum, ardından iğneyi doldurup pistonu 200 microliters seviyesine indiriyorum. Bu sayede hava kabarcığı kalmadığından emin oluyorum. Artık enjeksiyon yapmaya hazırız.

Sıçağın hareket etmediğinden emin olmak istiyoruz. Bu yüzden sıçağı kavrayıp bir parmağımı omzun üzerine, birini ise altına yerleştiriyorum; diğer elimle arka bacakları ve kuyruğu tutuyorum. Enjeksiyonu yan bölgelere gerçekleştireceğiz; bu tarafa on mikroliter, diğer tarafa ise on mikroliter uygulayacağız. Geçen hafta sıçanları, antijen olarak KLH içeren bir emülsiyonla immunize ettim.

Bugün, antijenim olan KLH ve ilgili bir antijen olan o albumin ile sırt bölgelerinden intradermal olarak challenge yapacağım; ancak sırtlarına intradermal enjeksiyon yapabilmek için önce onları tıraş etmem gerekiyor. Bunun için basit bir elektrikli tıraş makinesi kullanıyorum. Evet, iğnenin körelmediğinden emin olmak için her sıçan arasında iğneleri değiştiriyorum.

Bu işlemle intradermal enjeksiyon yapmak çok daha kolaylaşır, özellikle her bir antijenden 20 microliters gibi küçük hacimler enjekte ediyorum. Böylece tüm sıçanlara iki antijenimi enjekte etmiş oldum ve onları yarına kadar kafeslerinde bırakacağım. Yarın bir inflamasyon gözlemleyebileceğiz.

Böylece enjeksiyon bölgesi kızaracak ve şişecek, böylece inflamasyonun bir ölçüsü olarak inflamasyon bölgesinin çapını ölçebileceğiz. Dün sıçanların sırtına intradermal olarak ilgili antijenim olan KLH'yi ve ilgisiz bir antijen olan albümini uyguladım. Şimdi 24 saat sonra sıçanları inceleyeceğim ve inflamasyon olup olmadığına bakacağım.

Bu nedenle, yalnızca KLH uygulama bölgesinde enflamasyon bekliyorum ve enflamasyon kızarıklık ve şişkinlik şeklinde görülecektir. Enflamasyonu gözlemledikten sonra, etkilenen alanın çapını ölçerek enflamasyonlu bölgeyi ölçeceğim. Burası KLH enjekte edilen bölge ve görüldüğü üzere ciddi bir enflamasyon mevcut.

Normal cilde kıyasla çok kırmızı ve şişmiş durumda. Şimdi albümin alan diğer bölgeye bakarsak, enjeksiyon yerini tam burada görebilirsiniz ancak belirgin bir kızarıklık veya şişlik yoktur. Yani negatif kontrol çalıştı.

Şimdi inflamasyon bölgesini ölçeceğim. Bunun için standart bir cetvel kullanacağım ve ölçümü milimetre cinsinden yapacağım. Bu altı milimetre geliyor ve ikinci bir ölçüm daha yapıyorum.

Bu beş milimetre ağırlığında. Çok az kızarıklık var, ölçüm yapacağım ancak zarfı bir milimetre. Böylece size burada, bir antijenle emülsiyonun nasıl hazırlanacağını, sıçanların bu emülsiyonla nasıl immünize edileceğini, ardından bir hafta sonra immünizasyon için kullandığım antijenle ve ayrıca ilgili antijenle nasıl challenge edileceğini ve kullanılan ve Chan laboratuvarındaki inflamasyon derecesinin nasıl görselleştirilip ölçüleceğini gösterdim.

Bu tekniği, potasyum kanalı blokörlerinin sıçanlarda inflamasyon üzerindeki etkisini ölçmek için basit bir analiz olarak oldukça rutin bir şekilde kullanıyoruz.