Name: Black Widow Spider İpek üreten Bezler, Mikrodisseksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:59:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Öğrenin, kara dul örümceklerinden ipek üreten bezleri mikrodisseksiyon yöntemiyle izole etmeyi. Bu teknik, moleküler ve biyokimyasal analizler için hızlı ve saf doku elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Black Widow Spider ipek bir NSF RUI Hibe MCB-0950372 başlıklı Moleküler Karakterizasyonu tarafından desteklenmiştir.

1. Karın örümcek ve izolasyon anestezi <ol><li> Plastik (Şekil 1A) ile kaplı bir karton kutunun içine bir cam kavanoz örümcek aktarın. Biz genellikle woodpiles, garajlar ya da çalılar örümcekler toplamak ve laboratuvarda cam kavanoz içinde onlara ev. Örümcek plastik astarı yukarı tırmanmak değil, çünkü bir cam kavanoz ya da kahve örümcek anestezi amaçlı küçük bir şişenin içine aktarmak için etkili bir yöntem sağlar. Bu noktada örümcek işleme, iki çift lateks eldiven veya güvenlik amaçlı bahçe eldiven giyiyor olmalıdır. </li><li> Örümcek kutusundaki plastik ile kaplı olmasına rağmen, arka yaklaşım ve örümcek örümcek slayt, plastik kültürü şişe içine sağlar. Örümcek flakon girdikten sonra hemen üst (Şekil 1B) üzerinden fiş yerleştirin. Biz yaklaşık 101.6 mm x 31.75 mm (L x D) bir şişe kullanmanızı öneririz. Bu anestezi adım için gerekli karbon dioksit gazı miktarını en aza indirir. </li><li> Inç kare başına 10 dakika (Şekil 1C) 5-10 kilo karbondioksit gazı getirerek örümcek anestezisi. Bu miktar sadece gaz anesthetization sonra hemen adımları 1,4-1,5 geçmemiz gereken, yaklaşık 5 dakika süreyle örümcek knock out olacak. </li><li> Anestezi örümcek, küçük bir diseksiyon çanak içine yerleştirin ve örümcek dorsal yüzü yukarı (kırmızı kum saati aşağı bakacak şekilde) pozisyonu için forseps kullanabilir. </li><li> Örümcek geri kalanı (Şekil 1D) karın serbest sapçık (Sefalotoraks ve karın bağlayan dar sapı) Clip. Petri geceleme dondurucu cephalothoraksın Mağaza ve ertesi gün dondurulmuş sonra atın. Örümcek kıskaçlar bulunan bu segmentte cephalothoraksın taşırken dikkatli olun. </li><li> Tek bir böcek pin kullanarak küçük diseksiyonu çanak Sylgard malzeme karın sabitleyin. Sapçık kırpma (Şekil 1E) yapılan delikten böcek pimi takın. Bu sıvı sapçık kırpma çıkan site olarak kolayca tespit edilebilir. Düze (sapçık diğer ucunu) (size en yakın) alt yönlediriyor emin olun. </li></ol> 2. Exoskeleton kaldırılması <ol><li> Sapçık kırpma delik başlayan, bir microscissors çifti kullanılarak dış iskelet ile ilk kesi olun. Dorsal yüzü her iki tarafında (Şekil 1F) ulaşana kadar yanal kesin. Ön dış iskelet segmentinde kabuğu, bir çift forseps kullanma ve bu yerde ikinci bir iğne takın. Ikinci pin ekleme takiben, ilk yanal kesim kaudal diseksiyon tepsi (90 ° açı) açın ve memeciklerin (Şekil 1G) ulaşana kadar kesme devam edin. Bu kesi ilk yanal kesme dik veya dikey olacaktır. Düşey kesi yapılır memeciklerin (kum saati posterior akrabası ve dairesel bir görünüme sahiptir) ile kesmeyin. Ikinci pin eklemek için dikey insizyonlar yapılır iplik karın neden olacaktır. </li><li> Batmak tampon solüsyonu (0.1 M Sodyum Klorür, 0.015 M Sodyum Sitrat,% 0.1 Pyrocarbonate Dietil) diseksiyon karın. </li><li> Geri kalan dış iskelet Peel ilk yatay kesi başlayarak. Bu tamamlandığında, yağ dokusu (Şekil 1H) açıkça görünür olmalıdır. </li></ol> 3. Ipek üreten bezlerin