Devirli Tek Eksenli Gerilme kullanarak Kök Hücre Mekanik Uyarım

Merhaba, ben Song Li. UC Berkeley Biyo Mühendislik Bölümü'nde doçentim. Ben de Kyle Kapinsky, yine UC Berkeley'de biyo mühendislik alanında doktora adayıyım.

Bugün, döngüsel tek eksenli gerinim kullanarak kök hücrelerin mekanik stimülasyonuna yönelik bir protokol sunacağız. Laboratuvarımızdaki araştırmalar, özellikle kardiyovasküler sistemde hücre ve doku mühendisliğine odaklanmaktadır. Birkaç potansiyel uygulama alanı olduğu için kök hücrelerin mekanik biyolojisi ile ilgileniyoruz.

Birincisi, mekanik faktörlerin gelişim üzerindeki etkisini, örneğin embriyonik gelişimi anlamak istiyoruz. İkincisi, in vitro veya biyoreaktörlerde kök hücre farklılaşmasını kontrol etmekle ilgileniyoruz. Üçüncüsü ise, örneğin transplantasyon sonrası, kök hücrelerin in vivo ortamdaki kardiyovasküler mekanik faktörlere nasıl yanıt verdiğini araştırıyoruz.

Tüm bunları araştırmak için, hücreleri elastik membranlar üzerine ekebildiğimiz ve ardından bu membranları belirli bir süre, belirli bir gerilme miktarı ve belirli bir gerilme hızıyla eş zamanlı olarak gerebileceğimiz özel tasarlanmış bir biyoreaktörümüz bulunmaktadır. Şimdi sizi, bu protokolü kurmak için yapmanız gereken tüm işlemler boyunca yönlendireceğiz. Herhangi bir laboratuvar sabunu veya deterjan kullanarak, membranın her iki tarafına sabun sürün ve membran üzerinde herhangi bir kalıntı varsa bunları temizlemek için iyice fırçalayın. Hücreleri etkileyebilecek her şeyi temizlemeye çalışıyoruz.

Bunu manuel olarak yapıyorum. Her iki tarafın da yeterince temizlendiğinden emin olduğumda, bir kez daha suyla duruluyorum. Ardından, tamamen steril olduğundan ve tüm mikro partiküllerin temizlendiğinden emin olmak istiyorum.

Şimdi bu membranı alıp %70 alkol içeren bir behere yerleştireceğim. Membranın tamamen içeri girdiğinden emin olun. Ardından beherin tamamını alıp bir sonikatöre yerleştirebilir ve 10 dakika boyunca sonikasyon uygulayabilirsiniz.

Mikro desenli membran kare bir kapta olduğuna göre, desenli tarafın gerçekten bize dönük olduğundan emin olmak istiyoruz. Bu nedenle, alkol içeren bir sprey şişesiyle membranın üst kısmına sprey sıkacağım. Şimdi sıvının aşağı doğru aktığını ve bu kanalları görebilirsiniz.

Böylece desenli tarafın yukarı baktığını ve doğru yönde olduğunu doğrulamış olduk. Gece boyu süren UV adımını tamamladık; tüm odacıkların, odacık çerçevelerinin ve membranların kendilerinin çeker ocakta olduğunu ve gece boyunca UV altında bekletildiklerini görebilirsiniz. Bu, bizim son sterilizasyon adımımızdır.

Şimdi yapmak istediğim şey tüm membranlara plazma işlemi uygulamak; bunun için her seferinde bir veya iki membran çıkarıp steril kaplarında tutarak plazma cihazına taşıyacağım. Vakum basıncı tahliye edildiğine göre artık hazneyi çıkarabilirim. Tekrar belirtmeliyim ki burası tamamen steril değil, ancak daha sonra tekrar sterilize edeceğiz.

Plazmanın üzerinde kalması için nispeten hızlı çalışarak forseps kullanmalısınız. Ve tekrar belirtmek gerekir ki, bu çok kritiktir. Membranı düşürmediğinizden veya yönünü değiştirmediğinizden emin olun.

Şu an için sadece üst yüzeye plazma işlemi uygulandı; bunu nispeten steril olan kabıma plazma işlem görmüş yüzeyi yukarı bakacak şekilde geri koyacağım, kapağı kapatacağım ve ardından steril kabine taşıyacağım. Membran plazma işleminden geçtiğine göre, onu tekrar kabine yerleştirip %2'lik jelatin ile işleyeceğim. Bu konsantrasyon ağırlık/hacim cinsindendir.

