Name: Amaxa Nucleofector İnsan Sinir Kök Hücreler Transfecting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Öğrenin, Amaxa Nucleofector kullanarak insan sinir kök hücrelerini transfekte etme yöntemini. Bu protokol, yüksek verimlilik ve hücre canlılığı sağlayarak gen fonksiyonlarını in vivo çalışmalar için kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Çocuk Hastanesi, Orange County hNSPC kültürleri Araştırma Enstitüsü Ulusal İnsan Nöral Kök Hücre Kaynak Dr. Philip H. Schwartz kabul etmek istiyorum.

Not: Pasajlanması İnsan Nöral Kök Hücreler makale (bakın <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ) ve Sayım İnsan Nöral Kök Hücreler makale ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262</a> hNSPCs tekrar süspansiyon ve saymak nasıl öğrenmek için). Hazırlık <ol><li> Transfeksiyon için kullanılabilir hücreleri bol miktarda (her DNA için birkaç milyon hücreleri transfekte) olduğuna emin olun. </li><li> Transfekte hücreler 10 mcg / ml insan fibronektin transfeksiyon bir gece önce, seribaşı olacak içine Coat doku kültürü tabak,. Sağ transfeksiyon protokolü başlamadan önce, fibronektin kaldırmak, tabak PBS ile durulama ve çanak kültür ortamı. Ortamı ısıtmak için 37 ° C doku kültürü inkübatör çanak bırakın. Ayrıca, önceden sıcak 37 ° C inkübatör 1 ml kültür ortamı </li><li> Transfekte DNA (ler), ve buz üzerinde transfeksiyon çözüm (Amaxa) yerleştirin. </li></ol> Transfeksiyon <ol><li> PBS (genellikle x 106 hücre transfeksiyon başına ~ 5) hücreleri belirli bir sayıda yıkayın. Pelet santrifüjle (1000 rpm 5 dakika boyunca (~ 200xg)) hücreleri tarafından mümkün olduğu kadar çok PBS olarak kaldırmak ve 100 ul transfeksiyon kiti ile sağlanan transfeksiyon çözüm hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Hücre süspansiyonu, 1.7 ml Eppendorf tüpüne aktarın. </li><li> Hücre süspansiyonu ul DNA 5 (transfeksiyon ortalama DNA ~ 5-10 mg) ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> Amaxa mini-pipet kullanarak, hücre DNA karışımı Amaxa transfeksiyon küvet içine aktarın. 1 ml, sonraki adım için önceden ısıtılmış kültür ortamı olduğundan emin olun. Ayrıca, inkübatör, hücre çanak kültür ortamı ile kaldırmak ve doku kültürü kaputu yerleştirin. </li><li> Küvet Nucleofector koyun, tekerleği saat yönünde döndürmek ve programı &quot;A-033&quot; i seçin. Enter tuşuna basın. </li><li> Başarılı bir transfeksiyon küvet çözüm üstünde kabarcıklar çok yoğun bir tabakanın varlığı ile gösterilir. Küvet içinde 500 ul sıcak medya ekleyin ve Amaxa mini-pipet kullanarak transfekte hücreler, önceden ısıtılmış medya ile çanak içine aktarın. Küvet daha sıcak bir ortam ile durulayın ve aynı bulaşık durulama ekleyin. 37 ° C doku kültürü inkübatör hücreleri ile çanak yerleştirin. </li></ol>

<ol><li>Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+non-viral+method+for+gene+transfer+into+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New non-viral method for gene transfer into primary cells.</a> Methods. 33, 151-163 (2004).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262</a> (2007).</li>
</ol>

Bu protokol hNSPCs için oldukça hızlı ve verimli bir transfeksiyon prosedürü açıklamaktadır. Bu yordamı kullanarak, biz, yaklaşık% 35 ilk transfeksiyon verimlilik elde edilmiştir. Bu yordamı transfekte Hücreler bir seçim aracı stably transfekte nüfus üretmek için kullanılır ise kısa vadeli çalışmalar için (geçici olarak transfekte hücreler) ya da uzun vadeli çalışmalar için kullanılabilir. Biz eksojen protein ifade hücrelerin% 70 ~ hangi stabil transfekte hücreleri oluşturulur. Geçici transfekte hNSPCs, eksojen protein ~ 7 gün boyunca devam...

