Name: Heterolog Hücreler kimyasal-duyusal reseptörleri Yüzey İfade Assaying (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Öğrenin, HEK293T hücrelerinde canlı hücre boyama ile kimyasal-duyusal reseptörlerin yüzey ifadesini nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, GPCR'ler ve diğer reseptörler için uyarlanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yazının eleştirel okuma Matsunami laboratuvar üyelerine teşekkür ediyorum.

1. Prosedür: Bu prosedür, 3 gün toplam zaman içinde tamamlandı üç bölümden oluşmaktadır: hücrelerinin transferi, transfeksiyon ve immünhistokimya Hergün yürütülen bir adım. Ilk iki gün içinde transferi ve hücrelerin transfeksiyon laminer akış odasında steril şartlarda yapılmalıdır. 1. Gün: yüzey ifade testi için HEK293T hücre aktarın. <ol><li> Transferi orta (M10):% 10 (hacimce) steril durumda fetal sığır serumu ile takviye asgari temel orta karıştırın. </li><li> Kurmak için gerekli olan plakaların sayısına bağlı olarak, istenen bir confluency 100mm bir kültür plakasına hücreleri büyütün. Büyümüş veya seyrek hücreler önlemek için transfer edilecek hücreler kısmını belirlemek için önemlidir: örneğin,% 100 konfluent 100 mm çanak, yaklaşık% 30 confluency elde etmek için 35 mm çanak yaklaşık% 3 devredebilir ikincisi. </li><li> Önce transfer, hücreler steril laminar akış odası, mont 22 X 22 mm steril poli D lisin (1 mg / ml) ve her biri 35 mm hücre kültürü çanak yer kaplama hücreler için çift tarafı kaplı cam kapak fişleri (Şekil 1 .) 10 dakika - 5 kuruması için çözüm izin verin. Bu süre zarfında, laminer odasında UV kaynak, istenirse kapak fişleri sterilize etmek için açık olabilir. Poly-Ge lisin heterolog hücrelerinin kapak fişleri sopa yardımcı olur. </li><li> Hücreleri aktarmak için, 100mm çanak mevcut medya aspirat, 8 mL steril PBS, aspirat PBS ekleyerek dikkatlice yıkayın ve 3 ml% 0.05 tripsin-EDTA kullanarak hücrelerin trypsinize; hücreleri çanak ayırmak, daha fazla enzimatik reaksiyonu engellemek 5 ml M10 sözlerine ekledi. Hücreleri Karışım ve steril konik tüp Koşul hacim transferi; pelet hücreleri için 5 dakika için 200 gr santrifüj. Hücre pelet zedelemeden, tripsin-EDTA içeren süpernatant aspire. 35 mm yemekleri hücreleri aktarmak için, her yemek için 1 ml M10 ekleyin ve hücreleri ayırmak çiğnemek. Her çanak yeniden süspanse hücrelerinin 1 ml ekleyin. 37 geceleme inkübe hücreleri ° C,% 5 CO 2. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Kat 22 poli D lisin ve her biri 35 mm çanak kaplı yüzü yukarı X 22 mm cam lamelleri. </li></ol> 2. Gün: HEK293T hücrelerinin Transfeksiyon. <ol><li> Aktarıldıktan sonra 18-24 saat, hücre reseptör çalışılmalıdır transfeksiyon için hazır. Reseptör ve 4 önce açıklanan Qiagen Miniprep Kit aşağıdaki protokol kullanarak bakteri kültürleri hazırlanan memeli ekspresyon vektörü PCI klonlanmış RTP1S kullanın. K ölümcül immün kolaylaştırmak için 20 amino asit uzunluğundaki rodopsin epitopu ile etiketlenmiş reseptörleri kullanın. </li><li> Reseptör inşa, 250 ng RTP1S inşa ve 50 ng yeşil floresan protein her transfeksiyon 1000ng kullanın. Üreticileri kılavuzuna göre Lipofectamine 2000, transfeksiyon kullanarak gerçekleştirin. </li></ol> 3. Gün: hücre yüzeyi boyanan reseptörleri görselleştirmek için İmmünositokimya. <ol><li> Başlamadan önce, boyama ve yıkama çözümler hazırlamak ve 4 ° C'ye kadar soğutmak Boyama orta: Minimum Essential Medium, 45 mL; fetal sığır serumu, 5 ml; Hepes (1M), 500 mcL (nihai konsantrasyon 10mM); Sodyum Azid (1,5 M), 500 mcL (son konsantrasyon 15mm). Hepes (1M), 5 ml (son konsantrasyonu 10mM); Sodyum Azid (1,5 M), 5 ml (son konsantrasyon 15mm) HBSS, 500 ml: çözüm yıkayın. Her iki çözüm de yeniden kullanım için 4 ° C'de muhafaza edilebilir. 