Çözeltinin hâlâ desenle uyumlu bir şekilde ilerlediğini görebilirsiniz. Ayrıca, plazma işlemi uygulandığı için yüzey oldukça hidrofiliktir. Bu nedenle çözelti, yukarıda toplanmak yerine yayılır; eğer yanlışlıkla membranı ters çevirmiş olsaydınız, çözelti yukarıda toplanırdı ve böylece yanlış tarafı kullandığınızı anlardınız.

Çözeltinin eşit şekilde dağıldığından emin olun. Tüm membranlar için bu işlemi yaptıktan sonra, davlumbazı kapatıp UV ışığını 30 dakika boyunca çalıştırın. Bu aşamada, membran yüzeyinde jelatin varken yarım saat boyunca UV ışığına maruz kalmış olur ve bu süre jelatinin yüzeye absorbe olması için yeterlidir.

Bu noktada membranı steril PBS ile iki kez yıkamak istiyorum; genellikle kare bir kaba yaklaşık 10 ml ekliyorum ve membranın yüzeyine dokunmamaya dikkat ederek elimle hafifçe yıkayıp ardından PBS'yi aspire ediyorum. Bunu bir kez daha yapacağım ve ikinci yıkamanın ardından membranı PBS içinde bırakacağım; bu işlem membranın yağlanmasını sağlayarak hazneye yerleştirilmesini kolaylaştırır. Eğer membran kuru bırakılırsa, yırtılma veya bir şekilde hasar görme olasılığı daha yüksektir.

Bu ikinci yıkamadır. Jelatinin tamamının membrandan uzaklaştığından emin olmak için tekrar bir kez aspire edin. Ardından membranı yaklaşık 10 milliliters steril PBS içerisinde bırakın.

Birden fazla membranla çalışıyorsanız, bu işlemi her biri için tekrarlayın. Bundan sonra montaj için hazır olacaksınız. Çerçevelerden birini alın; bu aslında iki parçadan oluşur ancak genellikle önceden monte edilmiş haldedirler.

Burada bir parça T parçasıdır, diğer parça ise membranın kendisini tutacak olan çerçevenin bir parçasıdır. Çerçevenin buna benzer ikinci bir parçası daha vardır. Gördüğünüz gibi, üzerinde bu oluk bulunmaktadır.

Conta, membranı yerinde tutmak için buraya yerleştirilecektir. İkinci parçada, membranın her iki tarafını tutması için başka bir contaya yönelik ikinci bir oluk bulunur. Bu parçayı alıp çerçeve üzerine bu şekilde yerleştirin, çerçeveyi ters çevirin ve otoklav vidalarından birini alın.

Vidayı üst kısma yerleştirin, önce elinizle biraz sıkıştırabilir ve ardından tamamen sıkmak için altıgen anahtarlardan birini kullanabilirsiniz. Şu anda monte edilmiş bir çerçevem var ve membran, elim membranmış gibi bu şekilde alt kısma yerleştirilecek. Bu da desenli ve/veya plazma işleminden ve jelatin işleminden geçmiş olan tarafı istediğim anlamına geliyor.

Onu bu şekilde yukarı bakacak şekilde istiyorum. Eğer yanlışlıkla ters çevirirsem ve jelatin kısmı aşağıda kalırsa, bu deney için büyük bir sorun teşkil eder. Bu nedenle, parçaları birleştirirken desenli kısmın bu şekilde yukarı bakmasını istiyorum ancak montajı ters şekilde yapacağım.

Bu nedenle, membranı çıkardığımda desenli tarafın aşağıya baktığından emin olun. Bir membranı alıyorum ve unutmayın, şu an desenli taraf yukarı bakıyor. Membranı PBS'den çıkarıyorum ve şu şekilde çerçeve üzerine yerleştiriyorum.

Böylece şu an her iki taraf da yaklaşık olarak eşit durumda. Membran kenarlarına parmaklarınızla dokunmanızda bir sakınca yoktur, ancak karşı tarafa dokunmamaya çalışın. Membranı bu şekilde ters çevirdiğimde, desenli taraf artık aşağı bakıyor; montajı kolaylaştırmak için istediğim de buydu, şimdi iki contayı alın ve PBS içerisine yerleştirin.