izolasyonu <ol><li> Forseps kullanarak yağ tabakası (Şekil 1H) uzak alay başlar. Yağ beyazımsı ve sarımsı görünümüne sahip olacak. Çoğu yağ çıkarılır ve ipek bezleri açıkça görülebilir kadar devam edin. Tubuliform bezi, karın boşluğunda bol, çok uzun, silindirik tüpler üç çift oluşur. Çift halinde bulunan büyük ampullate, uzun dolambaçlı bir distal kuyruk ve örümcek memeciklerin yaklaşımlar olarak genişliği azalır proksimal kanalı ile büyük bir hilal şeklinde ampulla. Küçük ampullate büyük ampullate morfolojisi çok benzer, ancak önemli ölçüde küçüktür. Aynı zamanda çiftleri meydana flagelliform bezi, yuvarlak ve aşağı memeciklerin doğru uzanır kanalı zig-zag bir küçük silindirik multilobular. Toplam bezi (çift), üzerinde büyük, düzensiz lob vardır çok büyük bir boşaltım kanalı çok geniş, multilobular bezi. Aciniform bezleri çok sayıda ortaya çıkar ve kısa, küçük parmak projeksiyonları benzerler. Piriform bezi karında küçük bir bezdir ve memeciklerin aşağı uzanan birçok küçük boşaltım kanalları ile bir fan benzer birçok sıkıştırılmış, silindirik kanalları vardır. </li><li> Piriform (Şekil 2A-B), daha sonra tubuliform, büyük ampullate flagelliform, küçük ampullate, agrega, aciniform ve: Biz aşağıdaki sırayla bezleri kaldırarak öneririz. </li><li> Tubuliform ile başlayarak, yüzyılın geri kalanında bu bezleri kapalı kızdırmake bezleri diğer bezleri (Şekil 2A) üstüne oturuyor olmalıdır. Tek bir örümcek tubuliform bezlerinin üç çift vardır. Halka açık ama kendi kanalları kendi memeciklerin bağlı kalmasını sağlayın. </li><li> Sonra, büyük ampullate bezleri kızdırmak. Bir örümcek bulunan iki büyük ampullate bezleri vardır. Kaldırma işlemi sırasında, kanallar bezleri (Şekil 2A) bağlı kaldığından emin olun. </li><li> , Özellikle agrega ve flagelliform bezleri bezleri delinmesiyle önlemek için dikkatli bir şekilde çalışan, birbirinden uzakta bezlerinin geri kalanı tease devam edin. Her bezi memeciklerin Exoskeleton çıkış noktası her şekilde yüzen arındırılmış olmalıdır. Bu bezler aynı zamanda çift olarak bulunurlar. Forseps ile kanal kısma ve onu çıkış noktası tatili kadar dikkatle çekerek her bezi çıkarın. Büyük ampullate, flagelliform, küçük ampullate, ve toplam bezlerinin çiftleri bulundu. Aciniform ve piriform bezleri çok daha fazla çiftleri meydana gelir. </li><li> Her bezi kanalı kısma ve forseps ile düze çıkış noktası aşağı uzak bozulana kadar dikkatle çekerek çıkarın. Biz genellikle bezleri ıslak saklamak, ancak ek tampon ilave etmeyiniz. </li><li> Bezleri çıkarılır, ön etiketli steril 1,5 ml mikrosantrifüj tüpler içine yerleştirin. Bireysel bezleri Şekil 3A-G gösterilmiştir. Bu bezlerin buz üzerinde tutun ve sonra flaş sıvı nitrojen dondurma. Koyun sıvı nitrojen içinde flaş dondurma, -80 ° C depolama için. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Flagelliform ve toplam bezlerinin işleme sırasında bu iki yapının kolayca delinmiş ve forseps ile hasar gibi farklı bezleri çıkarırken, çok dikkatli alınması gerekmektedir. Ayrıca, morfolojik flagelliform ve toplam bezleri önce kaldırılması çok benzer ve çoğu zaman birbirleri ile iç içe olduğunu fazlalaştı. Disektör dikkatle bu dokuların çıkarılması üzerine çapraz bulaşmayı önlemek için, bu yapıların dışında kızdırmak olmalıdır. Ayrıca, ilk poz ipek üreten bezlerin üzerine, aciniform ve piriform bezleri, küçük boyut ve anatomik konumu nedeniyle hemen görselleştirmek