Name: Micropatterned Yüzeyler Kanser Hücreleri ile Hyaluronik Asit Etkileşimleri Eğitim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Öğrenin, mikrodesenli yüzeyler ve karbodiimid kimyası kullanarak kanser hücrelerinin hiyaluronik asit ile etkileşimlerini yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleriyle analiz etme yöntemini. Bu yaklaşım tümör biyolojisi ve tedavi stratejileri için önemli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Ulusal Bilim Vakfı aracılığıyla Malzeme Araştırma Bilimi ve Mühendisliği Merkezi parçası olarak finanse, Johns Hopkins, yüzey analizi laboratuvarı kullanımı kabul etmiş sayılırsınız. LED IGERT stajyer ve Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Üyesi. Bu araştırma, kısmen, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe U54CA143868 tarafından desteklenen oldu.

1. Micropatterned Damga Fabrikasyon Standart Fotolitografi <ol><li> Etanol ile yeni bir silikon yonga hava akışı ile durulayın ve kurulayın. Gofret ele almak ve tüm süreç boyunca yüzey hasarları önlemek için forseps kullanın. </li><li> Lak spin ve SU-2025 negatif fotorezist gofret yüzeyini kaplayan gofret aktarın. Paslanmaz çeliğin en az% 80 gofret örtün. 3000rpm 30 saniye takip 600rpm az 10 saniye süreyle Spin kat. Fotorezist fotosensitivite nedeniyle, bu noktadan itibaren oda ışıkları kapatın. </li><li> 95 ° C'de 3 dakika boyunca "yumuşak fırında" sıcak levha kaplamalı silikon gofret fotorezist aktarın. Sıcak levha çıkar ve 1 dakika soğumasını bekleyin. </li><li> Fotorezist kaplı silikon gofret üstüne istenilen desen prefabriklerin maske koyun ve 20 saniye için ultraviyole (UV) ışınları (350-450 nm) maruz bırakmayın. </li><li> Sıcak levha "sabit fırında" için 110 ° C 6 dakika Transfer silikon gofret. </li><li> Işıkları açın ve sıcak plaka gofret kaldırmak. Farklı desenleri bu noktada görünür olmalıdır. </li><li> SU-8 fotorezist geliştirici ile silikon gofret dikkatlice yıkayın. 3 geliştirici çözümü ile çalkalama sonra, etanol ile yıkayın. Herhangi bir beyaz kalıntı varsa, paslanmaz çeliğin geliştirici çözümü ile durulayın tekrar, ya da sadece batığın gofret geliştirici çözüm ve 2 dakika süreyle yıkayın etanol ile tekrar devam edebilir. Su ve kuru hava ile yıkayın. </li><li> Mix polidimetilsiloksan (PDMS) 10:1 ağırlık oranı elastomer çözüm ve sertleştirici. Hava kabarcıklarını çıkarmak için 5 dakika için 900 RPM santrifüjleyin. </li><li> Place Petri kabındaki gofret desenli PDMS ve silikon yonga üzerine dökün. Birkaç dakika için mevcut kabarcıkları, desicator yer ve vakum varsa kabarcıkları kayboluncaya kadar. </li><li> Tamamlayıcı bir elastomerik damgası oluşturmak için oda sıcaklığında (RT) bir gecede kurtulun. PDMS tamamen 60 ° C'de 30 dakika fırında, yerde 12 saat, sonra tedavi değil ise. </li><li> Dikkatle silikon gofret PDMS çıkarın. Istediğiniz boyuta damga kesmek için bıçak kenar kullanın. 15 dakika boyunca etanol içinde sonikasyon. Gofret yeni elastomerik pullar oluşturmak için birden fazla kez kullanılabilir. </li></ol> 2. HA Micropatterning <ol><li> Plazma temiz bir cam, 5 dakika boyunca slaytlar. 5 dakika boyunca oda ve vakum tüm slaytlara yerleştirin. Sonra odasına girmek için düşük oksijen akışına izin verir. 5 dakika boyunca plazma temizleyici açın. Plazma temizleyici ve forseps kullanarak bir Petri kabındaki yerden çıkarın. </li><li> Plazma temizlik sırasında, 15 dakika boyunca etanol PDMS pulları sonikasyon. </li><li> 15 ml santrifüj tüpüne% 95 v / v etanol 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) taze% 3 v / v çözüm hazırlayın. Tepki silanolle formu RT az 5 dakika izin ver. </li><li> Yeri PDMS damga dönmeye coater Chuck desen ve kapak yüzeyi desenli APTMS çözüm. 