Genellikle ileri geri yuvarlarım. Böylece contanın tamamını ıslatırım ve bu, tıpkı membranı PBS içinde lubrike ettiğim gibi contayı da lubrike eder. Kuru bir membranda kuru contalar kullanırsanız, bir şeylerin kayma olasılığı çok daha yüksektir.

Buna başlama yöntemim, aslında bir tarafı diğer taraftan biraz daha uzağa çekmektir; çünkü contayı yerleştirdiğinizde, eğer contayı bu tarafa yerleştirirsem membranı bu yöne doğru çekecek ve böylece bu taraf biraz daha kısalacaktır. Bu nedenle, burada bir ucu kısaltarak başlayın. Bir conta alın ve her iki tarafta oldukça eşit olacak şekilde üzerine yerleştirin.

Ardından eşit basınç uygulayarak aşağı doğru bastırın; başparmaklarınızı veya başparmak uçlarınızı kullanın, ancak bu aşamada tırnaklarınızı kullanmayın çünkü membranı yanlışlıkla kesme ve yırtma olasılığınız daha yüksektir. Ben yerleştirmeyi tamamladıktan sonra, aslında forsepsimin arka kısmını alıp bastırmak için bunu kullanıyorum. Tekrar belirtmek gerekirse, çok sert bastırmamaya veya kayıp membrana dokunmamaya dikkat edin; çünkü bu noktada membranı yanlışlıkla kesebilir veya yırtabilirsiniz, bu durumda yeni bir membran alıp işlemi baştan başlatmanız gerekecektir.

Böylece bir taraf yerleştirilmiş oldu, ancak diğer taraf hala gevşek. Bu yüzden ters çevirin, diğer contayı alın, ıslak olduğundan emin olun ve tıpkı önce yaptığınız gibi üzerine yerleştirin. Ardından, genellikle membranı kavramak ve biraz germek için pens kullanırım; çünkü eğer çok gevşek kalırsa, membranda çok fazla bolluk oluşur ve hücreleri görmek imkansız hale gelir.

Yani gergin olmasını istiyorsunuz ancak esnemeyecek kadar aşırı gerilmemeli. Eğer önceden gerilmiş olursa, membran kendiliğinden zaten gergin olduğu için deneyi etkileyecektir ve conta bastırılırken eklenen küçük bir gerilme ile membranı yırtabilirsiniz. Şu anki haliyle oldukça gergin görünüyor.

Bir tarafı belki biraz gevşek kalmış olabilir, ancak bunu birazdan düzelteceğim. Tekrar, oldukça eşit bir basınç uygulayarak, sadece başparmak uçlarınızla veya parmak uçlarınızla bastırın. Ve şu noktada, bir tarafın oldukça gergin olduğunu görebilirsiniz.

Diğer tarafa kadar tamamen düzdür. Membran orada biraz gevşek ve bu yüzden yukarı doğru kıvrılıyor. Bu yüzden yapacağım şey, tıpkı önceden yaptığım gibi, bu tarafı contanın boyunca yavaşça ve eşit bir şekilde tamamen içeri doğru bastırmak olacaktır.

Ve böylece boşluğun büyük kısmının alındığını görebilirsiniz. Çerçevelerin ve membranların arka yüzeylerinin 30 dakikalık UV işlemini tamamladık ve şimdi her şeyin tamamen steril olması için tüm membranları, ön yüzeyleri UV ışınlandırılabilsin diye ters çevirmek istiyoruz. Bu noktada, ayrıca belirli odaları germe veya kontrol grubu olarak belirleyeceğiz.

Gördüğünüz gibi, odacıklarımı kontrol gerilme, kontrol gerilme şeklinde önceden etiketledim. Gerilme odacıkları bir adet ekstra vida gerektirir. Bu nedenle, gerilme odacığı için gerekli olan ekstra vidayı burada kapağın alt kısmının üstüne yerleştirdim.

Şimdi sadece çerçeveyi alın ve ters çevirin. Eğer bu bir germe odasıysa, birkaç vidayı değiştirmem gerektiği anlamına gelir. Eğer bir kontrol odasıysa, her şey aynı kalır.

