Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hipokampal ve kortikal nöronlar; merkezi sinir sistemi nöronal polarizasyonu, akson-dendrit büyümesi, sinaps oluşumu ve işlevlerini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır; bu nöronları kültüre etmenin avantajı, çok düşük yoğunluklarda iki boyutlu bir alt katman üzerinde belirgin aksonlar ve dendritler oluşturarak kolayca polarize olmalarıdır. Bu video; embriyonik fare hipokampal ve kortikal nöronların diseksiyonu, kültürü ve nükleofeksiyon yoluyla transfeksiyonu tekniğini göstermektedir; bu yöntem, ekimden yaklaşık dört ila sekiz saat sonra, gelişimin erken dönemlerinde floresan işaretli füzyon proteinlerin ekspresyonuna olanak tanır. Floresan işaretli proteinlerin ekspresyonu, kültürde iki ayı aşkın bir süre boyunca nöronun tüm yaşamı boyunca devam eder. Bu durum, akson büyümesi gibi erken gelişimsel olayların yanı sıra sinaptogenez ve sinaptik plastisite gibi daha sonraki olaylar sırasında protein fonksiyonlarının incelenmesine imkan sağlar.

İlk olarak, doğum sonrası birinci ila üçüncü günlerdeki fare yavrularının kortikal hemisferlerinden glial hücreler izole edilir ve flasklara ekilir. %70 ila %100 konfluense ulaşıldığında, glial hücreler ardından cam lameller üzerine yeniden ekilir.

Ardından, E 15.5 farelerden hipokampal veya kortikal nöronlar izole edilir ve kırmızı floresan protein gibi floresan füzyon proteinlerini kodlayan plazmidler aracılığıyla nükleoafeksiyon ile transfekte edilir. Transfekte edilen nöronlar daha sonra kısa süreli çalışmalar için görüntüleme odalarına ekilir. Uzun süreli kültürler için, cam lameller üzerindeki glial hücreler hipokampal veya kortikal kültürlerin üzerine ters çevrilir. Trofik destek sağlamak amacıyla, ardından tekil nöronlar görüntülenerek füzyon proteinlerinin nöronların aksonları veya dendritleri boyunca dinamik lokalizasyonu gösterilebilir.

Merhaba, ben Wisconsin Madison Üniversitesi'nden anatomi alanında yardımcı doçent Eric Dent. Bugün, lisans öğrencilerimden Chris Wezelman, Jason Bwe ve Derek Lombard; kortikal ve hipokampal nöronların kısa ve uzun süreli kültürleri için izole etme, ekleme ve sürdürme prosedürünü uygulamalı olarak gösterecekler. Bu kültürler; başlangıçtaki nörit büyümesinden akson ve dendrit gelişimine ve sinaptogeneze kadar, nöronal gelişim boyunca floresan füzyon proteinlerinin dinamiklerini incelemek için kullanılabilir.

Görüntüleme için odacıkları hazırlamak amacıyla; embriyonik, fare hipokampal ve kortikal nöronları kullanın. Alt kısmında 15 milimetrelik delikler açılmış ve tüm çapakları temizlenmiş 35 milimetrelik Petri kaplarıyla başlayın. Kaynar su banyosuna yerleştirerek, konik bir tüp içinde üçe bir oranında parafin ve vazelin karışımını eritin.

Ardından, küçük bir boya fırçası kullanarak deliğin etrafındaki kabın alt kısmını kaplayın. Parafin ve petrol jeli karışımı zamanla ayrışacağı için farklı bölmeler arasında karıştığından emin olun. Lamelini deliğin üzerine yerleştirin.

Tüm kaplar hazırlandığında, parafin karışımı eriyene kadar kapları 80 derece Celsius sıcaklığındaki bir fırına yerleştirin. Bu işlem yaklaşık 10 dakika sürmelidir. Ardından kapları çıkarıp düz bir yüzeye koyun ve parafin karışımının donması için en az bir dakika bekleyin.

Kapları ters çevirin ve bir çeker ocak altına yerleştirin. Hem kapakların iç kısımlarını hem de bölmelerin tabanlarını sterilize etmek için UV ışığını 30 dakika boyunca açık tutun. Ardından kaplama işlemine geçin.

Hazne lamelleri bir saat boyunca poli-D-lizini ile kaplanır. Ardından, bor tamponunun tüm kalıntılarını temizlemek için kaplı lameller steril filtrelenmiş deiyonize su ile üç ila beş kez iyice durulanır. Son durulamanın ardından, hazneleri kurutmak için vakum kullanılır. Bunlar hemen kullanılabilir veya daha sonraki kullanım için doku kültürü odasında saklanabilir.