30 saniye için 3500 Spincoat. PDMS damga, sadece iki tarafın damga yüzeyine dokunmayın. </li><li> Desenli yan bir ucunu aşağı bakacak şekilde set mühür ve 1 dakika için cam yüzeyi ile temas halinde tamamen yavaşça PDMS basarak kayma: Transfer plazma APTMS çözüm cam yüzeyler temizlenmelidir. </li><li> PDMS hafifçe damga çıkarın ve buzlu cam slayt RT 30 dakika boyunca inkübe izin. Desenli yüzeyler etanol ve kuru hava ile durulayın. Sonikasyon PDMS aşırı APTMS kaldırmak için 15 dakika boyunca damgası. </li><li> 115 1 saat fırında veya sıcak plaka üzerinde Isı yüzeyler ° C Etanol ile çalkalayın ve kuru hava ile. </li><li> [Metoksi (polyethyleneoxy) propil] toluende trimethoxysilane - taze polietilen glikol (PEG) silan% 20 v / v 2 çözüm hazırlayın. Bu desen çevreleyen yapışkan olmayan bir bölge olarak hizmet verecek. </li><li> 75 az 45 dakika boyunca bir bardak PEG-silan çözüm Petri kabı ve inkübe Transfer buzlu cam slayt ° C sıcak bir plaka. Toluen, su ve hava ile kuru ile durulayın. </li><li> Biyolojik güvenlik kabini UV antiseptik ışınlama kullanarak 1 saat süreyle sterilize edin. Biyolojik güvenlik kabini kısırlık korumak için bu noktadan devam edin. </li><li> Sulu steril HA çözeltisi hazırlayın. 1-Etil-3-(3-Gaz sistemlerinde) carbodiimide (EDC), 10mM N-hydroxysuccinimide, 5mM 50μg / ml flöresein etiketli HA </li><li> Steril koşullar HA çözüm buzlu cam yüzeye uygulayın ve ışıktan korunmalıdır. Desenli yüzeylerde 16-24 saat boyunca rahatsız olmalıdır. </li><li> HA kapalı aspire çözüm, bol suyla yıkayın fosfat tamponlu salin (PBS), ve 1 saat süreyle PBS (BSA)% 1 sığır serum albümini ile yüzeyini kaplayacak. Yüzeyi hücre kültürü için hazırdır. </li></ol> 3. HA Micropatterned Yüzeylerde Hücre Kültürü <ol><li> Expand MDA-MB-231 üreticinin talimatlarına göre insan meme kanseri hücreleri ve LS174T kolorektal karsinom hücreleri. </li><li> 0.4 ve 1x10 arasındaki yoğunlukları ile kanser hücrelerinin Tohum tek hücre süspansiyonları 2 cam yüzey alanı başına ve HA üzerine yüzeyler immobilize. % 5 CO 2 ile korunur ortamlarda nemlendirilmiş inkübatör (37 ° C) inkübe edin. Hücre adezyon 24 saat içinde ortaya çıkar ve ters ışık mikroskobu kullanılarak görülebilir </li><li> Hücre kültürü yüzeyleri standart inkübatör koşullarında 5 gün kadar muhafaza edilebilir. Her gün medya değiştirin. Hücre morfolojisi ve büyüme ters ışık mikroskobu kullanılarak görülebilir. Ek hücre deneyleri HA yüzeye yanıtları analiz etmek için uygulanabilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Kovalent APTMS buzlu cam slaytlara HA hareketsiz kullanılan carbodiimide kimya Şekil 1A gösterilmiştir. EDC HA karboksil grupları ile reaksiyona girer amin-reaktif ara oluşturmak için sıfır uzunlukta bir çapraz bağlanma ajandır. Bu ara hidroliz duyarlı olarak, NHS carbodiimide reaksiyon verimi artırmak için eklenir. HA çözüm APTMS micropatterns, HA ATPMS, orta ve primer amin arasında istikrarlı bir amid bağı formları ile etkileşim. HA desenli yüzeyinin bir örnek gösterilmiştir (Şekil 1B-C) bir floresan mikroskop ve bir ImageJ floresan analizi kullanarak HA desenli immobilizasyon göstermek görüntülendi. HA micropatterned yüzeyler expgenous HA ile kanser hücre etkileşimleri çalışma sağlar. Her ikisi de MDA-MB-231 insan meme ve LS174t insan kolon kanseri hücre dizilerinde tercihen HA micropatterned bölgeleri (Şekil 2) için uygun. Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak yüksek çözünürlüklü görüntüleme HA hareketsiz yüzeyler (Şekil 3) ile kültür hücreleri etkileşimlerini analiz etmek için kullanılabilir. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 HA micropatterned yüzeyler anlatan HA fonksiyonel yüzeyler geliştirme (A) Şematik, (B) floresein floresan (yeşil) etiketli HA micropatterned yüzey. (C) 3D piksel dağılım haritası ayrık HA desen gösteren ImageJ yazılımı kullanarak. Ölçek çubuğu = 100μm. Elsevier izin 9 - Modifiye. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 HA micropatterned yüzeylerde Kanser hücre adezyon. Kolon (A) ve meme Her ikisi de (B) karsinom tercihen 24 saat kültür ile HA yamaları üzerine yapıştırılır. Elsevier izin 9 - Modifiye. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 HA ile Kanser hücrelerinin etkileşimi. (A), kolon kanseri hücrelerinin HA yüzeylerde düşük büyütme (solda) ve yüksek büyütmede (sağ, sol tarafta kareler) gösterilen (A) kültürlü elektron mikroskobu görüntüleri, meme kanseri hücrelerinin Tarama ve (B) gösterilen HA yüzeylerinin kültüre düşük büyütme (solda) ve yüksek büyütmede (sağ, sol tarafta kareler).