100 kat boyama orta gerekli antikorları seyreltilmesi ile antikor çözümler hazırlayın. </li><li> 24 saat transfeksiyon hakkında odorant reseptörleri yüzey boyama için immünokimyanın başlatın. Canlı hücre boyama, 4 soğutmalı olmalıdır deney gerçekleştirmek için ° C doldurmak büyük bir buz bulunan ve mümkün olduğunca düz hale getirmek buz yüzey pat, buz üzerinde bir tepsiye yerleştirin ve% 70 ile sprey etanol. Düzgün bir yüzey elde etmek için, bir parafilm parça (tepsinin uzunluğundan daha küçük) ve etanol püskürtülür tepsi yapıştırmayın kesin. Cam kapak, cımbız kullanarak parafilm transfekte hücreler, her seferinde bir hücre yan içeren fişleri aktarın. Katman her kapak kayma (Şekil 2) bir köşesine özenle ekstrüzyon, 100 mcL soğuk birincil boyama çözüm kayma. Katmanlama antikor çözümü ile tüm kapak fişleri sonra, hava çözüm kurumasını önlemek için tepsisi kapağı. 45-60 dakika için birincil inkübasyon yürütmek. </li><li> Birincil inkübasyondan sonra, hızlı bir şekilde, medya içeren orijinal 35mm kültür kaplarına kapak fişleri transfer. Aspire medya ve yemeğin kenarından hafifçe kapak kayma hücreleri kaybını önlemek için 2 mL soğuk yıkama çözeltisi ekleyin. Yıkama solüsyonu aspire edin ve üç yıkar tamamlamak için iki kez tekrarlayın. Sonunda üçüncü yıkama, yıkama solüsyonu aspire yok. </li><li> Ikincil antikor hazırlayın solutiboyama medya ve aynı kasetten yeni yapıştırılmış parafilm tabakası yıkama solüsyonu kapak fişleri transferi. Yine yavaşça 100 mcL birincil inkübasyon gibi köşesinden her kapak kayma tabakası antikor çözüm a'ya. 30 ikincil inkübasyon yürütmek - 45 dakika ve 35 mm orijinal yemekler yıkama solüsyonu transferi geri. Bir kez daha, açıklandığı gibi üç kez kayar kapak yıkayın. </li><li> Aspire son yıkama çözüm yıkayın ve 2 ml% 1 soğutulmuş paraformaldehid eklemek. 15 dakika boyunca buz üzerinde soğutulmuş% 1 paraformaldehid çözüm hücreleri sabitleyin. </li><li> Mount temiz mikroskop cam kapak fişleri hücre yüzü aşağı, montaj reaktif Mowiol kullanarak ve dikkatli tüm hava kabarcıkları (Şekil 3) hariç slaytlar. Bir kez Mowiol hava kurur, yüzey ve hemen aspire distile su ekleyerek kapağını yavaşça fişleri yıkayın. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Katman 100 mcL soğuk birincil boyama çözümü ile her lamel. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. temiz cam mikroskop hücre yüzü aşağı Mount lamelleri Mowiol montaj reaktifi kullanılarak kayar. </li></ol> 2. Temsilcisi Sonuçlar: Canlı hücre boyama şaperonlar (protein RTP1S Reseptör taşınması ile bu durumda odorant reseptör Olfr62) (Şekil 4) reseptörlerinin transfeksiyon, hücrelerin yüzeyindeki proteinler görselleştirmek için bir olanak sağlar. Reseptörlerinin hücre yüzeyi boyama boyama noktalı desen (Şekil 4B, içerlek) ile karakterizedir. Boyama, gözlemci, gürültüden gerçek yüzey boyama ayırt etmek zor yapma, uygunsuz yüksek gürültü yürütülen yol açabilir. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 şaperonlar ile reseptörlerinin Transfeksiyon canlı hücre boyama kullanarak hücrelerin yüzeyindeki proteinler görselleştirme sağlar. Odorant RTP1S hastabakıcı (B) tek başına reseptör Olfr62 (A) ve Olfr62, transfeksiyon Transfeksiyon. GFP ifade düzeyleri transfeksiyon kontrolü (A 've B') olarak hizmet vermektedir.

