Name: Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-24T17:50:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: Öğrenin fare hipokampal ve kortikal nöronların nükleofeksiyon ve kültür yöntemini. Bu teknik, akson çıkışı, sinaptogenez ve dendritik diken analizi çalışmaları için sinir gelişimini in vivo incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Tüm işlemler, Wisconsin Komitesi Hayvan Bakım Üniversitesi tarafından onaylanan ve NIH kurallar ile uyumlu idi. Biz onu Nucleofector cihazın cömert kullanımı için Dr. Katherine Kalil teşekkür ederim. Biz, protokol hakkında yorum yapmak için Dent laboratuvar üyeleri de teşekkür ederim. Bu çalışma, hibe NIH R01-NS064014 Dana Vakfı ve Whitehall Vakfı EWD için tarafından desteklenen Christopher Viesselmann, Jason Ballweg ve Derek Lumbard bu kağıt eşit katkıda bulunmuştur.

1. Lameller ve Odalar hazırlanması <ol><li> Temiz lamelleri ve odaların hazırlanması, sağlıklı kültürler için esastır. Kısayollar bu adımların herhangi alınmamalıdır. </li><li> Gecede özel bir cam kavanoz ya da beher konsantre nitrik asit (HNO3) - lamelleri (Carolina Yardımcısı Marka 12mm veya 22mm yuvarlak, Alman cam) yıkayın. </li><li> Lamelleri çıkarın ve nitrik asit (5-7x) deiyonize su ile iyice yıkayın. </li><li> Laminer akış başlığı veya biyogüvenlik kabini lamelleri ve kuru ayırın. Kuru, 30 dakika UV ışık ile sterilize edin. Lamelleri sterilize depolama için steril bir petri kutularının içine yerleştirin. 12mm lamelleri kaplama nöronlar doğrudan steril bir 35mm çanak lamelleri yeri ve Bölüm 2 geçin. </li><li> Görüntüleme odaları, 15mm delik 35mm petri kutularının altında bir bütün çapak kaldırmak delme ve parafin ve vazelin 3:1 karışımı ile temizlenmelidir lamelleri takılarak tarafından inşa edilmiştir. </li><li> Parafin / vazelin karışımı kaynayan su banyosu içinde konik bir tüp içinde eritin. Küçük bir boya fırçası ve 15mm delik etrafında çanak alt kat kullanın. Parafin / vazelin karışımı karıştırarak ayrı olarak tutmak için emin olun. Bu genellikle yemekler inkübatör yerleştirilir lamel dekolmanı, viskoz olacak vazelin daha yüksek bir konsantrasyon, birlikte yapıştırılmış odaları sonuçlanır. Kalan parafin / vazelin oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> Düz bir tepsi üzerine ters çanak aşağı yerleştirin ve üzerine lamel deliğe yerleştirin. Isı 80 ° C fırında parafin karışımı eriyene kadar (~ 10 dakika). Düz bir yüzeye yemekleri çıkarın ve parafin karışımı ayarlamanıza izin. </li><li> Bulaşıkları ters çevirin ve UV ışığı ile kapakları ve odalarının dipleri içi hem de sterilize edin. </li><li> Kat lamelleri veya odaları 1.0mg/mL bir saat borat tamponu (pH 8.5, 0.1M sodyum borat) Poly-d-lisin (30kDa) ile cam bölgeleri. 3-5 kez bol miktarda doku kültürü notu deiyonize su ile durulayın. Borat tamponu tüm izlerini silmek için emin olun. Kuru ve hemen veya daha sonra kullanmak üzere saklayın odaları / lamelleri kullanabilirsiniz. Biz genellikle, bir ay içinde hazırlık temizlenir lamelleri kullanın. </li></ol> 2. Nöronal Diseksiyon ve Kültür Orta hazırlanması <ol><li> Diseksiyon orta (DM), 10x HBSS ve 100X Hepes uygun miktarlarda doku kültürü sınıf su ekleyerek hazırlayın. 4 ° C saklayınız Diseksiyonu sırasında buz üzerinde tutun. </li><li> Diseksiyonu bir gün önce, kaplama, orta (PM) ve serum serbest orta (SFM) hazırlar. PM Neurobasal Orta, B27 takviyesi, 2 mM glutamin,% 0.3 glikoz, 37.5 mM NaCl ve% 5 fetal sığır serumu (FBS) oluşur. SFM Neurobasal Orta, B27 takviyesi, 2 mM glutamin,% 0.3 glikoz ve 37.5 mM NaCl oluşur. </li><li> Kap ile bir gecede inkübatör biraz aralık orta equilibrates sıcaklık ve CO 2 içeriği bu sadece bir doku kültürü diseksiyon ve mağaza için yeterli olun. Biz ekstra glikoz ve NaCl ile yaklaşık 310mOsm osmolalitesi