<ol><li>Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-cell+interactions+in+cancer+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).</li>
<li>Hamilton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hyaluronan+Receptors+CD44+and+Rhamm+%28CD168%29+Form+Complexes+with+ERK1%2C2+That+Sustain+High+Basal+Motility+in+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).</li>
<li>Götte, M., Yip, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparanase%2C+Hyaluronan%2C+and+CD44+in+Cancers%3A+A+Breast+Carcinoma+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective.</a> Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).</li>
<li>Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+adsorption+on+derivatives+of+hyaluronic+acid+and+subsequent+cellular+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).</li>
<li>Barbucci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+hyaluronic+acid+by+sulphate+groups+insertion+to+obtain+a+heparin-like+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Gazz.+Chim.+Ital%22%5BJournal%5D)">Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule.</a> Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).</li>
<li>Morra, M., Cassinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fouling+properties+of+polysaccharide-coated+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterials+Science%2C+Polymer+Edition%22%5BJournal%5D)">Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).</li>
<li>Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer+deposition+of+hyaluronic+acid+and+poly-L-lysine+for+patterned+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures.</a> Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).</li>
<li>Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface-tethered+model+to+assess+size-specific+effects+of+hyaluronan+%28HA%29+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells.</a> Biomaterials. 28, 825-835 (2007).</li>
<li>Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+surfaces+for+high-resolution+analysis+of+cancer+cell+interactions+on+exogenous+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).</li>
<li>Gao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+oligosaccharides+promote+excisional+wound+healing+through+enhanced+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis.</a> Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).</li>
<li>Slevin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-mediated+angiogenesis+in+vascular+disease%3A+Uncovering+RHAMM+and+CD44+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways.</a> Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).</li>
</ol>

Izni ile çoğaltılabilir video şematik figür; Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co. KGaA. Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. biyomateryalleri kullanılarak embriyonik kök hücrelerinin farklılaşması niş Yeniden. Macromol. Biosci. 2010; Oct 21. [Epub ahead of print].

Ekzojen HA HA micropatterning yöntemi ile hücre etkileşimleri çalışma sağlar. HA 1 kanserinin ilerlemesini önemli bir rol oynadığı bilinmektedir ancak iki boyutlu HA desenli yüzeyler üzerinde kanser hücrelerinin etkileşimi araştıran sınırlı sayıda çalışma yapılmış ve yapılmaktadır . Ekzojen HA micropatterns denetlenebilir bir çalışmada, kanser hücre adezyon, büyüme, göç ve yüksek çözünürlüklü görselleştirme sağlar ve kanser daha fazla temellerini aydınlatmak olabilir. Carbodiimide...