için en zor olacaktır. Genellikle çok sayıda yumurta varlığı yoktur. Ayrıca, bu doku son derece yapışkan ve forseps sık sık uyacaktır ek bakım, piriform bezi çıkarırken alınması gerekir. Bu işlem doğru yapıldığında, son derece saf bir şekilde tek bir örümcek tüm yedi ipek üreten bezlerin elde etmek mümkündür. Genellikle, bir, tek bir örümcek diseksiyonu toplam RNA ve protein mikrogram miktarlarda kurtarabilirsiniz. Tubuliform kısıtlanmış fibroin gen, TuSp1 mRNA düzeylerini incelemek için qPCR için toplam RNA kullanarak bir örnek gösterilmiştir (Şekil 4). Protein bezleri alınan lizatları içeren Temsilcisi deneyler MS analizi (MS / MS analizi için kullanılan olabilir) ya da bir amino asit kompozisyonu analizi (sırasıyla Şekil 5-6) gösterilir takip çözüm triptik sindirim gibi. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="Şekil 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="Şekil 1e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1e"> Şekil 1 Taşıma, anestezi ve dış iskelet bir kadın kara dul örümceğinin karın kaldırılması. A) örümcek, daha küçük bir plastik şişenin içine örümcek hareket kolaylaştırmak için plastik ile kaplı bir karton kutunun içine aktarın. B) Örümcek fişli bir plastik şişenin içine yerleştirilir. C) örümcek karbondioksit gazı ile etkisiz. D) Cephalothoraksın microscissors kullanarak karın ayrılması. E) böcek pimleri kullanarak diseksiyon tepsi karın İmmobilizasyon. F) makas ve dış iskelet bir kısmını forseps ile geri soyulmuş lateral kesi yapıldıktan sonra gör. G) Kesiler ilk yanal kesme dik yapılmaktadır. H) yağ tabakasının dış iskelet ve pozlama kaldırılması. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2, örümcek gibi çevre dokulara karın dokunmamak yedi farklı ipek üreten bezlerin Görselleştirme . A) tubuliform Görüntüler, büyük ampullate flagelliform, toplam 12X büyütme, küçük ampullate dokular. B) 12X büyütme aciniform ve piriform bezleri Resim. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="Şekil 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="Şekil 3e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3e"> Şekil 3 karından çıkarılmasından sonra yedi ipek üreten bezlerin Fotoğraflar. 20X büyütme 40X az yapıldı aciniform ve piriform bezleri, istisna ile tüm görüntüler ele geçirildi. A) büyükampullate bezi B) boyut karşılaştırma için büyük ve küçük ampullate (sağ tarafı); C) tubuliform; D) flagelliform; E) agrega; F) aciniform G) piriform. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 toplam RNA kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) aşağıdaki izolasyon kullanarak farklı ipek üreten bezlerin TuSp1 mRNA düzeylerini ölçme sonra ipek gen TuSp1 (piriform bezi hariç) ifade desen Temsilcisi sonuçları bezlerinin. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 çözüm triptik sindirim aşağıdaki piriform bezinden elde edilen protein ekstreleri MS analizi örneği . Not: x2 spektrumunun 2 kat büyütme temsil eder. PySp1 fibroin bölgelere karşılık gelen Spektrum peptid iyon kitleler # sembolü ile gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6 tubuliform bezinden çıkarılan proteinlerin amino asit kompozisyonu profili tipik sonucudur. Not: ASX = Asp ve Asn; GLX = Glu ve Gln. Mavi rengi, kırmızı renklenme, polar olmayan yan zincir grupları ile amino asit artıkları temsil eder, oysa amino asitler polar yan zincir grupları ile yansıtır.