Bu çubuk ileri geri hareket ettiğinde, membranın kendisi gerilmez, sadece çubukla birlikte hareket eder. Membranın gerilmesini istiyorsam, çerçevenin ikinci kısmını bu uçtan odacığın tabanına sabitleyerek hareketsiz kalmasını sağlamam gerekir. Böylece çubuk hareket ettiğinde, sadece çerçevenin bu kısmı ileri geri hareket edecektir.

Bunu yapmak için, ek vidayı alın ve gövdenin bu parçasındaki vida deliğine yerleştirin. Altıgen anahtarı kullanarak vidayı sıkın. Bu polistiren şambarlar biraz hassas olduğundan vidayı aşırı sıkmayın; şambarın çatlamasını istemezsiniz, bu nedenle gövde parçasının yerinden oynamayacağı kadar sıkmanız yeterlidir.

Ardından ilk vidayı taktıktan sonra, çerçevenin iki parçasını bir arada tutan bu vidayı sökebilirsiniz; vidanın membran üzerine düşmemesine dikkat edin, çünkü üzerine ektiğiniz jelatinin bir kısmına zarar verebilir. Vida yeterince gevşediğinde, altıgen anahtarı çıkarın, vidayı pensle tutun ve ikinci vida deliğine yerleştirin. Ardından altıgen anahtarı tekrar kullanarak ikinci vidayı sıkın.

Çerçeve parçası iki vida ile sabitlendikten sonra, artık germe işlemi için hazırlanmış bir hazneye sahibim. Bu bar germe makinesi aracılığıyla ileri geri hareket ettiğinde, membranın kendisinin aslında gereleceğini görebilirsiniz. Membranımda herhangi bir sorun olmadığından emin olmak için bunu birkaç kez yapmayı tercih ediyorum.

Eğer herhangi bir nedenle bir çatlak oluşursa ve ardından membran yırtılırsa, bunu deney başlamadan önce fark edebilir ve farklı bir membran yerleştirebilirim. Bu yüzden bunu kenara çekip bir sonrakini alıyorum ve bu örnekte bu, kontrol odası olarak etiketlenmiş. Kontrol odası için tek yapmam gereken onu ters çevirmek.

Şimdi makineye yerleştirildiğinde, gerilme olmadan ileri geri hareket edecektir. Ardından, sahip olduğunuz oda ve membran sayısı kadar bu işlemi tekrarlayın. Her biri ya gerdirici kontroldür; sonrasında çeker perdeyi kapatın ve membranların üst yüzeylerini 30 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın.

Tüm bölmeleri ve membranlar için çerçevelerin üst kısımlarını 30 dakika boyunca UV ışınımına maruz bıraktık. Böylece her şey sterilize edildi, tüm parçalar birleştirildi ve hücreleri ekime hazırız. Bu işlemde, 10 santimetrelik kaplardan aldığım mezenkimal kök hücreleri ekimi yapacağım.

Bu nedenle, her bir membran için, özellikle bu örnekte olduğu gibi desenli bir membran kullanıyorsanız, desenin bulunduğu kare alanı ekebilirsiniz. Sadece bu desenli alana ekim yapmak istiyorum. Eğer desenli olmayan bir membran kullanıyorsanız, sıvının kenarlara çok yaklaşmaması için yine yaklaşık olarak aynı alana ekim yapmanız gerekir.

Sıvı kenarlara çok yakınsa, dışarı taşabilir ve bu durumda hücrelerinizi tam olarak ekebilmeden ölebilirler. Hücre ekimi yaptığınız bölgeye uygun miktarda hücre yerleştirmek istersiniz. Bu nedenle, deneyi gerçekleştirirken o bölgenin oldukça konfluente olmasını istiyorum.

Dolayısıyla 10 santimetrelik bir kap kullanıyorsam, bu alanda yaklaşık üçte bir konfluens düzeyinde bir plaka istiyorum. Ve bu durumda, mezenkim kök hücreleri için bu yaklaşık 250.000 hücredir. Bu sayı, kullandığınız hücre tipine bağlı olarak değişecektir.

Hücrelerimi plakadan ayırıp uygun hacimdeki solüsyonda yeniden süspanse ettim. Her bir membrana bir ml'lik hücre solüsyonu eklemek istiyorum. Bu durumda, ml başına yaklaşık 250.000 mezenkimal kök hücrem bulunuyor.

