Micropatterned Yüzeyler Kanser Hücreleri ile Hyaluronik Asit Etkileşimleri Eğitim

Kanser invazyonu ve progresyonu, tümör mikroçevresindeki büyüme faktörleri, sitokinler ve hücre dışı matris bileşenleri tarafından karmaşık bir şekilde düzenlenen modal bir hücre fenotipi içerir. Hyalüronik asit (HA), hücre yüzeyi reseptörü CD 44 ile etkileşimi yoluyla invazyon büyümesini ve anjiyogenezi artırarak tümör progresyonunu kolaylaştırdığı bilinen bir stromal hücre dışı matris bileşenidir. CD 44, tümör hücresi büyümesini, sağkalımını ve migrasyonunu teşvik eden sinyalizasyon olaylarını tetikler ve böylece metastatik yayılımı artırır; bu çalışma, ekzojen HA üzerindeki kanser hücresi adhezyonunu, migrasyonunu ve büyümesini incelemek amacıyla yapılmıştır.

Mikro desenli elastomerik bir damga üretmek için standart fotolitografi kullanılır; bu damga daha sonra cam altlıklar üzerinde amino silan moleküllerinden oluşan desenli bir dizi oluşturmak için kullanılır. Ardından, HA'yı mikro desenli amino silana kovalent olarak bağlamak için karbodiimid kimyası uygulanır. Böylece HA mikro desenleri oluşturulur; kültürlenmiş kanser hücreleri bu HA mikro desenleri üzerine ekilebilir ve kanser hücrelerinin ekzojen hyaluronik asit ile etkileşimleri ışık mikroskobu, taramalı elektron mikroskobu veya immünofloresan mikroskobu gibi yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri kullanılarak görselleştirilebilir.

Bu video makalesinde sunulan mikro desenli HA yüzeyleri oluşturma yöntemi, kanserde ekzojen hyaluronik asidin rolünün daha detaylı açıklanması gibi, kanser araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Cam lamların HA ile baskılanmasında kullanılacak olan mikro desenli Polimetil Zane veya PDMS damgayı hazırlamak için, yeni bir silikon gofretini cımbızla tutarak başlayın.

Ardından laboratuvar evyesinin üzerine yerleştirin. Gofretle ethanol ile durulamak için bir yıkama şişesi kullanın ve bir hava akımı ile kurulayın. Oda ışıklarını kapatın.

Ardından, pens kullanarak gofreti bir spin kaplayıcıya aktarın; bir transfer pipeti kullanarak gofret yüzeyinin en az %80'ini SU 2025 negatif fotoresist ile kaplayın; 600 RPM'de 10 saniye boyunca spin kaplama yapın. Ardından, 3000 RPM'de 30 saniye boyunca işlem uygulayın; fotoresist kaplı gofreti bir sıcak plakaya aktarın ve 95 °C'de üç dakika boyunca soft bake işlemi yapın. Daha sonra gofreti sıcak plakadan alın ve bir dakika boyunca soğumasını bekleyin.

İstenen desene sahip önceden hazırlanmış bir maskeyi, fotoresist kaplı waferın üzerine yerleştirin ve 20 saniye boyunca UV ışınlaması yapın. Ardından, waferı bir sıcak plakaya aktarın ve 110 °C sıcaklıkta altı dakika boyunca sert pişirme (hard bake) işlemi uygulayın.

Işıkları açın ve wafer'ı ısıtıcı plakadan çıkarın. Bu aşamada, transfer pipeti kullanılarak belirgin desenler görülmelidir. Wafer'ı SU eight fotoresist geliştirici ile dikkatlice durulayın; geliştirici çözelti ile üç kez durulamanın ardından etanol ile durulama yapın.

Eğer herhangi bir beyaz kalıntı mevcutsa, fotoresist geliştirici solüsyonla durulama işlemini tekrarlayın veya wafer'ı iki dakika boyunca geliştirici solüsyonda bekletip tekrar etanolle durulayın, suyla yıkayın ve geniş bir whey teknesinde hava akımıyla kurulayın. Burada gösterilen wafer için PDMS elastomer solüsyonu ve kürleme ajanını 10'a bir ağırlık oranında karıştırın; 22 gram yeterlidir. Bir santrifüj tüpüne boşaltın ve beş dakika boyunca 900 RPM hızda döndürün.