<ol><li>Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).</li>
<li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).</li>
<li>Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. Endeavour. 10, 31-31 (1986).</li>
<li>Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).</li>
<li>Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).</li>
<li>Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).</li>
<li>Tian, M., Lewis, R. V. Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).</li>
<li>Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).</li>
<li>Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).</li>
<li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).</li>
<li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).</li>
</ol>

Kara dul örümceği ipek üreten bezlerin mikrodiseksiyon metodolojisi yüksek derecede saflaştırılmış ipek üreten bezlerin elde etmek için etkili bir araç sunmaktadır. Diseksiyonlarının yedi ayrı komple bir set ipek üreten bezlerin cobweavers gelen verimli 1,5 ila 3 saat içinde tamamlanabilir. Yüksek derecede saflaştırılmış ipek bezi örnekleri elde edilmesi araştırmacılar farklı bezlerinde seçici genlerin mRNA düzeyleri kütle spektrometresi, analiz kullanarak glandüler luminal içeriğini içinde depolanan yeni ipek veya hast...

<table><tbody><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0420-1</td><td>su içerisinde 0.1 M</td></tr><tr><td>Dietil pirokarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758 - 5 ml</td><td>%0.1 v/v</td></tr><tr><td>Sodyum sitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804 - 1 kg</td><td>su içerisinde 0.015 M</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica MZ16</td><td></td></tr><tr><td>Dijital mikroskop kamerası</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC320</td><td>Yazılım - Leica Application Suite v2.8.1</td></tr><tr><td>Vannas makası</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik pens</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501764</td><td>Mini Dumont #M5S</td></tr><tr><td>Böcek iğneleri</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-2</td><td>Böcek iğneleri #2</td></tr><tr><td>Küçük veya büyük diseksiyon kapları</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-50-S veya DD-90-S</td><td>52 mm çap x 18 mm Y (Sylgard Derinliği ~6mm) veya 93 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; kültür tüpleri</td><td>Carolina Biological</td><td>FR-17-3076</td><td>Boyut 31.75 mm çap x 101.6 mm</td></tr></tbody></table>

black widow spider İpek üreten bezler, mikrodisseksiyon

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Modern örümcekler, biyolojik fonksiyonları, hareket, avlarını yakalamak ve gelişmekte olan yavrular 1,2 korunması da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede yüksek performanslı ipek lifleri dönerler. Örümcekler farklı mekanik özelliklere sahip birkaç farklı fiber türleri iplik bu görevleri yerine getirmek. Bu tür uzmanlık elyaf türleri küçük biofactories olarak işlev farklı ipek üreten bezleri, evrimle meydana gelmiştir. Bu biofactories üretimi ve elyaf üretimi için ipek proteinleri büyük miktarlarda saklamak. Biyokimyasal olayların karmaşık bir dizi sayesinde, bu ipek proteinleri ekstrüzyon üzerine sağlam bir malzeme bir sıvı haline dönüştürülür. Mekanik çalışmalar örümcek ipek yüksek gerilimli çelik 3 daha güçlü olduğunu göstermiştir. Analizler örümcek ipek ipler yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkiyi anlamak için, örümcek ipeği, büyük ölçüde onların protein dizileri içinde 4 blok tekrarlar proteinler, ya da fibroins ibaret olduğunu ortaya koymuştur. Inanılmaz bir örümcek ipek çekme dayanımı ve genişletilebilirlik katkıda Ortak moleküler imzalar tercüme ipek cDNAs analizleri ile sökülmüş edilmektedir. Örümcek ipekler olağanüstü malzeme özellikleri göz önüne alındığında, dünya çapında araştırma laboratuarları, ticari, askeri ve endüstriyel uygulamalar için sentetik ipek lifleri iplik üretmek için süreci anlamak ve taklit etmek için yarış halindeler. Araştırma laboratuvarı yapay örümcek ipeği iplik temel güçlüklerden biri, ipek üreten bezlerin lifleri ekstrüzyon esnasında meydana gelen biyokimyasal süreçlerin tam bir anlayış içerir. Burada yedi farklı ipek üreten bezlerin büyük ve küçük ampullate bezleri içeren cobweaving kara dul örümceğinin, 5,6, tubuliform [sentezler yumurta durumda ipek] [paletli vinç ve iskele ipek üreten] 7 izolasyonu için bir yöntem mevcut , 8, flagelliform [koçanı-dokumacılar bilinmeyen işlev] [tutkal ipek, toplam yapar] aciniform [sentezler av sarma ve yumurta durumda konuları] 9 ve piriform 10 [Ek disk ipek üretir]. Bu yaklaşım, karbondioksit gazı, karın cephalothoraksın sonraki ayırma ve ipek üreten bezlerin elde etmek için karın, mikrodiseksiyon örümcek anestezi dayanmaktadır. Farklı ipek üreten bezlerin ayrılmasını takiben, bu dokularda belirlemek için kantitatif gerçek zamanlı PCR, kuzey-ve batı blot, kütle spektrometresi (MS veya MS / MS) analizleri de dahil olmak üzere farklı biyokimyasal analizler için farklı makromoleküllerin almak için kullanılabilir yeni ipek protein dizileri, ipek montaj yolu katılırlar, ya da sağlam doku, hücre kültürü veya histolojik deneyler için kullanmak proteinleri araştırın.