<table><tbody><tr><td>SU-2025 fotoresist</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 geliştirici</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropiltrimetoksisilan (APTMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>2- [metoksi(polietilenoksi) propil] trimetoksisilan (Peg-silane)</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIM6492.7</td><td></td></tr><tr><td>1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodimid</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroksisüksinimid (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>Floresein işaretli hiyalüronik asit (FL-HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1177</td><td>10ml DI su ile yeniden çözün</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 meme karsinomu hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>LS174t kolon karsinomu hücreleri</td><td>ATCC</td><td>Cl-188</td><td></td></tr></tbody></table>

micropatterned yüzeyler kanser hücreleri ile hyaluronik asit etkileşimleri eğitim

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Kanser işgali ve ilerlemesi tümör mikroçevresinin içinde büyüme faktörleri / sitokinler ve hücre dışı matriks (ECM) bileşenleri karmaşık düzenleme altında bir hareketli hücre fenotipi içerir. Hyaluronik asit (HA), artırılması işgali, büyüme ve anjiyogenez 1 tümör ilerlemesini kolaylaştırmak için bilinen bir stromal ECM bileşeni . Etkileşim HA hücre yüzey reseptörü CD44, tümör hücre büyümesini, hayatta kalma ve göç teşvik olaylar böylece metastatik yayılmasını 2-3 artan sinyalizasyon neden olur. HA, D-glukuronik asit ve DN-asetilglukozamin birimleri tekrar oluşan bir anyonik, nonsulfated glikozaminoglikan. Tekrarlayan disakkarit ünitelerinde karboksil ve hidroksil grupları, varlığı nedeniyle doğal HA büyük ölçüde hidrofilik ve sülfat photoreative immobilizasyon 4-5 grupları tanıtmak kimyasal değişiklikler için uygun. Önceki çalışmalar yüzeyler üzerine HA immobilizations içeren 6-7 yüzeylerinden hücre yapışmasını kontrol etmek HA bioresistant davranış ve sülfatlanmış türevi kullanmaktadır. Tercihen bu çalışmalar hücre adezyon-HA olmayan desenli bölgelerde oluşur. Ekzojen HA ile hücresel etkileşimleri analiz etmek, kontrol edilebilir bir çalışma ve HA ile kanser hücre etkileşimleri yüksek çözünürlüklü görselleştirme sağlayan desenli Fonksiyonlu yüzeyler geliştirdiler. Biz cam yüzeyler üzerinde HA ayrık desenli bölgeleri tanımlamak için kullanılan microcontact baskı (UCP). HA hareketsiz carbodiimide bağlayan kimya uygulanan &quot;bağlama&quot; yaklaşımı 8 kullanıldı. Cam yüzeyler microcontact aminosilane ile basıldı ve EDC ve NHS desenli dizileri HA immobilizasyon sağlamak için optimize edilmiş oranları HA çözüm tepki gösterdi. Carbodiimide kimya MCP ile ekleme in vitro uygulamaları için uygun yüzeyler oluşturmak, tanımlanmış bölgelere HA immobilizasyon etkin. Her iki kolon kanseri hücreleri ve meme kanseri hücrelerinin dolaylı HA micropatterned yüzeyler ile etkileşim. Kanser hücre adezyon proliferasyonu ile 24 saat içinde 48 saat oluştu. HA micropatterned yüzeyler kullanarak, kanser hücre adezyon HA reseptörü CD44 üzerinden gerçekleşir gösterdi. Ayrıca, HA desenli yüzeyler, tarama elektron mikroskobu (SEM) ve kanser hücresi yapışkan çıkıntılar izin verilen yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve kanser hücre hareketi analiz etmek için ekzojen HA HA desen yayılan ile uyumlu idi.

Eksojen hyaluronik asit (HA) ile yüksek çözünürlüklü kanser hücre etkileşimleri analiz olanak sağlayan yeni bir yaklaşım açıklanmıştır. Desenli yüzeyleri carbodiimide kimya ve microcontact baskı birleştirerek imal edilir.

Micropatterned Yüzeyler Kanser Hücreleri ile Hyaluronik Asit Etkileşimleri Eğitim

Kanser invazyonu ve progresyonu, büyüme faktörleri/sitokinler ve hücre dışı matris tarafından karmaşık bir şekilde düzenlenen motil bir hücre fenotipini içerir...