Bu nedenle P 1000 kullanıyorum, çözeltinin homojen olduğundan emin oluyorum. Böylece pipetle birkaç kez yukarı aşağı çekip pipete 1 ml alıyorum ve yalnızca o alana ekleme yaptığından emin olmak istiyorum. Bu yüzden eklemeyi çok yavaş yapıyorum ve desenli alan üzerine küçük damlacıklar halinde uyguluyorum.

Ve aslında bunun bir desen olduğu için bu yönde küçük ovaller oluşturduğunu görebilirsiniz çünkü aslında o olukları algılıyor. Dolayısıyla bunlar tam daire değil. Bu durumda daha çok oval şekilliler.

Ardından bu alanın tamamını görüyorum ancak henüz kenarlara çok fazla yaklaşmıyorum. Çok ileri gitmek ve pipetimdeki tüm solüsyonu tüketmek istemem. Daha sonra, taşmamaya dikkat ederek, solüsyonu kenarlara yakın bölgelere yaymak için pipeti kullanırım.

Geçilmeyen alanlarda herhangi bir hücre istemiyorum ve size en yakın olan kenarı tutturmak biraz zordur. Bu nedenle, genellikle burayı dikkatlice döndürerek son kenarı da kapsarım. Bu işlem, hücrelerin oldukça eşit bir şekilde yayılmasını sağlayacaktır.

Ve şu an hepsi çökmüş durumda. Ancak hücrelerin herhangi birinin dökülmemesine dikkat etmelisiniz. Bu nedenle elinizi üzerinden geçirmemeye ve ayrıca çok hızlı hareket ettirmemeye özen gösterin.

Ardından onu tekrar kenara çekiyorum. Burayı kapatmak ve hücrelerin üstte ekili kalmasını sağlamak istiyorum. Burayı kapatmak için bu kapağı kullanıyorsunuz ve kapakta aslında iki farklı delik bulunuyor.

Bu tarafta daha derin, diğer tarafta ise gazların girmesine izin veren daha sığ bir delik bulunmaktadır. Derin olan deliğin buradaki T parçasıyla hizalandığından emin olmalısınız. Aksi takdirde, sığ olanı kullanırsanız çok sıkı olacaktır.

Bu şekilde yerleştirerek tüm hazneyi kapatmış olacaksınız. Ardından, kalan tüm hazneler için aynı işlemi tekrarlayın ve hücrelerin dibe çökmesi ve membranlara tutunmaya başlaması için bunları 30 dakika boyunca steril kabinde bekletin. Sonrasında, tüm hazneleri bantlayacağız ve membranlara tamamen yapışmaları için bir saat daha bekletilmek üzere steril kabinden inkübatöre transfer edeceğiz.

Tamam, hücrelerin membranlar üzerinde yarım saat bekleme süresini tamamladık. Şimdi hücreleri inkübatörün içinde bulunan 37 °C ve %5CO2 koşullarına maruz bırakmak istiyorum. Bu nedenle, örnekleri steril kabinden inkübatöre aktarmam gerekiyor.

Bunu yapmak için, hücre solüsyonunun kaymaması adına odacıkları hiçbir yöne eğmediğinizden ve gerçekten çok dikkatli olduğunuzdan emin olmanız gerekir. Aksi takdirde, temel olarak her şeye yeniden başlamak zorunda kalırsınız. Hücreler inkübatördeki odacıkta bir saat boyunca kaldığı için artık yüzeye sıkıca tutunmuş durumdadırlar.

Bu noktada, hazneyi inkübatörden çıkardım ve daha önce yaptığım gibi çok dikkatli bir şekilde taşıyarak tekrar çeker ocağa yerleştirdim. Böylece membrandaki medyanın dökülmemesini sağladınız. Şimdi, germe haznesine 20 mL medya eklemeniz gerekmektedir.

Ve bu durumda, kontaminasyona hafifçe yatkın olduğu için kontaminasyonu dışarıda tutmak üzere mükemmel şekilde tasarlanmış özel bir besiyeri kombinasyonu kullanıyorum. %10 FBS, %1 penisilin, streptomisin eklenmiş DMEM ve mantarları uzak tutmak için ek olarak %1 fungizone kullanıyorum. 20 mL besiyerini alarak bunu dikkatlice germe haznesine ekliyorum.