Burada kadın kara dul örümcekleri karın ipek üreten bezlerin kaldırmak için etkili bir strateji açıklanmaktadır. Bu prosedür, yedi ayrı ipek üreten, son derece saf bir moda, örümcek ipeği üretimi ve lif montaj inceleyen araştırmacılar için önemli bir süreci bezlerinin hızlı bir izolasyon sağlar.

Black Widow Spider İpek üreten Bezler, Mikrodisseksiyon

Modern örümcekler; hareket etme, av yakalama ve ... koruması dahil olmak üzere geniş bir biyolojik fonksiyon yelpazesine sahip, yüksek performanslı ipek lifleri örerler.

Bu prosedürün genel amacı, örümceğin abdomeninden yedi farklı ipek üreten bezi izole etmek ve bu dokuları moleküler ve biyokimyasal çalışmalarda kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle örümceğin anesteziye alınmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise sefalik bölgeyi, toraksı ve abdomeni ayırmak ve abdomeni küçük bir diseksiyon kabı içinde böcek iğneleriyle sabitlemektir.Prosedürün üçüncü adımı, ipek üreten bezleri açığa çıkarmak için dış iskelette kesiler yapmaktır. Prosedürün son adımı ise farklı ipek üreten bezlerin çıkarılmasıdır. Nihayetinde, sırasıyla kantitatif gerçek zamanlı PCR veya kütle spektrometrisi gibi moleküler ve biyokimyasal yaklaşımlar aracılığıyla, farklı ipek üreten bezlerin farklı ipek mRNA'ları veya proteinleri eksprese ettiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu yöntem, ipek üreten bezlerin içinde depolanan proteinleri ortaya çıkararak örümcek biyolojisi araştırmalarına önemli bilgiler sağlayacaktır. Bu proteinlerin, askeri ve tıbbi alanların yanı sıra birçok ticari ve endüstriyel uygulama alanı bulunmaktadır. Bu özel çalışmayı yapma fikri ilk olarak, ipek üreten bezlerin içinde depolanan proteinler hakkında daha fazla bilgi edinme ihtiyacımız olduğunda ortaya çıktı.Bu tekniğin temel avantajı, dişi siyah dul örümceklerinin oldukça büyük abdomenlere sahip olması sayesinde ipek üreten bezlerin izole edilmesinin çok kolay olmasıdır. Bu yöntemde yeni olan kişiler, diseksiyon sırasında bezlerin sık sık yırtılması nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Ayrıca izole edilmesi zor olan bazı anatomik yapılar da bulunmaktadır.İyi bir diseksiyon için görsel gösterim kritik öneme sahiptir. Prosedürü Kobe LaMattina, Tiffany Tootin, Blasingame ve Y Shaw gösterecektir. Diseksiyona başlamadan önce; 0.1 molar sodyum klorür, 0.015 molar sodyum sitrat ve %0.1 etil bikarbonattan oluşan 500 mililitre diseksiyon tampon çözeltisi hazırlayın.Ardından, örümceği muhafaza etmek ve dışarı sürünmesini önlemek için plastik astarlı bir karton kutu hazırlayın. Kara dul örümceklerini genellikle odun yığınlarından, çalılıklardan veya garajlardan elde ederiz ve onları laboratuvarda barındırmak için cam kavanozlar kullanırız. Örümcek elde edildikten sonra, örümceği tutarak cam kavanozdan kutuya aktarın.Güvenlik için iki çift lateks veya bahçe eldiveni giyin. Ardından küçük plastik bir kültür tüpüyle örümceğe arkadan yaklaşın, örümceği