Kanser invazyonu ve progresyonu, tümör mikroçevresindeki büyüme faktörleri, sitokinler ve hücre dışı matris bileşenleri tarafından karmaşık bir şekilde düzenlenen modal bir hücre fenotipi içerir. Hyalüronik asit (HA), hücre yüzeyi reseptörü CD 44 ile etkileşimi yoluyla invazyon büyümesini ve anjiyogenezi artırarak tümör progresyonunu kolaylaştırdığı bilinen bir stromal hücre dışı matris bileşenidir. CD 44, tümör hücresi büyümesini, sağkalımını ve migrasyonunu teşvik eden sinyalizasyon olaylarını tetikler ve böylece metastatik yayılımı artırır; bu çalışma, ekzojen HA üzerindeki kanser hücresi adhezyonunu, migrasyonunu ve büyümesini incelemek amacıyla yapılmıştır.Mikro desenli elastomerik bir damga üretmek için standart fotolitografi kullanılır; bu damga daha sonra cam altlıklar üzerinde amino silan moleküllerinden oluşan desenli bir dizi oluşturmak için kullanılır. Ardından, HA'yı mikro desenli amino silana kovalent olarak bağlamak için karbodiimid kimyası uygulanır. Böylece HA mikro desenleri oluşturulur; kültürlenmiş kanser hücreleri bu HA mikro desenleri üzerine ekilebilir ve kanser hücrelerinin ekzojen hyaluronik asit ile etkileşimleri ışık mikroskobu, taramalı elektron mikroskobu veya immünofloresan mikroskobu gibi yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri kullanılarak görselleştirilebilir.Bu video makalesinde sunulan mikro desenli HA yüzeyleri oluşturma yöntemi, kanserde ekzojen hyaluronik asidin rolünün daha detaylı açıklanması gibi, kanser araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Cam lamların HA ile baskılanmasında kullanılacak olan mikro desenli Polimetil Zane veya PDMS damgayı hazırlamak için, yeni bir silikon gofretini cımbızla tutarak başlayın.Ardından laboratuvar evyesinin üzerine yerleştirin. Gofretle ethanol ile durulamak için bir yıkama şişesi kullanın ve bir hava akımı ile kurulayın. Oda ışıklarını kapatın.Ardından, pens kullanarak gofreti bir spin kaplayıcıya aktarın; bir transfer pipeti kullanarak gofret yüzeyinin en az %80'ini SU 2025 negatif fotoresist ile kaplayın; 600 RPM'de 10 saniye boyunca spin kaplama yapın. Ardından, 3000 RPM'de 30 saniye boyunca işlem uygulayın; fotoresist kaplı gofreti bir sıcak plakaya aktarın ve 95 °C'de üç dakika boyunca soft bake işlemi yapın. Daha sonra gofreti sıcak plakadan alın ve bir dakika boyunca soğumasını bekleyin.İstenen desene sahip önceden hazırlanmış bir maskeyi, fotoresist kaplı waferın üzerine yerleştirin ve 20 saniye boyunca UV ışınlaması yapın. Ardından, waferı bir sıcak plakaya aktarın ve 110 °C sıcaklıkta altı dakika boyunca sert pişirme (hard bake) işlemi uygulayın.Işıkları açın ve wafer'ı ısıtıcı plakadan çıkarın. Bu aşamada, transfer pipeti kullanılarak belirgin desenler görülmelidir. Wafer'ı SU eight fotoresist geliştirici ile dikkatlice durulayın; geliştirici çözelti ile üç kez durulamanın ardından etanol ile durulama yapın.Eğer herhangi bir beyaz kalıntı mevcutsa, fotoresist geliştirici solüsyonla durulama işlemini tekrarlayın veya wafer'ı iki dakika boyunca geliştirici solüsyonda bekletip tekrar etanolle durulayın, suyla yıkayın ve geniş bir whey teknesinde hava akımıyla kurulayın. Burada gösterilen wafer için PDMS elastomer solüsyonu ve kürleme ajanını 10'a bir ağırlık oranında karıştırın; 22 gram yeterlidir. Bir santrifüj tüpüne boşaltın ve beş dakika boyunca 900 RPM hızda döndürün.Hava kabarcıklarını