Uzun süreli kültürler hazırlanacaksa, kaplanmış odacıklar hazırlamadan sonraki bir hafta içinde kullanılmalıdır. Kortikal glial besleyici tabakaların oluşturulmasına, kortikal veya hipokampal diseksiyonlara geçilmeden iki ila üç hafta önce başlanması gerekir. P1 ile P3 arasındaki dört fare yavrusunun beyinlerini, soğuk diseksiyon ortamı içeren bir kaba yerleştirin ve kabı diseksiyon mikroskobunun altına koyun.

Koku soğanlarını, iki serebral hemisferi ve meningesleri çıkarın. Hemisferleri, içinde besiyeri bulunmayan yeni bir kaba aktarın. Temiz ve steril bir jilet kullanarak korteksleri mümkün olduğunca ince parçalara ayırın.

Ardından plastik bir pipetle, doğranmış dokuyu 12 mL soğuk diseksiyon ortamı içeren 50 mL'lik konik tüpe aktarın. Trypsin ve DNAs'yı sırasıyla 0.25% ve 0.1% nihai konsantrasyonlara gelecek şekilde ekleyin. Ara ara çalkalayarak 37 °C'lik su banyosunda 10 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından tüpü su banyosundan çıkarın ve doku kültürü kabinine götürmeden önce %70 ethanol ile iyice temizleyin. Kortikal dokuyu pipetle yukarı ve aşağı hareket ettirerek karıştırın.

10 mililitrelik bir pipetle yaklaşık 10 ila 15 kez veya parçaların çoğu kaybolana kadar işlem yapın, ardından tüpü ara ara çalkalayarak 10 dakika daha su banyosuna geri koyun. Tüpü tekrar %70 etanol ile iyice temizleyin ve doku kültürü kabinine geri getirin.

Kortikal dokuyu pipetle yukarı ve aşağı hareket ettirerek homojenleştirin. Daha önce yapıldığı gibi, bu kez beş mililitrelik bir pipet kullanarak 15 mililitre ılık glial besiyeri ekleyin ve 1000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve çökelek halindeki hücreleri 20 mililitre taze glial besiyerinde yeniden süspande edin.

Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın. Ardından, 75 santimetrekarelik her flask için 15 mililitre glial ortam içinde 5 ila 7,5 milyon hücreyi ekleyin. Hücreleri 37 °C'lik inkübatöre yerleştirin ve kültürdeki ilk günden sonraki her iki ila üç günde bir, flaskı laminer akışlı kabinin yüzeyine vurarak gevşek hücreleri yerinden oynatın.

Yerinden oynayan hücrelerle birlikte besiyerini uzaklaştırın ve yerine 15 mililitre taze glial besiyeri ekleyin. Glia hücreleri, flasklarda bir ila iki haftalık büyüme sonrası yaklaşık %100 konfluens düzeyine ulaştıklarında hasat edilebilir. Glia kaplı bireysel lamel hazırlamak için, öncelikle nitrik asit ile temizlenmiş ve sterilize edilmiş altı adet lamel yerleştirerek başlayın.

10 santimetrelik bir kaba 25 milimetrelik yuvarlak lamel yerleştirin ve küçük bir boya fırçası kullanarak, her lamelin üzerine üçgen şeklinde, üçte bir oranındaki parafinli vazelin karışımından üç nokta koyun. Lameli kaba sabitlemek için kenarlarına iki nokta daha yerleştirin.

Açık kapları 30 dakika boyunca UV ışığı ile işlemden geçirin. Lamel camlarını bir saat boyunca poly D lysine ile kaplayın. Ardından, steril filtrelenmiş deiyonize su ile üç ila beş kez kapsamlı şekilde yıkayın ve kurumaya bırakın; glial hücreleri inkübatörden çıkarın.

Besiyerini dökün ve beş mililitre ön ısıtılmış tripsin ile yıkayın. Balona üç mililitre tripsin ekleyin ve 37 °C'de bir dakika boyunca inkübe edin. Hücreler ayrıldığında, tripsini durdurmak için beş mililitre glial besiyeri ekleyin.

Pipetle 10 ila 15 kez yukarı-aşağı çekerek GL'yi flasktan uzaklaştırın. Ardından medyumu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve sekiz dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası kalıntıyı, hücreleri 10 mililitre glial ortamda süspande ederek hazırlayın.

Ardından, hücreleri saydıktan sonra, lamine camlar içeren her bir 10 cm'lik kap için 12,5 ml glial besiyeri içerisinde 5x10⁵ hücre olacak şekilde ekim yapın. Nöron diseksiyonundan bir gün öncesine kadar, her iki ila üç günde bir besiyerini önceden ısıtılmış taze glial besiyeri ile değiştirin. Glial besiyerini uzaklaştırın ve yerine serumsuz besiyeri ekleyin.