artırmak. Kültürler daha fizyolojik osmolalitesi (Neurobasal osmolalitesi genellikle 205-245mOsm) daha iyi bulabilirsiniz. </li></ol> 3. Uzun vadeli Kültürler Kortikal Glial Besleyici Layer Hazırlık <ol><li> Uzun vadeli kültürleri hazırlanan edilecekse, kortikal ve hipokampal diseksiyonları devam protokol 2-3 hafta önce bu bölümü gerçekleştirin. </li><li> MEM ile orta glial (GM),% ​​0.3 glukoz, penisilin / streptomisin ve% 10 at serumu hazırlayın. </li><li> 5 dakika buz üzerinde soğutma P1-P3 fare yavrularının Euthanize. % 70 etanol ile buz ve sprey her yavru çıkarın. Makas ile hızlı bir şekilde işten çıkarmak. Soğuk DM (adım 2.1) içeren bir çanak tüm beyin çıkarın. </li><li> Iki serebral hemisferlerin ve meninks çıkarın. Vergi neokorteks ve herhangi bir ortam içeren yeni bir çanak kaldırmak. Toplam 4 beyinleri korteks hazırlayın. </li><li> Mümkün olduğunca iyi, temiz, steril bir jiletle korteks Kıyma ve soğuk DM 12 ml içeren 50 ml konik tüp plastik bir pipet ile doğranmış doku kaldırmak. Son konsantrasyonları için sırasıyla% 0.25 'lik (1.5 mL) ve% 0,1 (1,5 ml), tripsin ve DNaz ekleyin. Aralıklı dönen 10 dakika süreyle 37 ° C'lik su banyosunda inkübe edin. </li><li> Kortikal doku içeren tüp çıkarın ve doku kültürü kaputu içine getirmeden önce% 70 etanol ile iyice temizleyin. 10 ml pipet ile pipetleyin kortikal doku yukarı ve aşağı yaklaşık 10-15 kat kadar veya en parçaları kaybolur. </li><li> Aralıklı dönen başka bir 10 dakika boyunca bir su banyosunda 37 ° C tüp dönün. </li><li> % 70 etanol ile tüp iyice temizleyin ve doku kültürü kaputu geri getirmek. 5 m ile pipetleyin kortikal doku yukarı ve aşağıL pipet yaklaşık 10-15 kat kadar veya parçaları kaybolur. </li><li> 15 ml sıcak GM ve 10 dakika 200xg (1000rpm) santrifüj ekleyin. </li><li> Süpernatant atın, 20 ml taze GM pelet hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve bir hemasitometre ile sayar. GM 75cm 2 şişesi ortalama 15 ml Plaka 5-7.5x10 6 hücre. </li><li> Bir gün ve her kültür sonraki 2-3 gün sonra, elinizi karşı balon vurma gevşek hücreleri yerinden. Herhangi bir yerinden hücreleri ile birlikte orta çıkarın ve 15 ml taze GM ile değiştirin. </li><li> Yaklaşık% 70-100 konfluent glia, matara büyüme 1-2 hafta sonra hasat edilebilir. Glia ile kaplanmış bireysel lamelleri hazırlamak için küçük bir boya fırçası ile bir üçgen desen, yer 6 nitrik asit, 3 nokta her lamel üzerine parafin / vazelin 3:1 karışımı temizlenir ve 10cm çanak 25mm yuvarlak lamelleri steril ve yer . UV ışık ile 30 dakika süreyle açık yemekleri davranın. Kat lamelleri 0.1 mg / ml borat tamponu Poly-d-lisin (30kDa), bir saat sonra (3-5x) steril doku kültürü notu deiyonize su ile iyice yıkayın ve kurumaya bırakın. </li><li> Inkübatör glial içeren şişeyi çıkarın, orta atmak ve önceden ısıtılmış tripsin / EDTA çözeltisi 5 ml ile durulayın. Tripsin / EDTA çözeltisi şişeden çıkarın ve balonun içine taze önceden ısıtılmış tripsin / EDTA 3 mL pipetle. Az 1 dakika süreyle 37 ° C trypsinization durdurmak için 5 ml GM eklemeden önce şişeyi inkübe edin. </li><li> 10-15 kez pipetleme tekrarlanan balon glia çıkarın ve sonra 15 ml konik tüp medya transfer. 8 dakika 200xg (1000rpm) Santrifüj. Süpernatantı ve lamelleri içeren 10cm çanak başına GM 12.5 ml 10 ml GM, sayısı hücreleri, ve plaka 5x10 5 hücre eklemek. </li><li> Taze önceden ısıtılmış GM 2-3 günde bir orta Alım Satım. Nöron diseksiyonu bir gün önce, GM kaldırmak ve SFM (bölüm 2.2) ile değiştirin. Kortikal ve hipokampal kültürleri sel adım 4.12 Bu glial klimalı SFM kullanın. </li></ol> 4. Kortikal ve / veya Hipokampal Diseksiyon ve Elektroporasyon <ol><li> Nucleofection çözümleri (Lonza) uygun miktarlarda çıkarın, diseksiyon başlamadan önce, birleştirmek ve oda sıcaklığına kadar sıcak. Kombine edildiğinde