Bir Tümör Mikroçevre yeniden oluşturmak için mikroakışkan Cihazı In vitro

Bu prosedürün genel amacı, in vitro olarak tümör mikro ortamlarını yeniden oluşturan ve kemoterapötik ilaçların test edilmesi için kullanılabilen bir mikroakışkan cihazın imalatını ve çalışmasını göstermektir. Bu mikroakışkan cihazdır. Bu cihaz aşağıdaki alanlarda yararlı olabilir, in vitro kemoterapötik ilaçlar için kolay test.

Üç boyutlu tümör dokusunu test etmek için tutarlı ve doğru sonuçlar sağlar ve bu cihaz, in vivo tümörün çok doğru bir temsilini sağlar. Mikroortamlar: tümörler 3D mikro ortamlarda bulunur ve birinde test etme yeteneği önemlidir. Prosedürün ilk adımı, yumuşak litografi kullanılarak mikroakışkan çip imalatını, giriş ve çıkışlarda delikler açmayı, bir cam kızağa bağlamayı ve akış girişi ve çıkışı için boru bağlamayı içeren cihazı monte etmektir.

Daha sonra, asılı damla yöntemi kullanılarak cihazda kullanılmak üzere tek tip çok hücreli tümör steroidleri üretilir. Sferoidler daha sonra cihaza sokulur, ardından apoptoz, tespit edici ajanlar ve kemoterapötik ilaçlar gelir. Son olarak, zaman atlamalı mikroskopi gerçekleştirilir, ardından kemoterapötik ajanın penetrasyon kabiliyetini ölçmek için ilaç yayılma katsayılarının matematiksel tahmini yapılır.

Sonuç olarak, zaman atlamalı floresan mikroskobu kullanılarak doku içinde heterojen mikro ortamların cihaz oluşumunda doku büyümesini ve dokuya ilaç difüzyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Kanser ilaçlarının katı tümörlere sınırlı penetrasyonu, başarısızlıklarının önemli bir nedenidir. Mevcut kanser ilacı test modellerinin çoğu, katı tümörlerin üç boyutlu doğasını taklit etmemektedir.

Sürekli perfüze edilmiş üç boyutlu tümör dokularından oluşan mikroakışkan bir cihaz geliştirdik. Bu model, ilaçların katı tümörlere verilmesini ve sistemik klerensini daha doğru bir şekilde temsil eder. Çok hücreli tümör steroidleri, üç boyutlu tümör dokularının iyi bilinen bir modelidir.

Bu prosedürde, mikroakışkan cihazda kullanılmak üzere steroidler oluşturmak için asılı damla yöntemi kullanılır. Bu yöntem, kısa sürede tutarlı steroidlerin oluşumuna izin verir. Kemoterapötik ilaçların in vitro olarak üç boyutlu dokuda test edilmesi, ilaçların tek hücre katmanlarına kıyasla daha verimli bir şekilde taranmasına yardımcı olabilir.

PDMS'yi ve sertleştirici maddeyi silikon elastomerden dokuza bir ağırlık oranında karıştırın. Daha sonra bu karışımı dört milimetre kalınlığında bir parlama Degas oluşturmak için master'ın üzerine dökün. Hava kabarcıklarını gidermek için beş saat boyunca 60 santigrat derecede sertleştirin.

Elastomer üzerinde bir akış özellikleri damgası elde etmek için kürlenmiş PDMS'yi kalıptan soyun. Daha sonra bir matkap üzerine monte edilmiş bir buçuk milimetre biyopsi zımbası kullanarak, girişler ve çıkışlar için zımba deliklerine basın. Herhangi bir kalıntıyı dışarı çekin.

Damganın özellik tarafını ve temiz bir cam slaytı sekiz dakika boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın. Bir oksijen plazması aşındırıcıda, aralarında bir bağ oluşturmak için işlenmiş yüzeyleri hemen temas ettirin. Düzeneği en az beş saat boyunca bir sürgülü ısıtıcı üzerinde 60 santigrat derecede tutun.

Bağı güçlendirmek için 0.032 inç ID PTFE boruyu mikroakışkan cihazın giriş ve çıkışlarına bağlayın. Dikenli dişi yem kilidi konektörlerine bağlı erkek yem kilidi konektörlerinden oluşan bir arayüz kullanarak, bu özel konektörler, kırılmadan kolayca geçmelerini sağlamak için kullanılır. Son olarak, kesme vanaları ve bir Y konektörü kullanarak akış tertibatını kurun, cihazı mikroskoba monte edin Cihazı monte ettikten sonra, akış kurulumunu tamamlamak için hortumu uygun giriş ve çıkışlara bağlayın.

