Amaxa Nucleofector İnsan Sinir Kök Hücreler Transfecting

Merhaba, ben Steve. UC Irvine Patoloji Bölümü'ndeki Dr. Flanagan'ın laboratuvarında çalışıyorum. Bugün size, bir maxis nükleer faktör kullanarak insan nöral öncül hücrelerinin nasıl transfekte edileceğini göstereceğim.

Başlamak için çok sayıda hücreye ihtiyacınız olacak. Bu protokol çok yüksek bir hücre yoğunluğu gerektirdiğinden, en az konfluen bir T 25 flask kullanmanızı öneririm; böylece en az bir milyon hücreye sahip olursunuz. İlk olarak, hücreleri hücre disosiyasyon tamponu kullanarak yüzeyden ayırarak ve ardından onları sayarak başlayacağım.

Bu prosedür için paketleme protokolüme bakabilirsiniz. Transfeksiyon deneylerim için Amaxa'yı tercih etme sebebim, Amaxa'nın belirli hücre tipleri için, benim durumumda ise nöral kök hücreler için özel transfeksiyon protokolleri geliştirmesidir ve bu yöntem çok iyi sonuç vermektedir.

Çok yüksek transfeksiyon verimliliği ve çok yüksek hücre canlılığı sağlar. Hadi başlayalım. Artık transfeksiyon yapmaya hazırım.

Bu transfeksiyona hazırlık olarak, doku kültürü kabımı önceden bir gece boyunca fibrin ile kapladım. Ardından, içine bir miktar büyüme ortamı ekledim. Şu anda hücreleri almak üzere inkübatörde bekletilmektedir.

Ayrıca; tüm reaktiflerimi, DNA vektörümü ve transfeksiyona çözümünü hazırladım. Hepsi burada buz üzerinde bekliyor. Transfeksiyona başlamaya hazırım.

Bu, M max nükleer faktördür ve bunu steril kabine yerleştirmeden önce %70 etanol ile dezenfekte edip ardından kağıt havluyla sileceğim. Toplamda 4 milyon hücreye sahip olmak için hücreleri saydım ve onları süspanse ettim. Artık transfeksiyona başlamaya hazırım.

Öncelikle, hücrelerin içinde bulunduğu medyumu uzaklaştıracağım. Hücre peletim burada ve içinde bulundukları medyumu vakumla çekeceğim. Transfeksiyon medyumunda herhangi bir protein veya benzeri madde bulunmasını istemediğim için mümkün olduğunca fazla medyum uzaklaştırmaya çalışacağım, çünkü bu durum transfeksiyon protokolünü etkileyebilir.

Besiyerinin neredeyse tamamını uzaklaştırdım ve şimdi bu hücre peletini, özel olarak formüle edilmiş 100 µL fare nöral kök hücre nükleer faktör çözeltisinde yeniden süspande edeceğim. Mxa, fare nöral kök hücrelerini transfekte etmek için bir transfeksiyon çözeltisi üretiyor ve insan nöral kök hücreleri için bir çözeltileri yok, ancak fare hücreleri için olanın çok iyi çalıştığını gördük. Bu nedenle, 100 µL fare nöral kök hücre nükleer efektör çözeltisi ekleyeceğim.

Ardından, hücre kümelenmeleri kalmayacak şekilde hücre peletini içinde çok iyi şekilde yeniden süspande edeceğim. Böylece hemen hemen homojen bir hücre süspansiyonuna sahip olacağım. Bu yüzden pipetle yaklaşık 10 kez yukarı aşağı hareket ettireceğim.

Şu an oldukça homojen bir karışım elde ettiğimi düşünüyorum ve bunu şimdi 1,5 ml'lik açık bir mikro santrifüj tüpüne aktaracağım. Tüm solüsyonu aldığmdan emin olmak için P 1000 pipet kullanıyorum. Şu anda fare transfeksiyon solüsyonu içerisinde resüspanse edilmiş 4 milyon hücrem var ve şimdi bunlara beş µL vektör ekleyeceğim.

Şimdiye kadar numuneyi buz üzerinde tuttum. Öncelikle 5 µL alacağım. Şimdi bunu hücre süspansiyonuna ekleyeceğim.

Şimdi yaklaşık 50 µL'ye ayarlanmış bir P 200 kullanacağım ve hücreleri vektörle çok iyi bir şekilde karıştıracağım. Bu yüzden pipetle 10 kez yukarı aşağı çekeceğim. Tamam, bu hazır.

Ben de transfeksiyon yapmaya hazırım. Bu yüzden yeni bir kit açacağım. Ayrıca Amaxa tarafından sağlanan özel bir pipet alacağım.

Şimdi kapağı çıkaracağım ve bu karışımı nazikçe yukarı çekeceğim. Pipeti tüpün en altına kadar yerleştirip çözeltiyi yavaşça boşaltacağım. Ardından maks nükleer faktörü açacağım ve bunu 33 0 3 3 olarak ayarlayıp enter tuşuna basacağım.

Ardından vete'yi vete tutucusuna yerleştireceğim, sonra tekerleği döndüreceğim ve artık transfeksiyona hazırım. Ancak bundan önce, transfekte edilen hücrelere hemen eklemek üzere sıcak besiyerinin hazır olduğundan emin olacağım. Transfeksiyondan hemen sonra vete'nin içine sıcak besiyeri eklemek, hücre canlılığının artmasına yardımcı olur.

Şimdi bir P 1000 hazırlayacağım. Ayrıca, hücreleri hemen besiyerine aktarabilmek için şu an inkübatörde bekleyen besiyerli plakayı alacağım. Şimdi tekrar enter tuşuna basıyorum ve işlem tamamlandı.

Ve başarılı transfeksiyon sonucunda, burada gördüğünüz üzere, başarılı transfeksiyona işaret eden oldukça kalın bir kabarcık tabakası oluşmuştur. Bu nedenle, vete içerisine 500 µL önceden ısıtılmış besiyeri ekleyeceğim. Hücrelerin ihtiyaç duyduğu daha fazla besiyeri ekliyorum ve hücreleri vete'den çıkarmak için aynı MX pipetini kullanacağım.

Bu nedenle şu an oldukça stres altındalar. Bu yüzden onları doğrudan sıcak ortama, daha fazla sıcak ortama yerleştireceğim. Ve son olarak, son adımda, tüm bu hücreleri çıkardığımdan emin olmak için Q vete'yi biraz daha önceden ısıtılmış ortamla durulayacağım ve bunu aynı L kuyucuğuna yerleştirip plakayı hemen inkübatöre koyacağım.

Bu görüntüde, bir nükleer faktör ile transfekte edilmiş ve kareli lameller üzerine ekilmiş insan nöral öncül hücrelerini görüyoruz. Transfeksiyondan iki gün sonra bile, GFP ekspresyonu ile gözlemleyebildiğimiz yaklaşık %50'lik bir transfeksiyon verimliliğine sahibiz. Bugün size, Xis nükleer faktörünü kullanarak insan nöral öncül hücrelerinin nasıl transfekte edileceğini gösterdim.

Transfeksiyonunuzda başarılar dileriz.