Bir Tümör Mikroçevre yeniden oluşturmak için mikroakışkan Cihazı In vitro

Bu prosedürün genel amacı, in vitro olarak tümör mikroortamlarını yeniden oluşturan ve kemoterapötik ilaçların test edilmesi için kullanılabilecek bir mikroakışkan cihazın üretimi ve çalıştırılmasını göstermektir. Bu, mikroakışkan cihazdır. Bu cihaz, kemoterapötik ilaçların in vitro ortamda kolayca test edilmesi gibi alanlarda faydalı olabilir.

Üç boyutlu tümör dokusunun test edilmesi için tutarlı ve doğru sonuçlar sağlar ve bu cihaz, in vivo tümörün oldukça doğru bir temsilini sunar. Tümörler 3B mikroortamlarda bulunur ve bu ortamlarda test yapabilme yeteneği büyük önem taşır. Prosedürün ilk adımı, yumuşak litografi kullanılarak mikroakışkan çipin üretilmesini, giriş ve çıkışlara delikler açılmasını, bir cam lamla yapıştırılmasını ve akış girişi ile çıkışı için boruların bağlanmasını içeren cihazın kurulmasıdır.

Ardından, askı damla (hanging drop) yöntemi kullanılarak cihazda kullanılacak tekdüze çok hücreli tümör sferoidleri oluşturulur. Sferoidler daha sonra cihaza yerleştirilir ve ardından apoptoz, tespit ajanları ve kemoterapötik ilaçlar eklenir. Son olarak, kemoterapötik ajanın penetrasyon yeteneğini nicelleştirmek amacıyla zaman ayarlı mikroskopi uygulanır ve ardından ilaç difüzyon katsayılarının matematiksel tahmini yapılır.

Nihayetinde, zaman ayarlı floresan mikroskobisi kullanımıyla cihaz içindeki doku büyümesini, doku içerisinde heterojen mikroortamların oluşumunu ve dokuya ilaç difüzyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Kanser ilaçlarının katı tümörlere sınırlı penetrasyonu, bu ilaçların başarısızlığının önemli bir nedenidir. Mevcut kanser ilaç test modellerinin çoğu, katı tümörlerin üç boyutlu doğasını taklit etmemektedir.

Sürekli perfüze edilen üç boyutlu tümör dokularından oluşan mikroakışkan bir cihaz geliştirdik. Bu model, ilaçların katı tümörlere iletimini ve sistemik kleranslarını daha doğru bir şekilde temsil etmektedir. Çok hücreli tümör sferoitleri, üç boyutlu tümör dokularının iyi tanımlanmış bir modelidir.

Bu prosedürde, mikroakışkan cihazda kullanılacak steroidler oluşturmak için asılı damla yöntemi kullanılmaktadır. Bu yöntem, kısa bir süre içinde tutarlı steroidlerin oluşmasını sağlar. Kemoterapötik ilaçların üç boyutlu dokularda in vitro olarak test edilmesi, hücre tek tabakalarına kıyasla ilaçların daha verimli bir şekilde taranmasına yardımcı olabilir.

Silikon elastomerdeki PDMS'yi ve kürleme ajanını dokuz bir ağırlık oranında karıştırın. Ardından, dört milimetre kalınlığında bir katman oluşturmak için bu karışımı kalıbın üzerine dökün. Hava kabarcıklarını gidermek için vakumlayın (degas). 60 °C'de beş saat boyunca kürleyin.

Elastomer üzerinde akış özelliklerine sahip bir damga elde etmek için kürlenmiş PDMS'i kalıptan soyun. Ardından, bir matkaba monte edilmiş 1,5 mm'lik bir biyopsi punch'ı kullanarak giriş ve çıkışlar için punch delikleri açın. Varsa tüm kalıntıları temizleyin.

Damganın özellik tarafını ve temiz bir cam lamı sekiz dakika boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın. Bir oksijen plazma aşındırıcısında, aralarında bir bağ oluşturmak için işlem görmüş yüzeyleri hemen birbirine temas ettirin. Tertibatı, bir lam ısıtıcısında en az beş saat boyunca 60 °C'de tutun.

Bağlantıyı güçlendirmek için 0,032 inç iç çaplı PTFE tüpleri mikroakışkan cihazın giriş ve çıkışlarına bağlayın. Tırtıklı dişi luer lock konnektörlere takılı erkek luer lock konnektörlerden oluşan bir arayüz kullanılarak, bu özel konnektörler kırılma olmadan kolayca geçiş yapılmasını sağlamak amacıyla kullanılır. Son olarak, kapatma vanaları ve bir Y konnektörü kullanarak akış düzeneğini kurun, cihazı mikroskoba monte edin. Cihazı monte ettikten sonra, akış düzeneğini tamamlamak için tüpleri uygun giriş ve çıkışlara bağlayın.

Bu şekilde gösterildiği üzere, bu konfigürasyon bir sferoidin cihaza yerleştirilmesini kolaylaştırıp çok yönlülük sağlar veya paketleme yapmak için cihaz boyunca bir besiyeri akışı oluşturmaya olanak tanır. Paketleme giriş valfi VPN'yi ve paketleme çıkış valfi VP out'u açın. Ardından bir tümör sferoidi girişten geçerek kültür odasına akabilir; bu odadaki direk, besiyeri akışı sırasında tümörü yerinde tutacaktır.