gidermek için desenli gofretle uygun boyutta bir Petri kabına yerleştirin. Gofretin üzerine, yaklaşık çeyrek inç kalınlığında olacak şekilde, gofreti tamamen kaplayacak miktarda PDMS çözeltisi dökün. Gofret yüzeyinde herhangi bir kabarcık varsa, kabarcıklar kaybolana kadar vakumlu desikatöre yerleştirin.Tamamlayıcı bir elastomerik damga oluşturmak için oda sıcaklığında bir gece boyunca kürleyin. PDMS 12 saat sonra tamamen kürlenmemişse, wafer'ı 60 °C'deki bir fırında 30 dakika bekletin. PDMS'i wafer'dan dikkatlice ayırın.Ardından, bir jilet kullanarak damgayı istenen boyutta kesin. Damgayı, tercihen plastik bir tutucu içinde, etanol içeren cam bir behere yerleştirin ve 15 dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Cam yüzeyler üzerinde tanımlanmış yamalar halinde ha'yı kovalent olarak immobilize etmek için yeni elastomerik damgalar oluşturmak amacıyla gofretler birden çok kez kullanılabilir.Eşlik eden metindeki talimatlara uygun olarak, kullanılacak tüm lamları plazma temizleyicide temizleyerek başlayın. Cam lamlar temizlendikten sonra, onları plazma temizleyiciden çıkarmak için cımbız kullanın. Lamları plastik bir petri kabına yerleştirin ve daha sonra kullanmak üzere kenara ayırın.Ardından, HA'yı bağlamak için lam üzerine damlatılacak amino silan çözeltisini 15 mililitrelik polistiren santrifüj tüpünde hazırlayın. 95% hacim/hacim etanol içerisinde, toplam hacmi beş mililitre olacak şekilde, taze %3 hacim/hacim oranında üç amino propil trimetoksisilan veya A-P-T-M-S çözeltisi hazırlayın; çözeltinin oda sıcaklığında beş dakika boyunca reaksiyona girmesini bekleyin.Bu süre zarfında, A-P-T-M-S hidroliz yoluyla bir silanole dönüştürülür. Ardından, yalnızca kenarlarından tutarak PDMS damga desenini yukarı bakacak şekilde bir spin kaplayıcı tablasına yerleştirin. Desen yüzeyini A-P-T-M-S ile kaplamak için bir transfer pipeti kullanın.Ardından, damga yüzeyini 3.500 RPM'de 30 saniye boyunca A-P-T-M-S ile spin kaplayın. PDMS damgayı spin kaplama cihazından çıkardıktan sonra, desenli tarafı aşağı bakacak şekilde ters çevirin, PDMS damganın bir ucunu cam lamelin merkezine yerleştirin ve tüm damganın cam lamel ile temas etmesini sağlamak için bir dakika boyunca hafifçe bastırın. Sonra, PDMS damgayı nazikçe kaldırın ve A-P-T-M-S desenli cam lamelin oda sıcaklığında beklemesini sağlayın.30 dakika sonra, desen yüzeyini etanol ile durulayın ve hava akımıyla kurulayın. Fazla A-P-T-M-S'yi uzaklaştırmak için PDMS damgasını 15 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Ardından, yüzeyleri ısıtmak ve fazla suyu uzaklaştırmak için slaytları bir saat boyunca 115 °C'deki bir ısıtıcı tabla üzerine yerleştirin.Ethanol ile durulayın ve cımbız kullanarak hava ile kurutun. Desenli lamı cam bir petri kabına aktarın. Bir transfer pipeti kullanarak, desenlerin etrafında yapışmaz bir bölge oluşturacak şekilde cam lamın tamamını yeni hazırlanmış polietilen glikol veya PEG cline çözeltisi ile kaplayın.75 °C'de 45 dakikalık inkübasyonun ardından, fazla peg salin çözeltisini dökün. Daha sonra cam lamı cımbızla tutarak, desenli cam lamların yüzeyini önce toluenle, ardından tekrar suyla durulayın ve hava akımıyla kurutun. Lamları nemlendirilmiş bir lam kutusuna yerleştirin.Ardından kutuyu biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin ve germisid ışınlama yapmak için UV lambasını bir saat boyunca açık