Bu şekilde gösterildiği gibi, bu konfigürasyon, bir sferoidi cihaza paketlemenin veya paketlemek için cihaz boyunca bir ortam akışı oluşturmanın kolaylığını ve çok yönlülüğünü sağlar. Salmastra giriş valfini VPN'i açın ve salmastra çıkış valfini bir tümörden çıkarın. OID daha sonra girişten geçebilir ve bu odadaki direğin tümörü akış ortamına yerinde tutacağı kültür odasına akabilir.

Salmastra vanalarını kapatın ve üniform PHE oluşumunu başlatmak için akış giriş vanasını VF içeri ve akış çıkış vanasını VF dışarı açın. Asılı damla yöntemini kullanarak, bir kültür başlığı altında tripsin buz hücreleri. Elde edilen tripsin hücrelerini santrifüjden alın.

Stok çözeltisini tablo bir'e bakarak istenen bir konsantrasyona seyreltin. Ardından, 48 oyuklu bir plakanın kapağını çıkarın ve baş aşağı yerleştirin. Sterilize edilmiş bir davlumbazda, plakanın her bir kuyusunu bir mililitre sterilize su ile doldurun.

Nemi korumak için, kapaktaki her dairesel bölgeye 20 mikrolitrelik bir seyreltik hücre çözeltisi damlatın. Bir mikro pipet kullanarak, kapağı dikkatlice ters çevirin ve plakanın üzerine yerleştirin, damlaların Kuyucukların kenarlarına dokunmayın. Plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kullanılan belirli hücreye bağlı olarak inkübasyon süresi için tablo bir'e bakın, her asılı damlada bir steroid oluşacaktır. Cihazı akış girişinden %70 etanol ile yıkayarak sterilize ederek başlayın. PBS'nin her birini yıkayın, ardından H-E-P-E-S tamponlu hücre kültürü ortamını takip edin.

Orta şırıngayı bırakın, boruya takın. Daha sonra, şırınga musluk şırıngasına iki ila üç Steroid çekin. Hava kabarcıklarını çıkarmak için, şırıngayı cihazın ambalaj girişine takın.

Giriş valfini VPN'yi açın ve VFN'yi kapatın, çıkış valfini VP'yi açın ve VF'yi kapatın. Salmastra şırıngasını, iğne aşağı bakacak şekilde dikey tutun. Steroidin şırınganın dibine iğnenin cazibe kilidi konektörüne yerleşmesini izleyin.

Salmastra şırıngasındaki pistonu itin ve PHE'nin boruya girmesini ve cihaza akmasını izleyin, çünkü yalnızca salmastra çıkış vanası açıktır. Bir steroid cihazın odasına girecek ve arkadaki direkler tarafından tutulacaktır. Odanın içine girdikten sonra, S küresel küresi odanın şekline uyar ve dikdörtgen bir geometri kazanır.

Giriş valfini, VPN'yi ve çıkış valfini kapatın, VP çıkarın, akış şırıngası SF'yi şırınga pompasına monte edin. Bu pompa, şırınga pompası pro açık giriş valfi VFN ve çıkış valfi VF çıkışı kullanan bir bilgisayar tarafından çalıştırılır. Cihaza ortam akışını dakikada üç mikrolitre olarak başlatın.

Sferoidin 24 saat boyunca inkübasyonunu apoptoz tespit edici ajanların eklenmesi takip eder. Apoptoz, tespit veya terapötik ajanları tanıtmadan önce, besin gradyanları ve mikro ortamlar oluşturmak için 24 saate kadar sferoid dengesine izin verin. Ardından VFN vanasını kapatın.

Şırınga pompasını durdurun. Şırıngayı pompadan çıkarın ve mil başına 0.25 mikrolitre CASP kızdırma kırmızı aktif Kaspaz üç işaretleyici içeren şırınga ile değiştirin. Cihazı, 0,7 mililitresini cihazdan manuel olarak yıkayarak solüsyonla yıkayın.

Ardından şırıngayı pompaya monte edin. Akışı yeniden başlatın ve VFN valfini açın. Beş ila sekiz saatlik bir süre boyunca, fıçı eldiven kırmızı aktif cph faz üç dokuya yayılacak ve apoptotik bölgelerde daha parlak floresan floresan yayılacaktır, bu konsantrasyonda apoptoz tespit edici ajan sonraki tüm Flow çözeltilerinde korunur.