Nucleofection çözüm sınırlı bir ömrü olduğundan, biz sadece her hazırlığı (transfeksiyon başına 100 mcL) için gerekli miktarı birleştirir. </li><li> CO 2 (fiş gün E0.5) E15.5 hamile bir fare Euthanize ve 10cm petri rahim kaldırmak. Soğuk DM (bölüm 2.1) fetus ve başını kesmek çıkarın. </li><li> Soğuk DM ayrı bir kapta içine tüm beyin çıkarın ve bükülmüş bir tungsten iğne ile, hem de neocortices kaldırmak. Soğuk DM yeni çanak içine microforceps ve yer korteks meninksler çıkarın. Küçük bir iris veya Wecker makas, soğuk DM 1.0 ml ile dolu bir 1.5 ml Eppendorf tüp korteks ve hipokampus ve yer çıkarın. Bu tüp buz tutun. </li><li> Tüm korteks veya hippocampi diseksiyon sonra, 20 dakika boyunca 37 ° C inkübatör doku ve yer tüp içeren Eppendorf tüp% 2.5 tripsin 110 mcL ekleyin. </li><li> Supernatant ve yıkama korteks veya hippocampi yavaşça tersine Eppendorf tüp ile 1,0 mL PM (bölüm 2.2) ile çıkarın. PM 1 ml tüp içinde bırakarak, yıkama iki kez tekrarlayın. </li><li> P1000 bir pipet yardımıyla parçaları 15 kez Karışım ve Eppendorf tüp kalmasını parçaları bırakarak, 4 mL PM içeren yeni bir 15 ml konik tüp / supernatant hücreleri çıkarmak. </li><li> 7 dakika fren off 20xg (350rpm) 15 ml tüp Spin. Süpernatantı atın ve her transfeksiyon için önceden karıştırılmış, oda sıcaklığında nucleofection solüsyonu (Lonza) 100 mcL ekleyin. P1000 pipet yukarı ve aşağı yumuşak bir hareket ile 5 kez Karışım. </li><li> Her yeni Eppendorf tüp nucleofection çözüm / hücre karışımı 100 mcL çıkarın ve uygun miktarda DNA ekleyin. Uzun vadeli kültürleri için DNA transfeksiyon ortalama 1-2μg kullanmak. Ancak, bu etiketler kültür küçük bir nöron &lt;% 10 oranı. Biz genellikle kısa süreli kültür için daha yüksek transfeksiyon verimliliği istiyorsanız transfeksiyon başına DNA 5-10μg kullanabilirsiniz. Iki farklı plazmid transfecting 40μg DNA toplam kadar kullandık. Plazmidler mcL / 1μg TE tampon saklanır. </li><li> Hücre süspansiyon / DNA küvet (Lonza) ekleyin ve Program O-005 (Fare MSS nöronlar) kullanarak Nucleofector (Lonza) hücrelerin electroporate. </li><li> Hızlı çalışma, küvet, önceden ısıtılmış ve dengelenir PM 500 mcL ekleyin ve çözüm / yeni bir 1.5 ml Eppendorf tüp hücreleri çıkarmak. Her transfeksiyon hacmi 1,0 mL getirmek için yeterli. Uzun vadeli kültürlere genç kültürleri, ya da 5-10x10 3 hücre / cm 2 için 3-5x10 3 hücre / cm 2 hemasitometre ve plaka ile hücre sayımı &lt;/ P&gt; </li><li> Kısa vadeli kültürleri, sel ısındı, 2.0 mL, kaplama bir saat sonra CO 2-dengelenmiş SFM ile 35mm kültür yemekleri. Lamelleri kullanarak, bir buçuk PM kaldırmak ve SFM ile değiştirin, daha sonra iki kez daha tekrarlayın. Ya görüntüleme odaları sel ya da çok düşük serum içeriği (&lt;% 0.5) lamelleri yıkama sonuçlarını. Kısa vadeli kültürler glial besleyici bir tabaka ile kültür olması gerekmez ve yeniden beslenen gerekmez. </li><li> Uzun vadeli kültürleri için, parafin / vazelin üç nokta içeren bir glia kaplı lamel kaldırmak ve 35mm çanak 15mm delik, bir saat sonra ilk kaplama üzerine ters. İki mililitre glial çanak klimalı SFM sonra görüntüleme odasına eklenir. Uzun vadeli kültürleri beslemek için, her 2-3 günde bir SFM üçte birini kaldırmak ve taze, önceden ısıtılmış ve CO 2-dengelenmiş SFM ile değiştirin . </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Hipokampal nöronlar yaşayan temsilcisi hipokampal nöron gelişimi izleyen evrelerini yaşıyor. Eşleştirilmiş görüntüleri diferansiyel paraziti kontrastlı görüntü ve karşılık gelen bir floresan mikrografı olarak gösterilir. Bu hücrelerin her biri pCAX vektörler EGFP tubulin ve DsRed2 transfekte olmuştur. Sahne 1 (1DIV), Aşama 2 (1DIV) 3 (2DIV), Sahne, Sahne 4 (11DIV) ve Sahne 5 (32DIV): nöronlar in vitro olarak aşağıdaki gün (DIV) görüntülenmiştir. Ölçek çubuğu 20μm.