<ol><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65, 175-187 (1991).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96, 713-723 (1999).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119, 679-691 (2004).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).</li>
</ol>

Her adım, belirgin ve ayırt edici bir yüzey boyama sağlamak için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Tüm boyama işlemi soğuk (buz) yürütülen olmalıdır ve kapak fişleri hangi tepsiye serilir hücreleri hayatta kalmak sağlamak için kullanmadan önce soğutulması gerekir. Ayrıca fiksasyon yüzey boyama sürecinin sonunda yapılır. Bu fiksasyon birincil ve ikincil antikorlar hücre zarı permeabilize boyama önce iç boyası ile keskin bir kontrast. Hücreleri kurumasını önlemek için kapak fişleri havaya maruz kalma süresi en aza indiri...

<table><tbody><tr><td>Lamel 22 X 22 mm (#1)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>72200-11</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovin serum</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Minimal esansiyel besiyeri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4655</td><td>L glutamat, Earle&amp;rsquo; tuzu ve bikarbonat içerikli</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>EMS</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) 1X </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14025</td><td>Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içerikli</td></tr><tr><td>HEPES Tampon Çözeltisi</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>Kalsiyum ve magnezyum içermeyen</td></tr><tr><td>Poly D Lizin Hidrobromür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Azid</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0299-1</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü kabı 35 X 10 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td>0.05%</td></tr></tbody></table>

heterolog hücreler kimyasal-duyusal reseptörleri yüzey İfade assaying

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

Kokuları koku alma duygusunu canlı dünya tarafından kabul edilmektedir. Farelerde koku, uçucu odorant molekülleri bağlamak için öne ve G proteini Gαolf ile kaplin bir hücre içi sinyal ekstraselüler sinyal dönüştürme yaklaşık 1200 G Protein Coupled reseptörleri (GPCRs) 1 bir repertuar ile meydana gelir . Koku reseptörleri bağlayıcı, çeşitli reseptörler bir odorant bağlamak ve bir reseptör derece 2 değişen çeşitli koku bağlamak Kombinatoryal kural takip etmek düşünülmektedir. Biyokimyasal, sinyalizasyon ve ligand bağlanma çalışmaları uygun heterolog hücreleri kullanarak en GPCRs için yürütülen edilmiştir. Ancak, transfeksiyon yüzeye ihracat başarısız beri odorant reseptörlerinin çalışma için heterolog hücrelerinin uzun bir süre engellediği. Saito et al aile şaperonlar co birlikte 3 transfekte heterolog hücrelerinin yüzeyinde, trafik odorant reseptörleri şaperonlar olarak koku duyusal nöronlar ve hareket gelişmiş ifade Protein taşınması tek zarından geçişine Reseptör (RTP) göstermiştir. Reseptör hücre hattı sağlam yüzey ekspresyonu gösterir heterolog hücreleri kullanarak reseptörleri için biyokimyasal testleri yürütmek için bir ilk belirlemeniz gerekir. Bu canlı hücre floresan ekstrasellüler özel ekstrasellüler etki alanı veya bir etiket etiket boyama takip şaperon RTP1S reseptörleri eksprese tarafından test edilebilir. Burada odorant reseptörleri HEK293T hücrelerinin yüzeyinde rahatlıkla tespit etmek için kullanılan olabilir canlı hücre boyama yürütmek için bir protokol göstermektedir. Buna ek olarak, aynı zamanda, diğer kimyasal-duyusal reseptörleri veya GPCRs yüzey ekspresyonu tahlil için kullanılır.

