Fare Hipokampal Dilim Kültürlerinde Tek Hücreli Elektroporasyon Yoluyla Gen İfadesi

Bir tabaktaki bir kültür ekinde kültürlenmiş bir fare beyninden alınan hipokampal bir dilimle başlayın.

Dilimi içeren eki kesin ve mikroskop altında bir elektroporasyon odasına sabitleyin.

Odayı, aşırı uyarılmayı engellemek ve hücresel toksisiteyi önlemek için voltaj kapılı bir sodyum kanal blokeri içeren bir tamponla perfüze edin.

Dilimin yakınına, ilgilenilen geni içeren plazmitleri içeren bir pipet yerleştirin.

Bir zar çukuru oluşana kadar hedef hipokampal nörona yaklaşırken pipet tıkanmasını önlemek için pozitif basıncı koruyun.

Membran ile bir sızdırmazlık oluşturmak için negatif basınca geçin.

Hücresel hasarı en aza indirmek için pozitif ve negatif basınç arasında geçiş yapın.

Membranı geçici olarak geçirgen hale getirmek için bir elektroporasyon darbesi uygulayın ve plazmit girişini kolaylaştırın.

Pozitif basıncı korurken pipeti geri çekin ve komşu hedef nöronlar için elektroporasyonu tekrarlayın.

Elektroporasyonlu dilimi yeni bir parçaya aktarın ve ilgilenilen genin ekspresyonuna izin vermek için inkübe edin.

Elektroporasyon için dilim kültürleri hazırlamak için, ilgilenilen kültür eklerini 900 mikrolitre kültür ortamı ile yüklenmiş ayrı üç santimetrelik petri kaplarına aktarın ve kültürleri bir masa üstü karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Daha sonra, taze kültür eklerini 3,5 santimetrelik bir petri kabında uç başına bir mililitre dilim kültür ortamı ile en az 30 dakika önceden inkübe edin ve elektroporasyon teçhizatının hatlarını beş dakika boyunca %10 ağartıcı ile sterilize edin.

Perfüzyonun sonunda, 0.001 milimolar tetrodotoksin içeren filtre ile sterilize edilmiş aCSF ile perfüze etmeden önce hatları iyonize otoklavlanmış su ile en az 30 dakika durulayın. Elektroporatör darbesini eksi beş voltluk bir genliğe, bir kare darbeye, 500 milisaniyelik bir trene, 50 hertz'lik bir frekansa ve 500 mikrosaniyelik bir darbe genişliğine ayarlayın. Bir cam pipeti beş mikrolitre plazmid içeren iç solüsyonla doldurun ve sıkışan kabarcıkları çıkarmak için ucu birkaç kez hafifçe vurun ve hafifçe vurun.

Ucun hasar görmediğini doğrulamak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın ve pipet ucunu elektroda güvenli bir şekilde takın. Uç aCSF ile temas ettiğinde, elektroporatörün pipet direnci okumasını kaydedin. Bir dilim kültürünü izole etmek için, kültür ekleme zarını keskin bir bıçakla kesin ve dilim kültürünü elektroporasyon odasına dikkatlice aktarmak için keskin açılı forsepsler kullanın.

Ardından kültür konumunu bir dilim ankraj ile sabitleyin. İlgilenilen hücrelerin elektroporasyonu için, pipete ağızdan pozitif basınç uygulayın ve pipet ucunu dilim kültürünün yüzeyine yakın bir yere hareket ettirmek için üç boyutlu düğme kontrollerini kullanın. Kültürü mikroskopla görüntüleyerek, hücre yüzeyinde bir çukur oluşana kadar uygulanan pozitif basıncı koruyarak hedef hücreye uç ile yaklaşın.

Çukurun görüntülenmesi üzerine, pipet ucu ile plazma zarı arasında gevşek bir sızdırmazlık oluşması için ağızdan hızlı bir şekilde hafif negatif basınç uygulayın. Membran pipete hafifçe girecektir. Hoparlörlerden gelen tondaki artışla gösterildiği gibi, pipetin ilk direncinde yaklaşık 2,5 katlık bir artış gözlemlenmelidir.

Çukurun reform yapması için hızlı bir şekilde pozitif basınç uygulayın. Ardından, az önce gösterildiği gibi duraklamadan hemen en az iki basınç döngüsü daha tamamlayın. Son basınç darbesinden sonra, negatif basıncı bir saniye basılı tutun.

Hoparlörlerden gelen ton perdede sabit bir tepeye ulaştığında, elektroporatörü hızlı bir şekilde darbelemek için ayak pedalını kullanın. Elektroporasyondan sonra, pipeti basınç uygulamadan hücreden yaklaşık 100 mikron uzağa nazikçe geri çekin ve bir sonraki hücreye yaklaşmadan önce direncin temel okumaya benzer olduğunu doğrulayarak pozitif basıncı yeniden uygulayın. İlgilenilen tüm hücreler elektroporasyona tabi tutulduğunda, dilim kültürünü hazırlanan taze kültür eklerinden birine aktarın ve eki üç güne kadar 35 santigrat derecede yerleştirin.