Hava kabarcıklarını gidermek için desenli gofretle uygun boyutta bir Petri kabına yerleştirin. Gofretin üzerine, yaklaşık çeyrek inç kalınlığında olacak şekilde, gofreti tamamen kaplayacak miktarda PDMS çözeltisi dökün. Gofret yüzeyinde herhangi bir kabarcık varsa, kabarcıklar kaybolana kadar vakumlu desikatöre yerleştirin.

Tamamlayıcı bir elastomerik damga oluşturmak için oda sıcaklığında bir gece boyunca kürleyin. PDMS 12 saat sonra tamamen kürlenmemişse, wafer'ı 60 °C'deki bir fırında 30 dakika bekletin. PDMS'i wafer'dan dikkatlice ayırın.

Ardından, bir jilet kullanarak damgayı istenen boyutta kesin. Damgayı, tercihen plastik bir tutucu içinde, etanol içeren cam bir behere yerleştirin ve 15 dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Cam yüzeyler üzerinde tanımlanmış yamalar halinde ha'yı kovalent olarak immobilize etmek için yeni elastomerik damgalar oluşturmak amacıyla gofretler birden çok kez kullanılabilir.

Eşlik eden metindeki talimatlara uygun olarak, kullanılacak tüm lamları plazma temizleyicide temizleyerek başlayın. Cam lamlar temizlendikten sonra, onları plazma temizleyiciden çıkarmak için cımbız kullanın. Lamları plastik bir petri kabına yerleştirin ve daha sonra kullanmak üzere kenara ayırın.

Ardından, HA'yı bağlamak için lam üzerine damlatılacak amino silan çözeltisini 15 mililitrelik polistiren santrifüj tüpünde hazırlayın. 95% hacim/hacim etanol içerisinde, toplam hacmi beş mililitre olacak şekilde, taze %3 hacim/hacim oranında üç amino propil trimetoksisilan veya A-P-T-M-S çözeltisi hazırlayın; çözeltinin oda sıcaklığında beş dakika boyunca reaksiyona girmesini bekleyin.

Bu süre zarfında, A-P-T-M-S hidroliz yoluyla bir silanole dönüştürülür. Ardından, yalnızca kenarlarından tutarak PDMS damga desenini yukarı bakacak şekilde bir spin kaplayıcı tablasına yerleştirin. Desen yüzeyini A-P-T-M-S ile kaplamak için bir transfer pipeti kullanın.

Ardından, damga yüzeyini 3.500 RPM'de 30 saniye boyunca A-P-T-M-S ile spin kaplayın. PDMS damgayı spin kaplama cihazından çıkardıktan sonra, desenli tarafı aşağı bakacak şekilde ters çevirin, PDMS damganın bir ucunu cam lamelin merkezine yerleştirin ve tüm damganın cam lamel ile temas etmesini sağlamak için bir dakika boyunca hafifçe bastırın. Sonra, PDMS damgayı nazikçe kaldırın ve A-P-T-M-S desenli cam lamelin oda sıcaklığında beklemesini sağlayın.

30 dakika sonra, desen yüzeyini etanol ile durulayın ve hava akımıyla kurulayın. Fazla A-P-T-M-S'yi uzaklaştırmak için PDMS damgasını 15 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Ardından, yüzeyleri ısıtmak ve fazla suyu uzaklaştırmak için slaytları bir saat boyunca 115 °C'deki bir ısıtıcı tabla üzerine yerleştirin.

Ethanol ile durulayın ve cımbız kullanarak hava ile kurutun. Desenli lamı cam bir petri kabına aktarın. Bir transfer pipeti kullanarak, desenlerin etrafında yapışmaz bir bölge oluşturacak şekilde cam lamın tamamını yeni hazırlanmış polietilen glikol veya PEG cline çözeltisi ile kaplayın.

75 °C'de 45 dakikalık inkübasyonun ardından, fazla peg salin çözeltisini dökün. Daha sonra cam lamı cımbızla tutarak, desenli cam lamların yüzeyini önce toluenle, ardından tekrar suyla durulayın ve hava akımıyla kurutun. Lamları nemlendirilmiş bir lam kutusuna yerleştirin.