<ol><li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Chapter 13. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+K+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Goslin, K., Banker, G. , The MIT Press. 339-370 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).</li>
<li>Dent, E. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+neuronal+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).</li>
<li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).</li>
<li>Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dynamic+microtubule+invasion+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines.</a> J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).</li>
<li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+Ena%2FVASP+proteins+for+filopodia+formation+in+neurons+and+in+function+downstream+of+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1.</a> Neuron. 42, 37-49 (2004).</li>
<li>Meberg, P. J., Miller, M. W. Chapter 7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeberg%2C+PJ+%22Neurons%3A+Methods+and+Applications+for+the+Cell+Biologist%22">Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist</a>. Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. , Academic Press. Volume 71 112-129 (2003).</li>
<li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li>
<li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li>
</ol>

Bu protokol, sıçan nöronlar 1,2 kullanan Banker protokolü, bir değişiklik olarak kültür embriyonik hipokampal ve kortikal fare nöronları için geliştirilmiştir . Biz de 3,4,5,6,7 olarak kültür fare ve hamsteri nöronlar için bu protokolü kullanılır. Bu protokol, hem hipokampal ve neokortikal nöronlar için eşit derecede iyi çalışır ve Meberg ve Miller 8 tarafından yayınlanan bir protokol benzer . Genel olarak, iyi karakterize edilmiş ve daha oturmuş bir model sistem çünkü biz uzun vadeli bir kültür hipokampal nöronlar. Dahası, neokorteks daha nöronların daha homojen bir nüfus bulunma olasılığı vardır. Ancak, aynı zamanda hayatta kalma ve benzer ayırt (yayınlanmamış veri) neokortikal nöronların bu protokolü kullanarak kültür. Biz kısa vadeli kültürü için rutin neokortikal ve hipokampal nöronlar kullanın. Neokorteks diseksiyonu da Batı Örneğin, blot için malzeme daha iyi bir seçim yapar hipokampal diseksiyon (hippocampi çifti başına 2.5x10 5 nöronlar) göre önemli ölçüde daha fazla nöron (korteks çifti başına 1.5x10 6 nöronlar) sonuçlanır. Herhangi bir birincil kültürü ile gibi, hayvanın ölüm hücreleri kaplama için gereken zamanı en aza indirmek için çok önemlidir. Genellikle, diseksiyon ve kaplama sürekli hızlı olmak için 10-20 diseksiyonları alacaktır. Ayrıca, nucleofection tampon bırakılırsa nöronların canlılığı hızla azalır Lonza Nucleofector çalışırken, elektroporasyon prosedürü sırasında hızlı çalışması için çok önemlidir. Toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) görüntüleme ile yapılır. Mikroskopi Bu tür lamel ötesinde görüntüleme birkaç yüz nanometre sadece yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, sık sık resim, aksonal büyüme konisi ve dendritik dikenler, lamel doğrudan uyulması nöronlar alanlarında ihtiyaç duyduğu. Böylece, uzun vadeli kültür glial besleme gerektiren düşük yoğunluklu kültürleri kullanın. Biz uzun vadeli kültürler için, glial besleyici katmanlar olmadan, (2x10 4 hücre / cm 2) yüksek yoğunluklu kültürler kullanılan ve az beslenme ile birlikte çok iyi hayatta. Geniş alan mikroskobu veya konfokal mikroskobu ile kolaylıkla tespit edilebilir rağmen, bu nöronların dendritik dikenler, kimi zaman çok uzak substrat TIRFM görüntü. Çalışmaların çoğunda kaplama önce nöronların transfect ve kültürde üç ay için floresan etiketli proteinlerin görüntülü var. Bu uzun vadeli bir ifade floresan etiketli proteinlerin DNA (1 2μg) düşük konsantrasyonlarda kullanılarak nöronların aşırı ekspresyonu eserler üreten değil bize güven veriyor. Ancak, bu yordamı da, yüksek miktarda DNA kullanılması halinde (10-20μg) protein aşırı ekspresyonu incelemek için kullanılan olabilir. Biz de DsRed2 ya da tek başına EGFP nöron sitoplazma etiketi rağmen, nöronların transfect için kullandığınız plazmid genellikle EGFP veya mCherry füzyon proteinleri içeren. Bu vektörlerin sayısı elektroporasyon tekniği ile çalışır. Biz CMV geliştirici ve β-globin ile β-aktin organizatörü içeren plazmid tercih poli-ifade nispeten yüksek düzeylerde nedeniyle kuyruk (pCAGGs veya pCAX plazmid) 9, ve nöronlar tarafından iyi tolere olduğu gerçeği hem kısa ve uzun vadeli bir kültür. Genellikle, proteinler, kaplama yaklaşık 4 saat içinde ifade ve 10-24 saat 10 içinde görüntüleme için yeterli düzeyde ulaşmak için başlar . Biz kısa vadeli kültürlerde CMV organizatörü odaklı plazmid başarıyla kullanılır, ama uzun vadeli kültür nöronları öldürmeye aşırı ekspresyonu yüksek düzeyde neden olabilir bulduk. Bununla birlikte, düşük yoğunluklu kültürlerin glial klima, yüksek yoğunluklu (non-glial beslenen) kültürler karşılaştırıldığında, CMV organizatörü tahrik plazmid transfekte nöronların hayatta yardımcı olduğunu bulduk.

* -80 Saklayın ° C -20 ° C&#39;de saklanabilir ki çoğu reaktif. -80 Saklanması ° C, onların raf ömrünü ve biraz daha tutarlı kültürler sonuçlar uzatır.

embriyonik fare hipokampal ve kortikal nöronlar primer nucleofection ve kültür

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Kortikal ve hipokampal nöronlar, merkezi sinir sistemi (MSS) nöronal kutuplaşma, akson / dendrit akıbet ve sinaps oluşumu ve işlevi incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Kültür, bu nöronların bir avantajı çok düşük yoğunluklarda iki boyutlu bir substrat üzerinde kolayca, farklı akson ve dendritler oluşturan, kutuplanma. Bu özellik, nöronal gelişimi birçok yönlerini belirlemek için son derece yararlı yaptı. Ayrıca, bu nöronlar glial klima sağlayarak, fonksiyonel sinaptik bağlantıları kurma ve kültür birkaç ay kalan geliştirmeye devam edecektir. Bu protokolde incelemek için teknik, kültür ve transfect embriyonik fare hipokampal ve kortikal nöronların anahat. Transfeksiyon nucleofection yoluyla kaplama önce nöronların içine DNA electroporating tarafından gerçekleştirilir. Bu protokol geliştirme (~ 4-8 saat sonra kaplama) polarizasyon, akson üremeyi ve dallanma sırasında proteinlerin dinamikleri ve fonksiyon çalışma erken floresan etiketli füzyon proteinleri ifade avantajı vardır. Biz de önce bu tek transfeksiyon kaplama nöron (kültür&gt; 2 ay) ömür boyu görüntüleme için uygun seviyelerde floresan etiketli füzyon proteini ifade koruduğunu keşfetti. Böylece, bu metodoloji nöronal fonksiyonu çok az veya hiç kesinti ile merkezi sinir sistemi gelişimi boyunca protein yerelleştirme ve fonksiyon çalışmak için yararlıdır.

Bu protokol, elektroporasyon ve kültür fare ve kortikal hipokampal nöronlar aracılığıyla transfect incelemek için gerekli adımları özetliyor. Kısa vadeli kültürleri, uzun vadeli kültürler sinaptogenez ve dendritik omurga analiz çalışmaları için kullanılabilir akson akıbet ve rehberlik çalışmaları için kullanılıyor olabilir.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Santral sinir sistemi (SSS) nöronal polarizasyonu, akson/dendrit uzaması ve ... çalışmaları için hipokampal ve kortikal nöronlar yaygın olarak kullanılmıştır.