tüpün içine kaydırın ve tüpü hemen tıkayın. Örümceği anesteziye almak için tüpün içine 5 ila 10 PSI basınçta karbon dioksit gazı vererek 10 dakika bekletin; abdomenin sefalik torakstan ilk diseksiyonu, örümcek henüz anestezi altındayken beş dakika içinde gerçekleştirilmelidir.Anestezize edilmiş örümceği küçük bir diseksiyon kabına yerleştirin. Karın bölgesini serbest bırakmak için sefalik toraksı abdomene bağlayan dar sap şeklindeki pedisteli kesin. Sefalik toraks örümceğin zehir dişlerini içerir ve uygun şekilde imha edilmesi gerekir.Petri kabına yerleştirilen sefalik toraksı dikkatlice çıkarın ve gece boyunca dondurun. Atmadan önce, abdomenden çıkan sıvının olduğu bölgeyi belirleyerek, pedes hücre kırpma işlemiyle örümceğin abdomeninde açılan deliği bulun. Tek bir diseksiyon iğnesi kullanarak, iğneyi delikten içeri, abdomenin içine yerleştirip abdomeni diseksiyon tepsisine sabitleyin; örümceği, pedestal disektörden en uzak, spint ise disektöre en yakın olacak şekilde konumlandırın.Bir çift mikro makas kullanarak, pedes hücresinden gelen delikten başlayın ve her iki yanda dış iskeleti geçerek dorsal tarafa ulaşana kadar lateral olarak kesin. Pens yardımıyla anterior dış iskelet segmentini geriye doğru soyun ve bu konuma ikinci bir iğne yerleştirin. Ardından, diseksiyon tepsisini başlangıçtaki lateral kesimlere 90 derecelik bir açıyla çevirin.Spintlere ulaşana kadar kesmeye devam edin. İnsizyon, başlangıçtaki lateral kesime dik veya dikey olacaktır. Spintler kum saati şeklindeki yapının altındadır ve dairesel bir görünüme sahiptir.Dikey kesi yapılırken spinaları kesmeyin. Karın bölgesini diseksiyon tampon çözeltisine daldırın. Kalan dış iskeleti, ilk lateral kesiden başlayarak geriye doğru soyun.Bu işlem tamamlandığında, beyazımsı ila sarımsı görünümdeki yağ dokusu pens kullanılarak net bir şekilde görülmelidir. Yağ tabakasının çoğu uzaklaştırılana ve ipek bezleri net bir şekilde görünene kadar yağları ayıklamaya başlayın. Eğer yumurtalar mevcutsa, bunlar uzaklaştırılmalıdır.Bu aşamada, bezleri şu sırayla diseke edin: tübüler form, majör flagella formu, agrege minör asif formu ve son olarak piriform. Her bir bezi diseksiyon sırasına göre tanımlayacağız.Tübüler formdaki bezler diğer tüm bezlerin üzerinde yer alır ve abdominal kavitede bol miktarda bulunan üç çift çok uzun silindirik tüpe sahiptir. Bu bezleri diğer bezlerden dikkatlice ayırın. Kanalları aracılığıyla spinner reds'e bağlı kalacak şekilde serbestçe yüzmelerini sağlayın.Ardından, armutlarda da bulunan iki ana ampulla bezini dikkatlice ayırın. Bu bezler büyük ve hilal şeklindedir; uzun, kıvrımlı distal kuyruklara ve genişliği azalan proksimal kısımlara sahiptirler. Örümceğin iğreciklerine yaklaştığınızda, ana ampulla bezlerini çıkarın ve steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin.Bezleri çıkardıktan sonra buz üzerine yerleştirin. Ardından, flagella formm bezini çıkarın. Flagella formm bezi aynı zamanda bir armut şeklinde mevcuttur.