Bu glial kondisyonlu serumsuz besiyerini daha sonra kullanın. Kortikal veya hipokampal kültürler doldurulurken, 5 µM nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde C eklenir. Glial proliferasyonu önlemek için, üretici talimatlarında belirtildiği üzere transfeksiyon başına nükleo affeksiyon reaktiflerini ekleyin, ardından çözeltiyi oda sıcaklığına getirin.

E 15.5 fare beyinlerini içeren bir kap soğuk diseksiyon ortamına yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında, her iki neokorteksi çıkarmak için bükülmüş bir tungsten iğne kullanın. Ardından mikro penset yardımıyla meningesleri temizleyin ve korteksleri soğuk diseksiyon ortamı içeren yeni bir kaba yerleştirin.

Küçük iris makasları yardımıyla, hipokampus ve korteks serebral hemisferin medial tarafı boyunca görünür durumdadır. Hipokampusu dikkatlice çıkarın. Ardından, geri kalan korteksi çıkarın.

Diseksiyon işlemini tüm batındaki beyinler için tekrarlayın. Hipokampal korteksleri, bir mililitre soğuk diseksiyon medyumu ile doldurulmuş ayrı 1,5 mililitrelik mikrotüplere yerleştirin. Tüm korteks ve hipokampusların diseksiyonu tamamlandıktan sonra tüpleri buz üzerine yerleştirin.

Dokuları içeren mikro santrifüj tüplerine 110 µL %2,5 trypsin ekleyin ve tüpleri 20 dakika boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. P 1000 pipet kullanarak tüpteki sıvıyı mümkün olduğunca uzaklaştırın. Ardından her tüpe 1 mL ekim medyumu ekleyin ve mikro santrifüj tüpünü nazikçe tersyüz ederek dokuyu yıkayın.

Yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, bir mililitre ekim ortamı ekleyin. Parçaları 15 kez trilere etmek için bir P 1000 pipet kullanın. Ardından, mikrosantrifüj tüpünde kalan parçaları bırakarak süpernatantı ve hücreleri, dört mililitre ekim ortamı içeren yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.

15 mililitrelik tüpü, santrifüj sonrası fren kapatılmış şekilde 7 dakika boyunca 350 RPM'de çevirin, süpernatantı atın ve her bir transfeksiyon için oda sıcaklığında önceden karıştırılmış 100 mikrolitre nükleer efektleme solüsyonu ekleyin; karıştırmak için pipetle beş kez yukarı-aşağı çekin. Ardından, nükleer efektleme solüsyonu ve hücre karışımından 100 mikrolitreyi, uygun miktarda DNA içeren her bir yeni mikrosantrifüj tüpüne aktarın; uzun süreli kültürler için transfeksiyon başına 1 ile 2 mikrogram DNA, kültürdeki nöronların %10'undan daha azını işaretleyecektir.

Transfeksiyon başına 5 ila 10 µg DNA, kültür için daha yüksek bir transfeksiyon verimliliği sağlayacaktır; hücre süspansiyonunu ve DNA karışımını bir elektroporasyon küvetine ekleyin. Ardından küveti elektroporatöre yerleştirin. Fare MSS nöronları için nucleo effector programını oh 0 0 5 olarak ayarlayın ve hızlıca hareket ederek, 500 µL önceden ısıtılmış ve dengelenmiş ekim ortamını küvete ekleyin ve hücre solüsyonunu yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Her bir transfeksiyonun hacmini bir mililitreye tamamlayacak kadar ekim medyumu ekleyin. Hücreleri saydıktan sonra, kısa süreli kültürler hazırlamak için transfeksiyon başına genellikle 5x10⁵ veya 1x10⁶ hücre kullanın; genç kültürler için santimetrekare başına 3 ila 5x10³ hücre, uzun süreli kültürler için ise metrekare başına 5 ila 10x10³ hücre şeklinde ekim yapın.

Ekimden bir saat sonra, 35 milimetrelik kültür kaplarını iki mililitre ılık, karbondioksit ile dengelenmiş, serumsuz medya ile doldurun. Görüntüleme odaları %0,5'ten düşük, oldukça düşük bir serum içeriği sağlar. Kısa süreli kültürlerin glial besleyici tabaka ile kültüre edilmesine ve yeniden beslenmesine gerek yoktur. Uzun süreli kültürler hazırlamak için, serumsuz medyuma bir mililitre glial kondisyon ekleyin.