<table><tbody><tr><td>Nucleofector Cihazı</td><td>Araç</td><td>Amaxa</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Fare nöral kök hücre nukleofektör kiti</td><td>Reaktif</td><td>Amaxa</td><td>VPG-1004</td><td></td></tr></tbody></table>

amaxa nucleofector İnsan sinir kök hücreler transfecting

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Yaygın olarak kullanılan katyonik lipid transfeksiyon ayıraçları ile insan sinir kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) gibi birincil memeli sinir hücreleri, Transfeksiyon genellikle kötü hücre canlılığı ve düşük transfeksiyon verimliliği sonuçlandı. Böyle bir gen tabancası veya mikroenjeksiyon gibi ilgi bir gen, tanıtan diğer mekanik yöntemler de kötü hücre canlılığı ve transfekte hücreleri düşük numaraları ile sınırlıdır. Birincil hücre içine dışsal bir gen tanıtmak için viral yapıları kullanarak strateji viral vektörler ve potansiyel güvenlik endişeleri oluşturmak için gerekli zaman ve emek miktarı hem de kısıtlı olmuştur. Biz burada, nöral kök hücreler transfecting için özel olarak optimize edilmiş elektrik akımı parametreleri ve tampon çözeltiler Amaxa Nucleofector cihaz ve teknoloji kullanarak hNSPCs transfecting için bir adım-adım protokolünü açıklar. Bu protokolü kullanarak, biz, yaklaşık% 35 ilk transfeksiyon verimlilik elde etti ve istikrarlı bir transfeksiyon sonra% 70 ~. Protokol Nucleofector cihaz ile elektroporasyon uygun tampon transfekte DNA ile hNSPCs yüksek sayıda birleştirerek gerektirir.

Bir ilgi bir hücreye gen Tanıtımı in vivo fonksiyonu nedenlerine açıklık için güçlü bir yöntemdir. Bu protokol Amaxa tarafından yapılan Nucleofector elektroporasyon cihazları kullanırken insan nöral kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) bir kültür transfecting verimli bir yöntem açıklanır.

Amaxa Nucleofector İnsan Sinir Kök Hücreler Transfecting

İnsan nöral kök/öncül hücreleri (hNSPC'ler) gibi primer memeli nöral hücrelerin, yaygın olarak kullanılan katyonik lipid transfeksiyon...

Merhaba, ben Steve. UC Irvine Patoloji Bölümü'ndeki Dr. Flanagan'ın laboratuvarında çalışıyorum. Bugün size, bir maxis nükleer faktör kullanarak insan nöral öncül hücrelerinin nasıl transfekte edileceğini göstereceğim.Başlamak için çok sayıda hücreye ihtiyacınız olacak. Bu protokol çok yüksek bir hücre yoğunluğu gerektirdiğinden, en az konfluen bir T 25 flask kullanmanızı öneririm; böylece en az bir milyon hücreye sahip olursunuz. İlk olarak, hücreleri hücre disosiyasyon tamponu kullanarak yüzeyden ayırarak ve ardından onları sayarak başlayacağım.Bu prosedür için paketleme protokolüme bakabilirsiniz. Transfeksiyon deneylerim için Amaxa'yı tercih etme sebebim, Amaxa'nın belirli hücre tipleri için, benim durumumda ise nöral kök hücreler için özel transfeksiyon protokolleri geliştirmesidir ve bu yöntem çok iyi sonuç vermektedir.Çok yüksek transfeksiyon verimliliği ve çok yüksek hücre canlılığı sağlar. Hadi başlayalım. Artık transfeksiyon yapmaya hazırım.Bu transfeksiyona hazırlık olarak, doku kültürü kabımı önceden bir gece boyunca fibrin ile kapladım. Ardından, içine bir miktar büyüme ortamı ekledim. Şu anda hücreleri almak üzere inkübatörde bekletilmektedir.Ayrıca; tüm reaktiflerimi

transfecting-human-neural-stem-cells-with-the-amaxa-nucleofector

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Genetik modifikasyon alanında son gelişmelere rağmen, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) aktarılmasının kaprisli bir süreç olmaya devam etmektedir. Bildiğimiz kadarıyla, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) transfekte etmek için sistematik ve etkili bir yöntem bildirilmemiştir. Burada, biz verimli transfekte ve insan iPSCs nucleofect sağlam protokoller açıklanmaktadır.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücreler transfekte ve Nucleofecting

Bu videoda, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde veya hiPSC'lerde, hedeflenen bir lokusta çift sarmallı kırılmalar oluşturmak için TALEN'leri kullanarak floresan protein gen entegrasyonu için homolojiye yönelik onarımı indükleyen hassas bir genom düzenleme tekniği açıklanmaktadır.