Ardından kutuyu biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin ve germisid ışınlama yapmak için UV lambasını bir saat boyunca açık tutun. Bu noktadan itibaren işlemlere biyolojik güvenlik kabini içerisinde devam edin. Kabin dışında steriliteyi korumak için, 10 millimolar konsantrasyonda bir mililitre steril sulu HA çözeltisi hazırlayın.

5 mM 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodimid (EDC) ve 50 µg/mL hidroksi-CIN aide kullanılmıştır. Steril floresein işaretli HA EDC, HA karboksil gruplarıyla reaksiyona girerek amin reaktif ara ürünler oluşturan sıfır uzunluklu bir çapraz bağlama ajanıdır. Bu ara ürün hidrolize yatkın olduğundan, karbodimid reaksiyon verimliliğini artırmak için NHS eklenir.

Ardından, desenli alan tamamen kaplanana kadar desenli cama 200 µL'lik steril HA çözeltisi alikotları uygulayın. Ardından, lamları ışıktan korumak için lam kutusunu kapatın. HA çözeltisi mikro desenli A-P-T-M-S ile etkileşime girip HA ara madde ile A-P-T-M-S'nin birincil amin arasında stabil bir MI bağı oluşurken, desenli substratlar çeker ocak altında 16 ila 24 saat boyunca rahatsız edilmeden bırakılmalıdır.

Ertesi gün, HA çözeltisini aspire etmek için APA transfer pipeti kullanın. Lamları PBS ile yıkayın, ardından yüzeyi bir saat boyunca PBS içinde %1 BSA ile kaplayın. Yüzey artık hücre kültürü için hazırdır.

HA mikrodesenli yüzeylerde kültürleme yapmak için HA mikrodesenli yüzeyleri steril bir petri kabına yerleştirin. Cam yüzeyin 18,75 santimetrekaresine, 1 mL hücre besiyeri içerisinde 0,4 ile 1 x 10⁶ kanser hücresi arasındaki yoğunluklarda, kanser hücrelerinin tek hücre süspansiyonlarını ekerek cam lamın yüzeyini kaplayın. Hücreleri dikkatlice 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Besiyerinin dökülmemesine dikkat ederek, hücre adezyonunun 24 saat içinde gerçekleşmesini bekleyin; bu durum ters ışık mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir.

Hücre kültürü yüzeyleri beş güne kadar korunabilir. Standart inkübatör koşullarında medyayı gün aşırı değiştirin. Hücre morfolojisi ve büyümesi, ters ışık mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir.

Ardından, burada gösterilen örnekteki HA yüzeyine verilen yanıtları analiz etmek için ek hücresel analizler uygulanabilir. Floresan mikroskop ve görüntü kullanılarak görselleştirilmiş HA desenli yüzey. J floresans yoğunluğu analizi, ha'nın desen mobilizasyonunu kanıtlamaktadır.

HA mikro desenli yüzeyler, kanser hücrelerinin eksojen HA ile olan etkileşimlerinin incelenmesine olanak sağlar. HA mikro desenli yüzeylerdeki kanser hücresi adezyonu burada gösterilmiştir. Hem kolon hem de meme karsinomu hücreleri, 24 saatlik kültür süresinin ardından tercihen HA yamalarına tutunmuştur. Kültürlenen hücrelerin HA immobilize yüzeylerle olan etkileşimlerini analiz etmek için taramalı elektron mikroskopisi kullanılarak yüksek çözünürlüklü görüntüleme yapılabilir.

Bu taramalı elektron mikrografında, kolon kanseri hücrelerinin HA ile etkileşimi görülebilmektedir; sağ tarafta daha yüksek büyütme gösterilmiştir. HA yüzeylerde kültüre edilen meme kanseri hücreleri burada tekrar gösterilmiştir, sağ tarafta yine daha yüksek büyütme yer almaktadır. Bu analiz, kanser hücrelerinin HA mikro desenler üzerindeki yayılımını artıran yapışkan çıkıntıların varlığını açıkça ortaya koymaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, HA mikro desen servislerinin nasıl hazırlanacağı ve kanser hücresi yanıtını incelemek için bunların nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.