tutun. Bu noktadan itibaren işlemlere biyolojik güvenlik kabini içerisinde devam edin. Kabin dışında steriliteyi korumak için, 10 millimolar konsantrasyonda bir mililitre steril sulu HA çözeltisi hazırlayın.5 mM 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodimid (EDC) ve 50 µg/mL hidroksi-CIN aide kullanılmıştır. Steril floresein işaretli HA EDC, HA karboksil gruplarıyla reaksiyona girerek amin reaktif ara ürünler oluşturan sıfır uzunluklu bir çapraz bağlama ajanıdır. Bu ara ürün hidrolize yatkın olduğundan, karbodimid reaksiyon verimliliğini artırmak için NHS eklenir.Ardından, desenli alan tamamen kaplanana kadar desenli cama 200 µL'lik steril HA çözeltisi alikotları uygulayın. Ardından, lamları ışıktan korumak için lam kutusunu kapatın. HA çözeltisi mikro desenli A-P-T-M-S ile etkileşime girip HA ara madde ile A-P-T-M-S'nin birincil amin arasında stabil bir MI bağı oluşurken, desenli substratlar çeker ocak altında 16 ila 24 saat boyunca rahatsız edilmeden bırakılmalıdır.Ertesi gün, HA çözeltisini aspire etmek için APA transfer pipeti kullanın. Lamları PBS ile yıkayın, ardından yüzeyi bir saat boyunca PBS içinde %1 BSA ile kaplayın. Yüzey artık hücre kültürü için hazırdır.HA mikrodesenli yüzeylerde kültürleme yapmak için HA mikrodesenli yüzeyleri steril bir petri kabına yerleştirin. Cam yüzeyin 18,75 santimetrekaresine, 1 mL hücre besiyeri içerisinde 0,4 ile 1 x 10⁶ kanser hücresi arasındaki yoğunluklarda, kanser hücrelerinin tek hücre süspansiyonlarını ekerek cam lamın yüzeyini kaplayın. Hücreleri dikkatlice 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Besiyerinin dökülmemesine dikkat ederek, hücre adezyonunun 24 saat içinde gerçekleşmesini bekleyin; bu durum ters ışık mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir.Hücre kültürü yüzeyleri beş güne kadar korunabilir. Standart inkübatör koşullarında medyayı gün aşırı değiştirin. Hücre morfolojisi ve büyümesi, ters ışık mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir.Ardından, burada gösterilen örnekteki HA yüzeyine verilen yanıtları analiz etmek için ek hücresel analizler uygulanabilir. Floresan mikroskop ve görüntü kullanılarak görselleştirilmiş HA desenli yüzey. J floresans yoğunluğu analizi, ha'nın desen mobilizasyonunu kanıtlamaktadır.HA mikro desenli yüzeyler, kanser hücrelerinin eksojen HA ile olan etkileşimlerinin incelenmesine olanak sağlar. HA mikro desenli yüzeylerdeki kanser hücresi adezyonu burada gösterilmiştir. Hem kolon hem de meme karsinomu hücreleri, 24 saatlik kültür süresinin ardından tercihen HA yamalarına tutunmuştur. Kültürlenen hücrelerin HA immobilize yüzeylerle olan etkileşimlerini analiz etmek için taramalı elektron mikroskopisi kullanılarak yüksek çözünürlüklü görüntüleme yapılabilir.Bu taramalı elektron mikrografında, kolon kanseri hücrelerinin HA ile etkileşimi görülebilmektedir; sağ tarafta daha yüksek büyütme gösterilmiştir. HA yüzeylerde kültüre edilen meme kanseri hücreleri burada tekrar gösterilmiştir, sağ tarafta yine daha yüksek büyütme yer almaktadır. Bu analiz, kanser hücrelerinin HA mikro desenler üzerindeki yayılımını artıran yapışkan çıkıntıların varlığını açıkça ortaya koymaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, HA mikro desen servislerinin nasıl hazırlanacağı ve kanser hücresi yanıtını incelemek için bunların nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

