Amaxa Nucleofector İnsan Sinir Kök Hücreler Transfecting

Merhaba, ben Steve. UC, Irvine'deki Patoloji Bölümü'nde Dr. Flanagan'ın laboratuvarında çalışıyorum. Bugün size bir maxis nükleer faktör kullanarak insan nöral öncü hücrelerini nasıl transfekte edeceğinizi göstereceğim.

İlk olarak, çok sayıda hücreye ihtiyacınız olacak. Bu protokol çok yüksek bir hücre yoğunluğu gerektirdiğinden, en azından birleşik bir T 25 şişesi diyebilirim, bu nedenle en az bir milyon hücreye ihtiyacınız olacak. İlk olarak, hücre ayrışma tamponu kullanarak hücreleri yüzeyden alarak ve sonra onları sayarak başlayacağım.

Ve bu prosedür için paketleme protokolüme bakın. Ve transfect deneylerim için max maxa'yı tercih etmemin nedeni, amaxa'nın belirli hücre tipleri için ve benim durumumda nöral kök hücreler için özel olarak hazırlanmış transfeksiyon protokolleri geliştirmesidir. Ve harika çalışıyor.

Çok yüksek transfekt verimlilik ve çok yüksek hücre canlılığı sağlar. Ve başlayalım. Şimdi bir transfeksiyon yapmaya hazırım.

Bu transfeksiyona hazırlanırken, doku kültürü kabımı gece boyunca fibrin ile kodladım. Ve ondan sonra, içine biraz büyüme ortamı yerleştirdim. Yani şu anda kuluçka makinesinde oturuyor ve hücreleri almayı bekliyor.

Ayrıca hepsini, tüm reaktiflerimi, DNA vektörümü ve transfeksiyon solüsyonunu hazırladım. Hepsi burada buzun üzerinde bekliyor. Ve transfeksiyona başlamaya hazırım.

İşte bu M max nükleer faktörü ve onu kaputun içine yerleştirmeden önce, %70 etanol ile dezenfekte edeceğim ve sonra bir kağıt havluyla sileceğim. Bu yüzden kendimi saydım, böylece toplamda 4 milyon hücrem oldu ve onları doğurdum. Ve şimdi transekte etmeye başlamaya hazırım.

Bu yüzden önce içinde bulundukları medyayı kaldıracağım. İşte burada hücre paletim var ve içinde bulundukları ortamı emeceğim. Ve mümkün olduğu kadar çok besiyerini çıkarmaya çalışacağım çünkü transfeksiyon besiyerinde herhangi bir protein veya benzeri bir şey olmasını istemiyorum çünkü bu transfeksiyon protokolünü etkileyebilir.

Bu yüzden medyanın hemen hemen çoğunu kaldırdım ve şimdi bu hücre paletini özel olarak formüle edilmiş fare nöro kök hücre nükleer faktör solüsyonundan yüz mikrolitre ile yeniden askıya alacağım. Mxa, fare nöro kök hücrelerini kesmek için bir transfeksiyon çözümü yapar ve insan nöro kök hücreleri için bir tane yoktur, ancak fare hücreleri için olanı kullanmanın çok iyi çalıştığını bulduk. Şimdi bu fare nöro kök hücre nükleer efektör solüsyonundan yüz mikrolitre su alacağım.

Ve hücre hücre paletimi çok iyi bir şekilde askıya alacağım, böylece hücre yığını kalmayacak. Yani hemen hemen, homojen bir hücre süspansiyonuna sahibim. Bu yüzden yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı boru çekeceğim.

Sanırım şimdi oldukça homojen bir karışıma sahibim ve şimdi bunu 1.5 mil açık dorf tüpüne aktaracağım. Bu yüzden bir P 1000 pipet kullanıyorum ve tüm bu çözümü aldığımdan emin olacağım. Şimdi 4 milyon hücreli reus'umu farede askıya aldım, yeni fare transfeksiyon solüsyonu ve şimdi vektörümden beş mikrolitre ekleyeceğim.

Bu yüzden şimdiye kadar bunca zamandır onu buzda tutuyorum. Ve böylece, önce beş mikro mikrolitreyi dört katına çıkaracağım. Şimdi bunu hücre süspansiyonuna ekleyeceğim.

Şimdi yaklaşık 50 mikrolitrelik bir P 200 seti kullanacağım ve hücreleri vektörle gerçekten çok iyi bir şekilde karıştıracağım. Bu yüzden 10 kez yukarı ve aşağı sıkacağım. Tamam, bu hazır.

Ve ben, transfekte etmeye hazırım. Bu yüzden yeni bir ev açacağım. Ayrıca amaxa tarafından sağlanan özel bir pipet alacağım.

Bu yüzden kapağı çıkaracağım ve bu karışımı nazikçe yukarı çekeceğim. Ve pipeti ağzın içine sonuna kadar sokacağım ve solüsyonu nazikçe sıkacağım. Bu yüzden maksimum nükleer faktörü açacağım ve bunu 33 0 3 3 olarak ayarlayacağım ve enter tuşuna basacağım.

Sonra vete'yi vete tutucusuna yerleştireceğim ve sonra tekerleği döndüreceğim ve şimdi transfect yapmaya hazırım. Ama ondan önce, transfekte edilmiş hücrelere hemen eklenmeye hazır sıcak medyaya sahip olduğumdan emin olacağım. Bu, bir transfeksiyondan hemen sonra damarın içine sıcak ortam eklersem hücre canlılığını artırmaya yardımcı olur.

Bu yüzden bir P 1000 hazırlayacağım. Ve böylece, ayrıca şu anda kuvözde duran medya ile oynanan medyayı alacağım, böylece hücreleri hemen medyaya aktarabilirim. Şimdi ben, şimdi tekrar enter tuşuna basacağım ve bitti.

Ve başarılı transfeksiyon, gördüğünüz gibi, burada başarılı transfeksiyonu gösteren çok kalın bir baloncuk tabakası var. Bu yüzden vete içine 500 mikrolitre ön ısıtma ortamı ekleyeceğim. Bu yüzden hücrelerin umutsuzca istediği daha fazla ortam ekliyorum ve hücreleri damardan çıkarmak için aynı MX pipetini kullanacağım.

Yani şu anda gerçekten stresliler. Bu yüzden onları doğrudan sıcak medyaya, daha sıcak medyaya koyacağım. Ve son olarak, son adım, Q vete'yi biraz daha ön ısıtma ortamıyla durulayacağım, elde ettiğimden emin olmak için, tüm bu hücreleri dışarı çıkaracağım ve bunu aynı kuyuya L içine yerleştireceğim ve plakayı hemen inkübatöre yerleştireceğim.

Bu görüntüde, bir erişim nükleer faktörü ile transfekte edilmiş ve ızgaralı örtü fişleri üzerine kaplanmış insan nöral öncü hücrelerini görüyoruz. Yani transfeksiyondan iki gün sonra bile, GFP ifadesi ile gözlemleyebileceğimiz yaklaşık %50 transfeksiyon verimliliğine sahibiz. Bugün size Xis nükleer faktörünü kullanarak insan nöral öncü hücrelerini nasıl transfekte edeceğinizi gösterdim.

Transfeksiyonunuzda iyi şanslar.