TALEN Aracılı Hedefli Gen Entegrasyonu: Floresan Protein Geninin hiPSC'lere Hassas Bir Şekilde Yerleştirilmesi için Tasarlanmış Diziye Özgü Nükleazların Kullanılması

Bu video, genetik olarak değiştirilmiş hematopoietik progenitör hücrelerin nöronal kök hücrelere doğrudan yeniden programlanmasını göstermektedir. Hematopoietik progenitör hücreler tarafından eksprese edilen transkripsiyon faktörleri, dönüşümlerini kolaylaştıran bir dizi moleküler olayı tetikler. İndüklenmiş nöronal kök hücreleri seçmek ve büyütmek için daha spesifik ortamlar kullanılır.

Hematopoetik Progenitör Hücrelerin Nöral Kök Hücrelere Doğrudan Yeniden Programlanması

Bu video, insan pluripotent kök hücrelerinin, tetrasikline duyarlı elementin kontrolü altında nörojenik bir transkripsiyon faktörü geni taşıyan tasarlanmış lentivirüslerle transfekte edilerek nöronlara farklılaşmasını indükleme sürecini ve ardından bir tetrasiklin türevi ve olgunlaşma ortamı ile muameleyi göstermektedir.

Tasarlanmış Lentivirüsler Kullanılarak Nöronlarda İnsan Pluripotent Kök Hücre Farklılaşması

Muhabir hücre çizgileri, görselleştirmek etiket ve heterojen popülasyonlar ilgi hücreleri izole etmek için bir araç sunmaktadır. Bununla birlikte, hedef gen, insan embriyonik kök hücreleri alışılmış homolog rekombinasyon kullanılarak son derece verimsizdir. Bu yazıda, çinko-parmak nukleaz gelişmiş homolog rekombinasyon kullanarak EGFP ile CNS Ortabeyin özel transkripsiyon faktörü PITX3 odağı hedefleme açıklar.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Hedefleme Çinko parmak Nükleazlar Geliştirilmiş Gen

Bir yöntem de periferik kan hücrelerinden zenginleştirilen hematopoietik projenitör hücrelerinden insan nöral kök hücrelerini elde etmek için geliştirilmiştir.

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

Güvenli liman AAVS1 lokusunda TALEN aracılı gen düzenleme, insan iPSC'lerinde yüksek verimli transgen ilavesi sağlar. Bu protokol, raportör hatları oluşturmak için bir GFP geninin hedeflenen entegrasyonunu sağlamak için TALEN ve donör vektör iletimi için iPSC'lerin hazırlanması, iPSC'lerin transfekte edilmesi ve iPSC klonlarının seçilmesi ve izole edilmesi prosedürlerini açıklar.

Transfeksiyon, Seçim ve İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Colony-toplama AAVS1 Safe Harbor içine GFP geninin ile TALEN-hedefli

Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Burada, erişkin murin subventriküler bölgesinden izole edilen genişletilmiş nöral kök hücrelerde (NSC'ler) gen iletim verimliliğini artırmak için tasarlanmış bir nükleofeksiyon sistemini açıklıyoruz. Bulgular, bu yöntemin NSC'lerde gen bozulmasını önemli ölçüde iyileştirdiğini, geleneksel transfeksiyon protokollerinin etkinliğini aştığını ve hücre sağkalım oranını artırdığını göstermektedir.

Erişkin Murin Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu, Genişlemesi ve Nükleofeksiyonu

Burada, bu hücreleri dopaminerjik öncü hücrelere farklılaştırarak, bunları Parkinson hastalığının fare modellerine naklederek ve nakledilen hücrelerin başarılı entegrasyonunu ve fonksiyonel etkinliğini doğrulamak için davranışsal ve elektrofizyolojik sonuçları değerlendirerek hassas nöronal modülasyon elde etmek için kimyasal olarak yeniden programlanmış kök hücrelerin mühendisliği için bir protokol açıklıyoruz.

Nörodejeneratif Hastalıkların Tedavisinde Yeniden Programlanmış Kök Hücre Kaynaklı Öncü Hücrelerde Kemogenetik Düzenleme

Öğrenin, Amaxa Nucleofector kullanarak insan sinir kök hücrelerini transfekte etme yöntemini. Bu protokol, yüksek verimlilik ve hücre canlılığı sağlayarak gen fonksiyonlarını in vivo çalışmalar için kolaylaştırır.

Amaxa Nucleofector İnsan Sinir Kök Hücreler Transfecting

Daha fazla video keşfet