Hipokampal ve kortikal nöronlar; merkezi sinir sistemi nöronal polarizasyonu, akson-dendrit büyümesi, sinaps oluşumu ve işlevlerini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır; bu nöronları kültüre etmenin avantajı, çok düşük yoğunluklarda iki boyutlu bir alt katman üzerinde belirgin aksonlar ve dendritler oluşturarak kolayca polarize olmalarıdır. Bu video; embriyonik fare hipokampal ve kortikal nöronların diseksiyonu, kültürü ve nükleofeksiyon yoluyla transfeksiyonu tekniğini göstermektedir; bu yöntem, ekimden yaklaşık dört ila sekiz saat sonra, gelişimin erken dönemlerinde floresan işaretli füzyon proteinlerin ekspresyonuna olanak tanır. Floresan işaretli proteinlerin ekspresyonu, kültürde iki ayı aşkın bir süre boyunca nöronun tüm yaşamı boyunca devam eder. Bu durum, akson büyümesi gibi erken gelişimsel olayların yanı sıra sinaptogenez ve sinaptik plastisite gibi daha sonraki olaylar sırasında protein fonksiyonlarının incelenmesine imkan sağlar.İlk olarak, doğum sonrası birinci ila üçüncü günlerdeki fare yavrularının kortikal hemisferlerinden glial hücreler izole edilir ve flasklara ekilir. %70 ila %100 konfluense ulaşıldığında, glial hücreler ardından cam lameller üzerine yeniden ekilir.Ardından, E 15.5 farelerden hipokampal veya kortikal nöronlar izole edilir ve kırmızı floresan protein gibi floresan füzyon proteinlerini kodlayan plazmidler aracılığıyla nükleoafeksiyon ile transfekte edilir. Transfekte edilen nöronlar daha sonra kısa süreli çalışmalar için görüntüleme odalarına ekilir. Uzun süreli kültürler için, cam lameller üzerindeki glial hücreler hipokampal veya kortikal kültürlerin üzerine ters çevrilir. Trofik destek sağlamak amacıyla, ardından tekil nöronlar görüntülenerek füzyon proteinlerinin nöronların aksonları veya dendritleri boyunca dinamik lokalizasyonu gösterilebilir.Merhaba, ben Wisconsin Madison Üniversitesi'nden anatomi alanında yardımcı doçent Eric Dent. Bugün, lisans öğrencilerimden Chris Wezelman, Jason Bwe ve Derek Lombard; kortikal ve hipokampal nöronların kısa ve uzun süreli kültürleri için izole etme, ekleme ve sürdürme prosedürünü uygulamalı olarak gösterecekler. Bu kültürler; başlangıçtaki nörit büyümesinden akson ve dendrit gelişimine ve sinaptogeneze kadar, nöronal gelişim boyunca floresan füzyon proteinlerinin dinamiklerini incelemek için kullanılabilir.Görüntüleme için odacıkları hazırlamak amacıyla; embriyonik, fare hipokampal ve kortikal nöronları kullanın. Alt kısmında 15 milimetrelik delikler açılmış ve tüm çapakları temizlenmiş 35 milimetrelik Petri kaplarıyla başlayın. Kaynar su banyosuna yerleştirerek, konik bir tüp içinde üçe bir oranında parafin ve vazelin karışımını eritin.Ardından, küçük bir boya fırçası kullanarak deliğin etrafındaki kabın alt kısmını kaplayın. Parafin ve petrol jeli karışımı zamanla ayrışacağı için farklı bölmeler arasında karıştığından emin olun. Lamelini deliğin üzerine yerleştirin.Tüm kaplar hazırlandığında, parafin karışımı eriyene kadar kapları 80 derece Celsius sıcaklığındaki bir fırına yerleştirin. Bu işlem yaklaşık 10 dakika sürmelidir. Ardından kapları çıkarıp düz bir yüzeye koyun ve parafin karışımının donması için en az bir dakika bekleyin.Kapları ters çevirin ve bir çeker ocak altına yerleştirin. Hem kapakların iç kısımlarını hem de bölmelerin tabanlarını sterilize etmek için UV ışığını 30 dakika boyunca açık tutun. Ardından kaplama işlemine geçin.Hazne lamelleri bir saat boyunca poli-D-lizini ile kaplanır. Ardından, bor tamponunun tüm kalıntılarını temizlemek için kaplı lameller steril filtrelenmiş deiyonize su ile üç ila beş kez iyice durulanır. Son durulamanın ardından, hazneleri kurutmak için vakum kullanılır. Bunlar hemen kullanılabilir veya daha sonraki kullanım için doku kültürü odasında saklanabilir.Uzun süreli kültürler hazırlanacaksa, kaplanmış odacıklar hazırlamadan sonraki bir hafta içinde kullanılmalıdır. Kortikal glial besleyici tabakaların oluşturulmasına, kortikal veya hipokampal diseksiyonlara geçilmeden iki ila üç hafta önce başlanması gerekir. P1 ile P3 arasındaki dört fare yavrusunun beyinlerini, soğuk diseksiyon ortamı içeren bir kaba yerleştirin ve kabı diseksiyon mikroskobunun altına koyun.Koku soğanlarını, iki serebral hemisferi ve meningesleri çıkarın. Hemisferleri, içinde besiyeri bulunmayan yeni bir kaba aktarın. Temiz ve steril bir jilet kullanarak korteksleri mümkün olduğunca ince parçalara ayırın.Ardından plastik bir pipetle, doğranmış dokuyu 12 mL soğuk diseksiyon ortamı içeren 50 mL'lik konik tüpe aktarın. Trypsin ve DNAs'yı sırasıyla 0.25% ve 0.1% nihai konsantrasyonlara gelecek şekilde ekleyin. Ara ara çalkalayarak 37 °C'lik su banyosunda 10 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından tüpü su banyosundan çıkarın ve doku kültürü kabinine götürmeden önce %70 ethanol ile iyice temizleyin. Kortikal dokuyu pipetle yukarı ve aşağı hareket ettirerek karıştırın.10 mililitrelik bir pipetle yaklaşık 10 ila 15 kez veya parçaların çoğu kaybolana kadar işlem yapın, ardından tüpü ara ara çalkalayarak 10 dakika daha su banyosuna geri koyun. Tüpü tekrar %70 etanol ile iyice temizleyin ve doku kültürü kabinine geri getirin.Kortikal dokuyu pipetle yukarı ve aşağı hareket ettirerek homojenleştirin. Daha önce yapıldığı gibi, bu kez beş mililitrelik bir pipet kullanarak 15 mililitre ılık glial besiyeri ekleyin ve 1000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve çökelek halindeki hücreleri 20 mililitre taze glial besiyerinde yeniden süspande edin.Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın. Ardından, 75 santimetrekarelik her flask için 15 mililitre glial ortam içinde 5 ila 7,5 milyon hücreyi ekleyin. Hücreleri 37 °C'lik inkübatöre yerleştirin ve kültürdeki ilk günden sonraki her iki ila üç günde bir, flaskı laminer akışlı kabinin yüzeyine vurarak gevşek hücreleri yerinden oynatın.Yerinden oynayan hücrelerle birlikte besiyerini uzaklaştırın ve yerine 15 mililitre taze glial besiyeri ekleyin. Glia hücreleri, flasklarda bir ila iki haftalık büyüme sonrası yaklaşık %100 konfluens düzeyine ulaştıklarında hasat edilebilir. Glia kaplı bireysel lamel hazırlamak için, öncelikle nitrik asit ile temizlenmiş ve sterilize edilmiş altı adet lamel yerleştirerek başlayın.10 santimetrelik bir kaba 25 milimetrelik yuvarlak lamel yerleştirin ve küçük bir boya fırçası kullanarak, her lamelin üzerine üçgen şeklinde, üçte bir oranındaki parafinli vazelin karışımından üç nokta koyun. Lameli kaba sabitlemek için kenarlarına iki nokta daha yerleştirin.Açık kapları 30 dakika boyunca UV ışığı ile işlemden geçirin. Lamel camlarını bir saat boyunca poly D lysine ile kaplayın. Ardından, steril filtrelenmiş deiyonize su ile üç ila beş kez kapsamlı şekilde yıkayın ve kurumaya bırakın; glial hücreleri inkübatörden çıkarın.Besiyerini dökün ve beş mililitre ön ısıtılmış tripsin ile yıkayın. Balona üç mililitre tripsin ekleyin ve 37 °C'de bir dakika boyunca inkübe edin. Hücreler ayrıldığında, tripsini durdurmak için beş mililitre glial besiyeri ekleyin.Pipetle 10 ila 15 kez yukarı-aşağı çekerek GL'yi flasktan uzaklaştırın. Ardından medyumu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve sekiz dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası kalıntıyı, hücreleri 10 mililitre glial ortamda süspande ederek hazırlayın.Ardından, hücreleri saydıktan sonra, lamine camlar içeren her bir 10 cm'lik kap için 12,5 ml glial besiyeri içerisinde 5x10⁵ hücre olacak şekilde ekim yapın. Nöron diseksiyonundan bir gün öncesine kadar, her iki ila üç günde bir besiyerini önceden ısıtılmış taze glial besiyeri ile değiştirin. Glial besiyerini uzaklaştırın ve yerine serumsuz besiyeri ekleyin.Bu glial kondisyonlu serumsuz besiyerini daha sonra kullanın. Kortikal veya hipokampal kültürler doldurulurken, 5 µM nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde C eklenir. Glial proliferasyonu önlemek için, üretici talimatlarında belirtildiği üzere transfeksiyon başına nükleo affeksiyon reaktiflerini ekleyin, ardından çözeltiyi oda sıcaklığına getirin.E 15.5 fare beyinlerini içeren bir kap soğuk diseksiyon ortamına yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında, her iki neokorteksi çıkarmak için bükülmüş bir tungsten iğne kullanın. Ardından mikro penset yardımıyla meningesleri temizleyin ve korteksleri soğuk diseksiyon ortamı içeren yeni bir kaba yerleştirin.Küçük iris makasları yardımıyla, hipokampus ve korteks serebral hemisferin medial tarafı boyunca görünür durumdadır. Hipokampusu dikkatlice çıkarın. Ardından, geri kalan korteksi çıkarın.Diseksiyon işlemini tüm batındaki beyinler için tekrarlayın. Hipokampal korteksleri, bir mililitre soğuk diseksiyon medyumu ile doldurulmuş ayrı 1,5 mililitrelik mikrotüplere yerleştirin. Tüm korteks ve hipokampusların diseksiyonu tamamlandıktan sonra tüpleri buz üzerine yerleştirin.Dokuları içeren mikro santrifüj tüplerine 110 µL %2,5 trypsin ekleyin ve tüpleri 20 dakika boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. P 1000 pipet kullanarak tüpteki sıvıyı mümkün olduğunca uzaklaştırın. Ardından her tüpe 1 mL ekim medyumu ekleyin ve mikro santrifüj tüpünü nazikçe tersyüz ederek dokuyu yıkayın.Yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, bir mililitre ekim ortamı ekleyin. Parçaları 15 kez trilere etmek için bir P 1000 pipet kullanın. Ardından, mikrosantrifüj tüpünde kalan parçaları bırakarak süpernatantı ve hücreleri, dört mililitre ekim ortamı içeren yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.15 mililitrelik tüpü, santrifüj sonrası fren kapatılmış şekilde 7 dakika boyunca 350 RPM'de çevirin, süpernatantı atın ve her bir transfeksiyon için oda sıcaklığında önceden karıştırılmış 100 mikrolitre nükleer efektleme solüsyonu ekleyin; karıştırmak için pipetle beş kez yukarı-aşağı çekin. Ardından, nükleer efektleme solüsyonu ve hücre karışımından 100 mikrolitreyi, uygun miktarda DNA içeren her bir yeni mikrosantrifüj tüpüne aktarın; uzun süreli kültürler için transfeksiyon başına 1 ile 2 mikrogram DNA, kültürdeki nöronların %10'undan daha azını işaretleyecektir.Transfeksiyon başına 5 