Burada odorant reseptörleri HEK293T hücrelerinin yüzeyinde rahatlıkla tespit etmek için kullanılan olabilir canlı hücre boyama yürütmek için bir protokol göstermektedir. Buna ek olarak, aynı zamanda, diğer kimyasal-duyusal reseptörleri veya GPCRs yüzey ekspresyonu tahlil için kullanılır.

Heterolog Hücreler kimyasal-duyusal reseptörleri Yüzey İfade Assaying

Kokuların canlı dünyası, koku alma duyusu ile algılanır. Farelerde koku alma işlemi, yaklaşık 1200 G Proteini Kenetli Reseptörden oluşan bir repertuvar aracılığıyla gerçekleştirilir...

Bu prosedürün genel amacı, HEK 2 93 T hücrelerinde kemosensör reseptörlerin yüzey ekspresyonunun canlı hücre boyaması kullanılarak nasıl tespit edilebileceğini göstermektir; bu işlem öncelikle hücrelerin kültür kaplarındaki poli-D-lizine kaplı lamel üzerine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, HEK 2 93 T hücrelerine DNA transfeksiyonu yapmaktır. Prosedürün üçüncü adımı ise primer ve florofor konjuge ikincil antikorlar kullanarak canlı hücre boyamasını gerçekleştirmektir.Prosedürün son adımı, boyanmış hücrelerin tespit edilmesi ve lamellerin kapatılmasıdır. Nihayetinde, immünofloresan mikroskopi aracılığıyla hücre yüzeyindeki reseptörlerin lokalizasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, HK 2 93 T gibi heterolog hücrelerin hücre yüzeyine aktarılan kemosensoriyel reseptörleri tespit etmemizi sağlar. Bu yöntemin görsel bir gösterimi, hücrelerin kendi kendine boyanması için canlı tutulması amacıyla yakından takip edilmesi gereken temel adımları belirtecektir.Bu yöntemde yeni olan kişiler; lameli aktarma, taşıma ve yerleştirme gibi adımları zor bulabilirler. Ancak birkaç uygulama ile teknik kolaylaşmaktadır. cgen kolonu kullanan modifiye edilmiş bir protokol ile reseptörün ve reseptör taşıyıcı protein RT TP birinin plazma DNA'sını saflaştırın. Milyon ekspresyon vektörü PCI'da klonlanmış olan proteinin, immün boyama için reseptör kaplamasının hücrelerin yapışmasını kolaylaştırmak amacıyla 20 amino asit uzunluğunda bir epitop ile terminalden etiketlendiğinden emin olun.Cam lamelleri mililitre başına bir miligram poli-L-lizin ile kaplayın. Lamelleri, kaplı tarafı yukarı bakacak şekilde 35 milimetrelik hücre kültür kaplarına yerleştirin ve steril laminar akış kabini içinde havayla kurumaya bırakın. HTK 2 9 3 T hücrelerini, lamel ile hücre kültür kabı arasında hava kabarcığı kalmadığından emin olarak, bir mililitre M 10 besiyerinde yaklaşık %30 yoğunlukta ekin. 