Çevresi, çıkarıldıktan sonra buz üzerine yerleştirilen spintlere doğru uzanan küçük silindirik zigzagonal bir kanala sahip çok loblu bir yapıdadır. Bunu takiben, küçük aletin morfolojik olarak büyük alete çok benzediği ancak belirgin şekilde daha küçük olduğu görülür. Çiftler halinde bulunan agregat bezi büyük ve çok lobludur ve büyük düzensiz loblara sahip çok geniş bir boşaltım kanalına sahiptir.Sino formm bezleri çok sayıda bulunur ve kısa, küçük parmak benzeri çıkıntılara benzerler. Piriform bez, abdomendeki en küçük bezdir ve spintlere kadar uzanan birçok küçük boşaltım kanalıyla birlikte, bir yelpazeye benzeyen birçok sıkışık silindirik kanala sahiptir. Artık serbestçe yüzen tek bez tübüler formm bezi olduğuna göre, kanalı pensle sıkarak ve spint yanındaki çıkış noktasından kopana kadar dikkatlice çekerek onu çıkarın. Disseksiyon sonrası, dissekte edilen tüm bezleri, tüp sıvı azota dondurana kadar yerleştirerek şok dondurun ve saklama için -80 °C'de muhafaza edin.Alternatif olarak, bezler diseksiyon prosedürü sırasında bağımsız olarak çıkarıldıktan hemen sonra dondurulabilir. Bu şekil, bezlerden toplam RNA izolasyonunun ardından, piriform bez hariç farklı ipek üreten bezlerdeki ipek geni TUSP one mRNA seviyelerinin kantitatif gerçek zamanlı PCR analizi kullanılarak izole edilmesini göstermektedir. Tübüler form bezleri, en yüksek TUSP one mRNA bolluğuna sahiptir.Bu şekil, tübüler formm bezinden ekstrakte edilen proteinlerin amino asit kompozisyon profilinin tipik bir sonucunu göstermektedir. Mavi renk polarside zincir gruplarına sahip amino asitleri, kırmızı renk ise polar olmayan side zincir gruplarına sahip amino asit kalıntılarını yansıtmaktadır. Bu şekil, insolution triptych sonrası piriform bezden elde edilen protein ekstraktlarının kütle spektrometrisi analizini göstermektedir.Buradaki sindirim x2, spektrum yoğunluğunun iki kat artırıldığını temsil eder. Spektrum peptit iyon kütlelerinin yanındaki diyez (#) sembolü, geliştirilmesinin ardından ipek fibroin PYSP1'den türetilen peptitleri belirtir. Bu teknik, süzme biyolojisi topluluğundaki araştırmacıların önünü açmıştır.Suda bekletilmiş fiber üretimi, ipek fiber birleşimi ve ekstrüzyonda yer alan kimyasal ve moleküler süreçleri araştırmak için kullanılmıştır. Bu teknik doğru şekilde uygulandığında, bir buçuk ila üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, örümcek dişleri çıkarılana kadar iki çift eldiven giyilmesi önemlidir.Bu yöntemin sonunda, ipek üreten bezler RNA ve protein ekstraksiyonu için kullanılabilir. Bu materyaller, kantitatif gerçek zamanlı PCR'ın yanı sıra kütle spektrometrisi gibi alt uygulamalar için kullanılabilir. Bu çalışmalardan elde edilebilecek bilgiler, ipek montajını ve ipek ekstrüzyon yolunu daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır.Bu videoyu izledikten sonra, dişi Kara dul örümceğinden birbirinden farklı yedi ipek üretim bezinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