ila 10 µg DNA, kültür için daha yüksek bir transfeksiyon verimliliği sağlayacaktır; hücre süspansiyonunu ve DNA karışımını bir elektroporasyon küvetine ekleyin. Ardından küveti elektroporatöre yerleştirin. Fare MSS nöronları için nucleo effector programını oh 0 0 5 olarak ayarlayın ve hızlıca hareket ederek, 500 µL önceden ısıtılmış ve dengelenmiş ekim ortamını küvete ekleyin ve hücre solüsyonunu yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Her bir transfeksiyonun hacmini bir mililitreye tamamlayacak kadar ekim medyumu ekleyin. Hücreleri saydıktan sonra, kısa süreli kültürler hazırlamak için transfeksiyon başına genellikle 5x10⁵ veya 1x10⁶ hücre kullanın; genç kültürler için santimetrekare başına 3 ila 5x10³ hücre, uzun süreli kültürler için ise metrekare başına 5 ila 10x10³ hücre şeklinde ekim yapın.Ekimden bir saat sonra, 35 milimetrelik kültür kaplarını iki mililitre ılık, karbondioksit ile dengelenmiş, serumsuz medya ile doldurun. Görüntüleme odaları %0,5'ten düşük, oldukça düşük bir serum içeriği sağlar. Kısa süreli kültürlerin glial besleyici tabaka ile kültüre edilmesine ve yeniden beslenmesine gerek yoktur. Uzun süreli kültürler hazırlamak için, serumsuz medyuma bir mililitre glial kondisyon ekleyin.Parafin petrol jelesinden üç nokta içeren GL kaplı bir lamı çıkarın ve bunu 35'lik kaptaki 15 milimetrelik deliğin üzerine ters çevirerek yerleştirin. Ardından, uzun süreli kültürleri beslemek için bir mililitre daha besiyeri ekleyin. Serumsuz besiyerinin üçte birini her iki ila üç günde bir yenileyin.Kültürdeki beş ila yedi günün ardından, glial proliferasyonu önlemek amacıyla beş micromolar son konsantrasyona ulaşacak şekilde sitozin arabinozid (Ara-C) eklenir. Temsili canlı hipokampal nöronların aşağıdaki eşleştirilmiş görüntüleri, hem bir diferansiyel girişim kontrast görüntüsünü hem de buna karşılık gelen bir floresan mikrografı göstermektedir. Bu hücrelerin her biri, PA vektörlerinde EGFP, tubulin ve DS red two ile transfekte edilmiştir.Birinci aşamada nöronlar başlangıçta tutunacak ve yaklaşık bir günlük bir süre içinde, hücre gövdesinin çevresinde çarşaf benzeri lamellipodia'lar ve parmak benzeri filipodia'lar oluşturacaktır. İkinci aşamada, başlangıçtaki çıkıntılar hücre gövdesinden çıkan birkaç nörite farklılaşacak ve bunlar genellikle yaklaşık 30 ila 50 mikron uzunlukta kalacaktır. Üçüncü aşamada stokastik olarak, nöritlerden biri hızla uzamaya başlayarak akson haline gelecektir.Diğer nöritler kısa kalır ve küçük uzantılar olarak adlandırılır. Hipokampal ve kortikal nöronların çoğu, kültürdeki ikinci veya üçüncü güne kadar üçüncü aşamaya geçer; bir sonraki hafta veya iki haftalık süreçte gerçekleşen dördüncü aşamada ise küçük uzantılar kalınlaşır, uzar ve dallanarak dendritlere dönüşür; bunlar burada yeşil renkle gösterilmiştir. Bu sırada akson, büyümeye ve dallanmaya devam ederken iki ila üç hafta içinde incelir.Kültürde dendritler, dendritler boyunca oluşan küçük çıkıntılar olan dendritik dikenler oluşturarak farklılaşır. Beşinci evre nöronların şekil ve boyutları farklılık gösterebilir, ancak çoğunluğu bu gelişimsel evreler serisinden geçmelidir. Proteinlerin aşırı ekspresyonu nöronal gelişimi bozarsa, transfekte edilmiş nöronlar bu evrelerde ilerleyemeyebilir.Ayrıca, nöronlar gelişiminin tüm aşamalarını tamamlamayabilir. Eğer lameller düzgün temizlenmezse veya polilizin düzgün şekilde yapışmazsa, özellikle bir C kullanılmadığında, glia hücreleri de yaygın şekilde çoğalabilir. Bu, uzun süreli kültürlerde glia hücrelerinin kültürü sardığı, iki haftalık bir kültürün faz kontrast görüntüsüdür.Besiyerinin çok sık veya yeterince sık değiştirilmemesi de nöronların canlılığını tehlikeye atabilir. Bu, nöronların çoğunun öldüğü ve geri kalan nöronların hücre gövdelerinin büzüştüğü ve uzantılarının boncuksu bir görünüm aldığı bir kültürün faz kontrast görüntüsüdür. Karşılaştırma amacıyla, bu da kültürdeki iki haftalık sağlıklı hipokampal nöronların faz kontrast görüntüsüdür. Daha büyük hücre gövdelerine ve uzantılarda boncuklaşma olmamasına dikkat edin.Ayrıca, bu aşamada dendritik uzantılar kalınlaşmış durumdadır ve kapsamlı bir aksonal uzantı filigranı mevcuttur. Embriyonik, kortikal ve diseksiyon, transfeksiyon ile tüm fetüs batınlarının plaklanması işlemleri bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, hipokampal ve kortikal nöronların mekanik bozulmalara karşı çok hassas olduğunu hatırlamak önemlidir.Ayrıca, metabolik aktiviteyi düşük tutmak için nöronların izolasyonu sırasında solüsyonların mümkün olduğunca soğuk tutulması önemlidir. Bu prosedürün ardından, ilgilenilen floresan füzyon proteinlerinin nöronun farklı bölgelerine nasıl ayrıştığı gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla canlı hücre görüntüleme ve aktivitenin fizyolojik kaydı gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu sayede protein lokalizasyonunun sinaptik aktivitedeki değişikliklerle ilişkili olup olmadığı veya bu proteinlerin işlevlerinin farklı farmakolojik tedavilerden nasıl etkilendiği belirlenebilir.