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 18 ila 24 saat inkübe edin. Her bir transfeksiyon için 1000 nanogram reseptör konstrüktü, 250 nanogram RTP1s konstrüktü ve 50 nanogram GFP konstrüktünden oluşan bir DNA karışımı hazırlayın.Üretici talimatlarına uygun olarak, hücreleri lipectomy 2000 ile transfekte edin. M 10'a sodyum azid ve hippies ekleyerek boyama medyasını hazırlayın. Bu medya, dört derece Celsius'ta birkaç ay boyunca saklanabilir.Ardından, 15 millimolar sodyum azid ve 10 millimolar heis içeren yıkama tamponunu hazırlayın. Yıkama tamponu, soğuk HBSS içinde dört derece Celsius'ta birkaç ay boyunca saklanabilir. Boyamayı soğuk zincirde gerçekleştirmek için bir tepsiyi parfümlü hazırlayın ve beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin.Transfekte edilmiş hücreleri içeren lamelleri, hücre tarafı yukarı gelecek şekilde paraforme aktarın. Lamelin köşesinden başlayarak, boyama medyumunda seyreltilmiş 100 µL soğuk primer antikoru dikkatlice ekleyin. Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, orijinal 35 mm'lik kültür kaplarındaki hücreleri, soğuk yıkama solüsyonunu sırayla ekleyip aspire ederek yıkayın.İşlemi iki kez tekrarlayın. Benzer şekilde, SI üç konjuge ikincil antikoru 30 dakika boyunca inkübe edin. 35 milimetrelik kaplarda üç kez yıkama işlemi gerçekleştirin.Son olarak, hücreleri soğutulmuş %1 paraformaldehit çözeltisi ile sabitleyin. Tüm hava kabarcıklarının dışarıda bırakılmasına dikkat edin. Lamel yüzeyindeki tuz birikintilerini gidermek için lamellerin yüzeyini distile su ile durulayın ve lamelleri, hücreli yüzeyleri aşağı gelecek şekilde mikroskop lamlarına monte edin.Genellikle, OL FFR 62 ve RTP'lerde olduğu gibi, reseptörlerin hücre yüzeyi boyaması, konjuge antikorun floresan sinyalinin noktasal görünümü ile karakterize edilir. Uzmanlaşıldığında bu teknik, 32-40 lamelin boyanması için sadece iki buçuk ila üç saat kadar kısa bir sürede kullanılabilir. Bu prosedür birden fazla lamel ile uygulanırken, hücrelerin kurumasını önlemek için antikor inkübasyonunu her seferinde bir lamel şeklinde transfer etmek ve başlatmak önemlidir.