microdissection-of-black-widow-spider-silk-producing-glands

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Örümcek ipek ve üstün mekanik özellikleri ve biyokimyasal rağmen, bu malzeme geleneksel yollarla, büyük miktarlarda hasat edilemez. Burada nesil Biyomalzeme olarak örümcek ipeği üretimi ve kullanımı eğitimi araştırmacılar için önemli bir süreç olan yapay örümcek ipeği lifleri, spin etkili bir strateji tanımlamak.

Bir Laboratuvar Ölçekli Sentetik Örümcek İpek Üretimi

Intravital mikroskopi canlı hayvanlarda çeşitli biyolojik süreçleri görüntüleme sağlayan güçlü bir araçtır. Bu yazıda, canlı farelerde tükürük bezlerinde bu salgılama granüller gibi alt-hücresel yapıların, dinamiklerini görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Bitki bezleri, biyotik çevre ile etkileşimlerde yer alan birçok bileşiğin biyosentezi ve salgılanmasından sorumlu özel yapılardır. Moleküler ve biyokimyasal özellikleri üzerinde çalışmalara olanak sağlamak için, burada etçil bitki Nepenthes'ten metabolik olarak aktif tek bezleri izole etmek için mekanik bir mikro hazırlama tekniği oluşturulmuştur.

Etçil Bitki Nepenthes'in Dokusundan Canlı Çok Hücreli Bezlerin İzolasyonu

Bu makale 1 için elektrik stimülasyonu kullanarak örümcekler zehir çıkarılması için bir protokol), proteomik karakterizasyonu yapmak 2) zehir bezi gen ifadesini uyarmak, ve 3) zehirlerinin fonksiyonel çalışmalar yapmak sağlar. Bu gen ifadesi çalışmaları için zehir bezi microdissections bir açıklama ile takip edilmektedir.

Proteomik ve Transkriptomik Analizleri Spiderlardan Venom çıkarımı ve Venom Bezi Microdissections

Bir protokol mikrosıvısal iplik ve rejenere ipek fibroin Monofilament Mikroyapı karakterizasyonu için sunulmaktadır.

Mikrosıvısal kuru-iplik ve rejenere ipek Fibroin lifleri karakterizasyonu

Burada, hücre dışı Matriks (ECM) ifade ve duktal Morfoloji araştırmak için meme dokuları bütün, olduğu gibi fare yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Fare #4 karın bezleri tarafsız tampon formalin içinde sabit kesitli ve ECM proteinler için immünhistokimya kullanarak lekeli 8-10 hafta eski kadın nulliparous fareler, elde.

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

Her ne kadar alt Heteroptera içinde birçok böcekler (Insecta: Hemiptera) zehirli, onların venom kompozisyon ve onların venom toksinleri işlevleri vardır çoğunlukla bilinmeyen. Bu iletişim kuralı heteropteran zehirlerini elektrostimülasyon, taciz ve bezi diseksiyon kullanarak daha fazla karakterizasyonu için hasat yöntemleri açıklar.

Venom toksinlerin Assassin böcek ve diğer Heteropteran böcekler hasat

Hypopharyngeal bezi acinus boyutu hemşire bal arı beslenme sağlam bir ölçüsüdür. Burada, biz anatomi, boyama, görüntüleme ve hemşire arı hypopharyngeal bezi acini ölçme için detaylı bir protokol sağlar.

Ölçüm Hypopharyngeal bezi Acinus boyutunda bal arı (Apis mellifera) işçi

Burada, su çözünebilir rekombinant örümcek ipek protein çözümleri ve bu çözümlerden oluşabilir malzeme formları üretmek için bir protokol sunuyoruz.

Isı ve basınç kullanarak sulu solvasyon yoluyla rekombinant örümcek Silks malzeme oluşumu

Yetişkin sivrisinek tükürük bezi (SG), virüsler ve parazitler de dahil olmak üzere sivrisinek kaynaklı tüm patojenlerin insan konakçılarına iletilmesi için gereklidir. Bu video, SG'lerin larva (L4) evresi Anopheles gambiae sivrisineklerinden verimli bir şekilde izole edilmesini ve daha fazla analiz için L4 SG'lerin hazırlanmasını göstermektedir.

Anopheles gambiae Sivrisineklerinden Larva Tükürük Bezlerinin Diseksiyonu ve İmmünasyon

Öğrenin, kara dul örümceklerinden ipek üreten bezleri mikrodisseksiyon yöntemiyle izole etmeyi. Bu teknik, moleküler ve biyokimyasal analizler için hızlı ve saf doku elde edilmesini sağlar.

Black Widow Spider İpek üreten Bezler, Mikrodisseksiyon

Daha fazla video keşfet