nucleofection-primary-culture-embryonic-mouse-hippocampal-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Organel ticareti dinamiklerini inceleyerek canlı hücre görüntüleme özellikle yardımcı programı. Burada geniş alan floresan mikroskobu kullanarak kültürlü nöronların yoğun çekirdekli veziküller canlı görüntüleme için bir protokol. Bu protokol, esnek ve diğer organeller gibi mitokondri gibi görüntü adapte edilebilir, endosomes ve peroksizomlara.

İlköğretim Kültür Hipokampal Nöronlar Yoğun çekirdekli veziküller Canlı Görüntüleme

Bu yüksek bir besleyici hücre glial tabakanın kullanımı olmaksızın prenatal fare beyinlerinden hipokampal nöronlar saflaştırılmış kültürü için bir protokolü sağlar.

Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Biz kemirgen embriyolardan hipokampal ve kortikal nöronlar yalıtmak ve kültürüne hızlı bir metodoloji tanıtılmıştır. Bu protokol bize neredeyse saf nöronal kültürlerin gerekli olduğu deneyler yapmasına imkan tanıyor.

Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

Etiketleme tarafından superecliptic pHluorin membran reseptörlerinin ekstraselüler domain ve görüntüleme kültürlü fare nöronları bu füzyon reseptörleri, biz doğrudan plazma membran reseptörlerinin bireysel veziküler ekleme olayları oluşturulabiliyor. Bu teknik, plazma membran reseptör ekleme düzenleyen moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına vesile olacaktır.

Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli

Video, murin hipokampusundan nöronları kültürlemek için bir yöntemi göstermektedir. Başlangıçta, hipokampus, hücre dışı doku matrisini parçalamak için enzimatik sindirime uğrar. Daha sonra, sindirilen doku, tek tek nöronları izole etmek için mekanik olarak bozulur. Son olarak, bu nöronlar glial besleyici hücreler üzerinde kültürlenir.

Fare Hipokampal Nöronlarını Kültürlemek İçin Bir Teknik

Biz etiketleme ve yenidoğan farelerin genotiplenmesi ve onlardan birincil nöronal kültürlerin üreten prosedürleri açıklar. genotyping, hızlı, verimli ve güvenilir, ve otomatik nükleik asit ekstraksiyon için izin verir. Bu neonatally öldürücü fareler ve genotipleme önce tamamlanmasını gerektirmektedir kültürleri için özellikle yararlıdır.

Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi

Bu makalede, bir glial tek tabakalı üzerinde ters cam lamelleri büyüyen düşük yoğunluklu birincil hipokampal nöronlar kültürleme için protokol açıklar. nöron ve glial tabakalar parafin mumu ile ayrılır. Bu yöntem ile yetiştirilen nöronlar yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme ve işlevsel tahliller için uygundur.

Düşük Yoğunluk İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

In vitro deneylerin vivo koşullarını mümkün olduğunca yeterli şekilde yansıtmak için yapılması kolay bir iş değildir. Birincil hücre kültürlerinin kullanımı bütün bir organizmada hücre biyolojisini anlamaya yönelik önemli bir adımdır. Sağlanan protokol nasıl başarılı bir şekilde büyümek ve kültür embriyonik fare serebellar nöronlar özetliyor.

Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

Burada, dev bir ankyrin-G'nin yokluğu nedeniyle önceden monte edilmiş AIS'den yoksun hipokampal nöronların akson başlangıç segmentlerinin (AIS) montajını ve yapısını nicel olarak incelemek için bir protokol tanımladık.

Axon İlk Segmentlerinin Montajını İncelemek için Birincil Kültürlü Hipokampal Nöronların Kullanımı

Kullanıma hazır dondurulmuş bir nöron stoğu, sinaptik fonksiyonları değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Burada, 96 delikli bir plaka kullanarak dondurulmuş stoktan kolay, düşük yoğunluklu bir birincil kültürü tanıtıyoruz.

Embriyonik Hipokampal Nöronların Dondurulmuş Stoğunu Kullanarak Kolay ve Tekrarlanabilir Düşük Yoğunluklu Birincil Kültür

Bu protokol, embriyonik 15-16. günlerde fare embriyolarından izole edilen primer nöronal hücrelerden ve doğum sonrası 1-2. günlerde yenidoğan farelerinin beyinlerinden üretilen primer mikrogliadan kurulan bir mikroglia-nöronal ko-kültürü tanımlar.

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Öğrenin fare hipokampal ve kortikal nöronların nükleofeksiyon ve kültür yöntemini. Bu teknik, akson çıkışı, sinaptogenez ve dendritik diken analizi çalışmaları için sinir gelişimini in vivo incelemeye olanak tanır.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Daha fazla video keşfet