assaying-surface-expression-chemosensory-receptors-heterologous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaynak: de March, C. A. et. al., Buhar Fazındaki Bir Koku Maddesi Tarafından Koku Reseptörü Aktivasyonunun Gerçek Zamanlı İn Vitro İzlenmesi. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, lüminesans ölçümü kullanarak rekombinant memeli hücrelerinde koku reseptörlerinin gerçek zamanlı aktivasyonunu izleme yöntemini göstermektedir. Koku bağlanması, G-protein aktivasyonunu ve cAMP üretimini tetikler, substrat bağlanması üzerine ışıldama yayan glosensör proteinlerini aktive eder ve reseptör yanıtının kantitatif bir...

Rekombinant hücrelerde koku reseptörü aktivasyonunun gerçek zamanlı izlenmesi

Adenilat siklaz sinyal duyarlanmasına inhibitör G protein-eşli reseptörler sonuçları Kalıcı aktivasyonu. Temel moleküler yolları belirlemek için, nonbiased yaklaşımlar gereklidir, ancak bu strateji ölçeklenebilir hücre bazlı cAMP hassaslaşması testin geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, küçük molekül ve siRNA taranması için olan bir hassaslaşma deneyi tarif eder.

Adenilat siklaz uyuşturucu kaynaklı Sensitizasyonu: Küçük Molekül ve siRNA Tarama Uygulamaları için Deney düzene ve minyatür

Koku reseptör aktivasyonu desenler koku kimliğini kodlamak, ancak memeli koku reseptörleri için Odorant ligandlar belirlenmesi yayınlanan verilerin eksikliği koku kodlama kapsamlı bir modelinin gelişmesini engellemektedir. Bu protokol, koku reseptör ligandları ve reseptör aktivasyonunun miktar yüksek throughput belirlenmesini kolaylaştırmak için bir yöntem tarif etmektedir.

Lusiferaz aktivitesi ile reseptör aktivasyonunun bir ölçümü: Memeli Koku reseptörünün yüksek throughput Analizi

Işlev propil reseptörlerinin karakterize vazgeçilmez bir parçası deorphanization süreç içinde hizmet vermektedir. Biz gerçek zamanlı bir kamp tahlil kullanarak propil reseptörleri aktivasyonu ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Canlı hücre ölçüm propil reseptörü harekete geçirmek kullanımı gerçek zamanlı bir kamp tahlil

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Fizyolojik açıdan, propil reseptörleri buharı aşamasında inhale propil moleküller tarafından etkinleştirilir. Ancak, en tüp bebek sistemleri sıvı faz propil stimülasyon yararlanmak. Burada, propil reseptör etkinleştirme propil stimülasyon buharı faz üzerine gerçek zamanlı tüp bebek izleme sağlayan bir yöntem mevcut.

Gerçek zamanlı olarak buharı aşamasında propil reseptör etkinleştirme bir propil tarafından in Vitro izlenmesi

Bu makalede, ayrılmış primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptörü (GluR) kaçakçılığı çalışması için bir yöntem sunulur. Endojen veya aşırı ifade reseptörlerinin farmakolojik yaklaşımlar ile birlikte etiketlenmesi için antikor beslemeli bir yaklaşım kullanarak, bu yöntem, GluR yüzey ifadesini düzenleyen moleküler mekanizmaların belirlenmesi için izin verir veya geri dönüşüm süreçleri.

Disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı

Burada, floresan mikroskopisi kullanarak heterolog bir hücre sisteminde transta ligand-reseptör etkileşimlerini hızlı ve yarı niteliksel olarak ölçmek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Heterolog Hücre Sisteminde Protein Toplama Yoluyla Hücrelerarası Etkileşimlerin Ölçülmesi

Makale, sivrisinek anteni ve maksiller palptaki kemosensoriyel reseptör genlerinin uzamsal ve hücresel çözünürlüğüne ilişkin içgörüleri ortaya çıkarmak için hibridizasyon zincir reaksiyonu RNA tam montajlı floresan in situ hibridizasyon (HCR, RNA, WM-FISH) gerçekleştirmek için gerekli yöntemleri ve reaktifleri açıklamaktadır.

Hibridizasyon Zincir Reaksiyonu RNA Tam Montajlı Floresan Sivrisinek Koku Alma Eklerinde Kemosensoriyel Genlerin In situ Hibridizasyonu,

Bu protokol, memeli Neuro-2a hücre hattı kullanılarak nöronal nikotinik asetilkolin reseptör alt birimlerinin ifadesi ve nicelendirilmesini açıklar. pH duyarlı floresan etiketler ve konfokal mikroskopi, plazma membranındaki reseptör lokalizasyonunun pH-nötr hücre içi bölmelerdeki ekspresyonlarla karşılaştırıldığında hassas bir şekilde değerlendirilmesini sağlar; bu da nAChR taşığı ve farmakolojik modülasyonun incelenmesini kolaylaştırır.

Memeli Hücrelerinde Nicel Görüntüleme Kullanılarak Plazma Zarı ve Hücre İçi Nikotinik Asetilkolin Reseptörlerinin Lokalizasyonu

Öğrenin, HEK293T hücrelerinde canlı hücre boyama ile kimyasal-duyusal reseptörlerin yüzey ifadesini nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, GPCR'ler ve diğer reseptörler için uyarlanabilir.

Heterolog Hücreler kimyasal-duyusal reseptörleri Yüzey İfade Assaying

Daha fazla video keşfet