Parafin petrol jelesinden üç nokta içeren GL kaplı bir lamı çıkarın ve bunu 35'lik kaptaki 15 milimetrelik deliğin üzerine ters çevirerek yerleştirin. Ardından, uzun süreli kültürleri beslemek için bir mililitre daha besiyeri ekleyin. Serumsuz besiyerinin üçte birini her iki ila üç günde bir yenileyin.

Kültürdeki beş ila yedi günün ardından, glial proliferasyonu önlemek amacıyla beş micromolar son konsantrasyona ulaşacak şekilde sitozin arabinozid (Ara-C) eklenir. Temsili canlı hipokampal nöronların aşağıdaki eşleştirilmiş görüntüleri, hem bir diferansiyel girişim kontrast görüntüsünü hem de buna karşılık gelen bir floresan mikrografı göstermektedir. Bu hücrelerin her biri, PA vektörlerinde EGFP, tubulin ve DS red two ile transfekte edilmiştir.

Birinci aşamada nöronlar başlangıçta tutunacak ve yaklaşık bir günlük bir süre içinde, hücre gövdesinin çevresinde çarşaf benzeri lamellipodia'lar ve parmak benzeri filipodia'lar oluşturacaktır. İkinci aşamada, başlangıçtaki çıkıntılar hücre gövdesinden çıkan birkaç nörite farklılaşacak ve bunlar genellikle yaklaşık 30 ila 50 mikron uzunlukta kalacaktır. Üçüncü aşamada stokastik olarak, nöritlerden biri hızla uzamaya başlayarak akson haline gelecektir.

Diğer nöritler kısa kalır ve küçük uzantılar olarak adlandırılır. Hipokampal ve kortikal nöronların çoğu, kültürdeki ikinci veya üçüncü güne kadar üçüncü aşamaya geçer; bir sonraki hafta veya iki haftalık süreçte gerçekleşen dördüncü aşamada ise küçük uzantılar kalınlaşır, uzar ve dallanarak dendritlere dönüşür; bunlar burada yeşil renkle gösterilmiştir. Bu sırada akson, büyümeye ve dallanmaya devam ederken iki ila üç hafta içinde incelir.

Kültürde dendritler, dendritler boyunca oluşan küçük çıkıntılar olan dendritik dikenler oluşturarak farklılaşır. Beşinci evre nöronların şekil ve boyutları farklılık gösterebilir, ancak çoğunluğu bu gelişimsel evreler serisinden geçmelidir. Proteinlerin aşırı ekspresyonu nöronal gelişimi bozarsa, transfekte edilmiş nöronlar bu evrelerde ilerleyemeyebilir.

Ayrıca, nöronlar gelişiminin tüm aşamalarını tamamlamayabilir. Eğer lameller düzgün temizlenmezse veya polilizin düzgün şekilde yapışmazsa, özellikle bir C kullanılmadığında, glia hücreleri de yaygın şekilde çoğalabilir. Bu, uzun süreli kültürlerde glia hücrelerinin kültürü sardığı, iki haftalık bir kültürün faz kontrast görüntüsüdür.

Besiyerinin çok sık veya yeterince sık değiştirilmemesi de nöronların canlılığını tehlikeye atabilir. Bu, nöronların çoğunun öldüğü ve geri kalan nöronların hücre gövdelerinin büzüştüğü ve uzantılarının boncuksu bir görünüm aldığı bir kültürün faz kontrast görüntüsüdür. Karşılaştırma amacıyla, bu da kültürdeki iki haftalık sağlıklı hipokampal nöronların faz kontrast görüntüsüdür. Daha büyük hücre gövdelerine ve uzantılarda boncuklaşma olmamasına dikkat edin.

Ayrıca, bu aşamada dendritik uzantılar kalınlaşmış durumdadır ve kapsamlı bir aksonal uzantı filigranı mevcuttur. Embriyonik, kortikal ve diseksiyon, transfeksiyon ile tüm fetüs batınlarının plaklanması işlemleri bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, hipokampal ve kortikal nöronların mekanik bozulmalara karşı çok hassas olduğunu hatırlamak önemlidir.

Ayrıca, metabolik aktiviteyi düşük tutmak için nöronların izolasyonu sırasında solüsyonların mümkün olduğunca soğuk tutulması önemlidir. Bu prosedürün ardından, ilgilenilen floresan füzyon proteinlerinin nöronun farklı bölgelerine nasıl ayrıştığı gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla canlı hücre görüntüleme ve aktivitenin fizyolojik kaydı gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu sayede protein lokalizasyonunun sinaptik aktivitedeki değişikliklerle ilişkili olup olmadığı veya bu proteinlerin işlevlerinin farklı farmakolojik tedavilerden nasıl etkilendiği belirlenebilir.