micropatterned-surfaces-to-study-hyaluronic-acid-interactions-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hücresel mimarili normale Yapıştırıcı micropatterns, ilaç etkileri algılama duyarlılığını artırmak, tekrarlanabilirlik geliştirmek ve otomatik görüntü elde edilmesi ve analizi basitleştirmek için kullanılabilir. Bu teknoloji, geleneksel hücre kültürleri destekleyen üzerinde gerçekleştirilen ve dolayısıyla aşırı hücre-hücre değişkenlik muzdarip ilaç / siRNA tarama testleri, fayda sağlayacaktır.

İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz

Biz bir sıvı lipid iki katmanının çevrili nanometrik protein yamaları ile cam fonksiyonel hale getirilmesi için bir protokol mevcut. Bu alt tabakalar gelişmiş optik mikroskop ile uyumludur ve hücre yapışması ve göç çalışmaları için platform olarak hizmet etmesi beklenmektedir.

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Dendrimer tabanlı yerel arginin-glisin-aspartik asit (RGD) yüzey yoğunluğu Nano yönetilsin düzensiz nanopatterns elde etmek için bir yöntem açıklanan ve hücre adezyon ve chondrogenic farklılaşması çalışma için uygulanmıştır.

Düzensiz Nanopatterns Dendrimer tabanlı yerel olarak kumanda yüzeyi Adhesiveness için: Chondrogenic farklılaşma yönlendirmek için bir yöntem

Bu çalışmada yardımcı programı ve kolaylığı nicel hücre zarı uzantısı ölçüm ve hücre yapışkanlı kapasite için onun korelasyon gösterir. Temsil edici bir örnek olarak, biz burada Dickkopf ilgili biraz protein 3 (DKK3) artan lobopodia oluşumu teşvik ve vitroAdrenokortikal Karsinom hücre adhesiveness hücreleri göstermek.

Hücre zarının uzantıları ve rolleri kanser hücre adezyon dinamikleri eğitim karakterizasyonu

Burada için geniş alan tarama prob nanolithography sonda diziler yinelemeli hizalama gibi hücre yüzeyine etkileşim çalışmaları için taş desen kullanımı tarafından etkinleştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Otomatik hizalama ve substrat imalat hücre kültür araştırmaları için uygulama tarafından kolaylaştırdı geniş alan tarama prob Nanolithography

Burada, üç boyutlu kültür glioblastoma hasta elde edilen hücre içinde uygun tunable Biyomalzeme beyin matris taklit etmek için tasarlanmış bir protokol mevcut. Bu yaklaşım bir vitro, in vivo glioblastoma hücre kültüründe genellikle kayıp birçok özelliklerini korur deneysel platformu sağlar.

Hyaluronik asit Hydrogels hasta kaynaklı Glioblastoma hücreleri 3 boyutlu kültür için dayalı.

HMCA tabanlı görüntüleme plaka işgali tahlil performans için sunulmaktadır. Bu plaka üç boyutlu (3D) tümör pulcuklarının oluşumu ve hücre dışı matriks (ECM) içine kanser hücre işgalinin ölçüm kolaylaştırır. İstila tahlil miktar yarı otomatik analizi ile elde edilir.

Kanser hücre işgali ve Anti-metastatik uyuşturucu kullanarak hidrojel mikro-odası dizi (HMCA) eleme Analizi-tabak dayalı

Tamamlayıcı bileşen C1q, doku mikroortamında yüksek derecede ifade edilen, hücre dışı matriks ile etkileşimde bulunan, Pro-inflamatuar bir molekül. Burada, biz nasıl C1q hyaluronik asit etkileri hücre yapışma bağlı test etmek için bir yöntem tarif.

Hücre yapışma teşvik içinde tamamlayıcı protein C1q ve Hyalüronik asit arasındaki Interplay değerlendirilmesi

UV'ye yakın litografi ve çekiş kuvveti mikroskopisi, mikropatterned hidrojeller üzerindeki hücresel kuvvetleri ölçmek için birleştirilir. Tek hücrelerin hedeflenen ışık kaynaklı salınımı, aynı numune üzerinde yüksek sayıda ölçüm sağlar.

Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü

Yumuşak hidrojeller üzerindeki hücre dışı matris proteinlerinin nokta dizilerinin tek bir çıkarma modelleme adımıyla mikrotemaslı baskıya dayanan hücresel çekiş kuvvetlerini ölçmek için standart bir yöntemdeki iyileştirmeleri açıklıyoruz. Bu yöntem, hücre kümesi şeklini kontrol etmek için gerekli olan ada desenlerinin daha basit ve daha tutarlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma

İnvaziv cephede glioma tümör mikroçevresini replike etmek için interstisyel sıvı akışını içeren bir yöntem sunuyoruz. Bu model, bir sıvı basınç başlığının uygulanabileceği bir doku kültürü ekinde bir hyaluronan-kollajen I hidrojeldir. İstila ölçülebilir ve hücreler izole edilebilir veya parçalanabilir.

İnterstisyel Akışlı İnvaziv Glioma Mikroçevresinin Fotopolimerize Olabilen Hyaluronik Asit-Kollajen Modeli

Öğrenin, mikrodesenli yüzeyler ve karbodiimid kimyası kullanarak kanser hücrelerinin hiyaluronik asit ile etkileşimlerini yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleriyle analiz etme yöntemini. Bu yaklaşım tümör biyolojisi ve tedavi stratejileri için önemli bilgiler sunar.

Micropatterned Yüzeyler Kanser Hücreleri ile Hyaluronik Asit Etkileşimleri Eğitim

Daha fazla video keşfet