Besiyerinin membrandan ayrılmadığını ve şun burada olduğu gibi haznenin sonuna eklendiğini görebiliriz; böylece besiyeri önce membranın altına ve ardından membranın üzerine geçer. Hücreleri tamamen rahatsız etmemek için bunu yavaşça yapın. Ardından üzerini tekrar kapatın ve kapağı sıkıca yerine yerleştirin.

Ve bu noktada, hücreleri rahatsız etme veya membrandan kopmalarına neden olma konusunda artık endişelenmenize gerek yoktur. Bu nedenle, numuneyi biraz daha az dikkatli bir şekilde taşıyabilirsiniz. Uygun miktarda suş seçmeniz gerekmektedir.

Bu makinenin çalışma prensibi, bir kolun bağlı olduğu döner bir çarka sahip olmasıdır ve bu kol, çarkın merkezine yerleştirdiğiniz önceden hazırlanmış parçanın ekine bağlı olarak uzunluk değiştirebilir. Böylece çark döndüğünde, bu kol ileri geri hareket eder ve bu da platformun ileri geri hareket etmesini sağlar. Odacıklar ise bu platforma bağlıdır.

Bu nedenle, onlar da sırasıyla ileri geri hareket ederler. Dolayısıyla, %5 gerinim uygulamak istediğimde, üzerinde beş yazan ve bu kolun doğru konuma gitmesini sağlayacak önceden hesaplanmış belirli bir uzunluğa sahip prefabrike bir parçaya sahip olurum. Bunu tekerleğin merkezine yerleştiririm, ardından kolu takarım, sıkıca yerleştiğinden emin olurum ve son sabitleme işlemini gerçekleştirmek için alyan anahtarını kullanarak sıkarım.

Her şey yerine yerleştirildikten sonra, cihaz sıfır konumundadır ve her şey kilitlenmiştir. Artık odacıkları yerleştirmeye hazırız. Bunlar, az önce taşıdığım odacıklardır.

Hücreler üstteyken, cihazı dikkatlice tek bir konuma yerleştirin ve barın yerine oturduğundan emin olun. Sıfır konumunda kilitlenmesi için barın bu yöne doğru itildiğinden emin olmanız gerekir. Çok geriye itmeyin, aksi takdirde membranı önceden gerebilirsiniz.

Ardından, hareket etmemesi için buradaki sabitleyici ile yerine kilitleyin. Daha sonra, çalışması için şalteri açın. Başlangıçta küçük bir sıçrama olduğu görülebilir.

Bazen böyle olur, takılır ancak sonrasında genellikle oldukça sorunsuz bir şekilde ilerlemeye başlar. Ve tüm çubuklar şu an ileri geri hareket ediyor ve saniyede 60 döngü gerçekleşiyor. Dolayısıyla burada 600 yazıyor.

Bu değer aslında 60,0 olmalıdır. Ayrıca isterseniz frekansı değiştirebilirsiniz. Hücreler sisteminizde mekanik strese maruz kaldıktan sonra, bunu genellikle yaklaşık iki ila beş gün boyunca uygularız, ancak isterseniz bu süreyi daha kısa veya daha uzun tutabilirsiniz.

İşlemi tamamlayıp belirli bir bitiş noktasına ulaştığınızda, hazneleri çıkarabilir ve ardından bu membranlar üzerindeki hücreleri farklı durumları araştırmak için kullanabilirsiniz. Genellikle mikroarray ve 2D jel elektroforezi dahil olmak üzere çeşitli teknikler uygularız. Ayrıca, gen ekspresyonu için PCR veya protein ekspresyonu için western blotting yöntemlerini kullanırız.

Hücreleri sadece liz etmekle kalmayıp, belirli proteinlerin immunfloresansını görmek için onları doğrudan membran üzerinde boyayabilir veya hücreleri membrandan serbest bırakıp ardından boyayarak bir faks makinesinden geçirebilirsiniz. Dolayısıyla, yapabileceğiniz pek çok farklı işlem ve inceleyebileceğiniz pek çok farklı unsur mevcuttur. Elbette, farklı tipte mikro desenli membranlar, farklı malzemeler veya farklı kaplamalar kullanmak isterseniz, sistemi modifiye etmek için yapabileceğiniz pek çok farklı makine varyasyonu da bulunmaktadır.