Doksorubisin, apoptoz tespit edici ajanların uygulanmasından beş ila sekiz saat sonra tanıtılır. Bu işlem yıkama ile sistemden uzaklaştırılır. Kemoterapötik ajanlar eklemek için, 10 mikromolar doksorubisin hidroklorür eklemek için apoptoz tespiti prosedürünü izleyin.

Daha sonra tedavi şırıngasını şırınga ile 0.7 mililitre ortam ile değiştirin. Terapötik ajanın akışına sabit bir süre devam edin. Ardından VFN valfini kapatın ve şırınga pompasını kapatın.

Tedavi şırıngasını şırınga pompasından çıkarın ve şırınga ile 0,7 mililitre ortam ile değiştirin. Dokuyu mikroskop altında sürekli izlerken 24 ila 36 saat boyunca taze ortamın akışına izin verin. Hızlandırılmış mikroskopi için tüm edinim süreci, IP laboratuvarında özelleştirilmiş bir komut dosyası kullanılarak otomatikleştirildi, PAX Foid'in iletilen ışık ve floresan görüntülerini her 30 dakikada bir 10 x büyütmede elde edin İlaç yayılma katsayılarının matematiksel tahmini için ilk adım, resim J.Dikdörtgen bir ilgi alanı seçin, veya odadaki dokuyu kapsayan ROI.

Akış kanalına olan mesafenin bir fonksiyonu olarak ortalama yoğunlukların bir profilini oluşturmak için çizim profili komutunu kullanın. En fazla üç farklı zaman noktası için tekrarlayın. Daha sonra, elde edilen yoğunluk profillerinden ortalama arka plan floresan yoğunluğunu çıkarın ve X ve T'nin bir fonksiyonu olarak C'yi elde etmek için karşılık gelen maksimum yoğunluğu kullanarak her profili normalleştirin.

Bir sonraki adım, tümör dokusu belgeleri içindeki doktorların etkili difüzyon katsayısını değerlendirmektir. Difüzyon, ERFC'nin tamamlayıcı hata fonksiyonu olduğu aşağıdaki denklemle temsil edilebilir. X, kanaldan dokuya olan mesafedir ve T, doksorubisin girişinden sonraki zamandır.

Dikkate alınan her zaman noktasında aşağıdaki yinelemeli şemayı kullanın. D. için bir değer tahmin edin. Her konumda denklemin sağ tarafını hesaplayın. X. İki taraf arasındaki hataların karesini alın, kalan ortalamayı en aza indirmek için D'yi değiştirin.

Her seferinde elde edilen optimum D değerleri, dokudaki doksorubisinin ortalama etkili difüzyon katsayısını tahmin etmek için işaret eder. Mikroakışkan cihazlar, üç boyutlu tümör dokusunun büyümesi için bir milimetre x 0.3 milimetre x 0.15 milimetre optik olarak erişilebilir kültür odaları sağladı. Asılı damla yöntemi, birkaç hücre hattından tutarlı boyut ve şekilde tümör PHE'sinin hızlı bir şekilde oluşmasına izin verdi.

PHE, cihazda üç güne kadar başarıyla büyütüldü. Odalardaki büyüme, mikro ortamların tekrarlanabilir modifikasyonu ile ilişkilendirildi. Phe içinde apoptoz, akış kanalına yakın hücrelerde daha az ve dokuya daha yüksek ve daha derin hücrelerde meydana geldi.

Cihaz, doksorubisin ve tümör dokusunun difüzyon katsayısını tahmin etmek için kullanıldı. Deneysel olarak elde edilen değer, bu prosedürü denerken insan meme kanserinde daha önce bildirilen değerle aynı fikirdeydi. PHE'yi cihaza akarken steriliteyi koruma konusunda ekstra dikkatli olmak önemlidir, çünkü hücre kültürü dışında gerçekleştirilmesi gerekir.

Steriliteyi sağlamak için davlumbaz sprey şırıngaları ve boru uçları cömertçe etanol ile. Bu videoyu izledikten sonra, ilaçların tümörlere sınırlı penetrasyonunun rolünü anlamış olmalısınız. Üç boyutlu tümör dokuları üzerinde ilaçların verilmesini ve sistemik klerensini taklit etmek ve penetrasyonlarını ölçmek için bir teknik gösterdik.

Zayıf nüfuz eden ilaçların ortadan kaldırılması, kanser ilacı geliştirme sürecini önemli ölçüde kolaylaştıracaktır.