Tekdüze PHE oluşumunu başlatmak için paketleme valflerini kapatın ve akış giriş valfi VF in ile akış çıkış valfi VF out'u açın. Bir kültür kabini altında, asılı damla yöntemini kullanarak tripsin buz hücrelerini hazırlayın. Ortaya çıkan tripsinlenmiş hücreleri santrifüjden alın.

Tablo bir'e bakarak stok çözeltiyi istenen konsantrasyona seyreltin. Ardından, 48 kuyucuklu bir plakanın kapağını çıkarın ve plakayı ters çevirin. Steril bir kabinde, plakanın her bir kuyucuğunu bir mililitre steril su ile doldurun.

Nemliliği korumak için, kapağın her bir dairesel bölgesine 20 µL seyreltik hücre çözeltisi damlası yerleştirin. Bir mikropipet kullanarak, damlaların kuyucuk kenarlarına temas etmediğinden emin olarak kapağı dikkatlice ters çevirin ve plakanın üzerine yerleştirin. Plakayı 37 °C'de inkübe edin.

Kullanılan özel hücreye göre inkübasyon süresi için tablo bire bakınız, her asılı damlada bir steroid oluşacaktır. Cihazı, akış girişinden %70 ethanol geçirerek sterilize ederek başlayın. Bunu sırasıyla bir kez PBS, ardından H-E-P-E-S tamponlu hücre kültürü ortamı ile durulama ile takip edin.

Besiyeri şırıngasını bırakın ve tübe bağlayın. Ardından, şırınga musluğuna iki ila üç Steroid çekin. Hava kabarcıklarını gidermek için şırıngayı cihazın paketleme girişine takın.

Giriş valfi VPN'yi açın ve çıkış valfi VP out'u kapatıp VF out'u kapatın. Paketleme şırıngasını, iğnesi aşağı bakacak şekilde dikey tutun. Steroidin şırınganın tabanındaki iğne luer lock konnektörüne çökmesini bekleyin.

Sadece paketleme çıkış valfi açık olduğu için, paketleme şırıngasının pistonunu iterek PHE'nin tüpe girmesini ve cihazın içine akmasını izleyin. Bir steroid cihazın haznesine girecek ve arkadaki destekler tarafından tutulacaktır. Hazneye girdikten sonra, S sferoid haznenin şeklini alır ve dikdörtgen bir geometri kazanır.

Giriş valfi VPN'yi ve çıkış valfi VP out'u kapatın, akış şırıngasını SF'yi şırınga pompasına yerleştirin. Bu pompa, Syringe Pump Pro yazılımı kullanılarak bir bilgisayar tarafından çalıştırılır; giriş valfi VFN'yi ve çıkış valfi VF out'u açın. Cihaza besiyeri akışını 3 µL/dk hızında başlatın.

Sferoidlerin 24 saat boyunca inkübasyonunun ardından, apoptoz tespit ajanları eklenir. Apoptoz tespit veya terapötik ajanları eklemeden önce, besin gradyanlarının ve mikroortamların oluşması için sferoidlerin 24 saate kadar dengeye gelmesini bekleyin. Ardından VFN valfini kapatın.

Şırınga pompasını durdurun. Şırıngayı pompadan çıkarın ve yerine mil başına 0,25 microliters CASP glow red aktif Caspase three markörü içeren besiyeri şırıngasını yerleştirin. Cihazdan manuel olarak 0,7 milliliters solüsyonu geçirerek cihazı yıkayın.

Ardından şırıngayı pompaya monte edin. Akışı yeniden başlatın ve VFN valfini açın. Beş ila sekiz saatlik bir süre boyunca, cask glove red active cph phase three dokuya difüze olacak ve apoptotik bölgelerde daha parlak floresan verecektir. Bu konsantrasyondaki apoptoz tespit edici ajan, sonraki tüm akış solüsyonlarında korunur.

Doxorubicin, apoptoz tespit ajanlarının uygulanmasından beş ila sekiz saat sonra uygulanır. Bu tedavi, sistemden yıkama yoluyla temizlenir. Kemoterapötik ajanları eklemek için, 10 µM doxorubicin hidroklorür uygulamak üzere apoptoz tespit prosedürünü izleyin.

Ardından, tedavi şırıngasını 0,7 milliliters medium içeren şırıngayla değiştirin. Terapötik ajanın akışını belirli bir süre boyunca devam ettirin. Sonrasında VFN valfini kapatın ve şırınga pompasını kapatın.

Tedavi şırıngasını şırınga pompasından çıkarın ve yerine 0,7 milliliters besiyeri içeren şırıngayı yerleştirin. Dokuyu mikroskop altında sürekli izlerken, taze besiyerinin 24 ila 36 saat boyunca akışına izin verin. Time-lapse mikroskopisi için tüm görüntüleme süreci, IP lab'deki özelleştirilmiş bir betik kullanılarak otomatikleştirildi; PAX Foid'in iletim ışığı ve floresan görüntüleri 10 x büyütmede her 30 dakikada bir elde edildi. İlaç difüzyon katsayılarının matematiksel tahmini için ilk adım, Image J kullanarak doku floresanının ortalama lineer yoğunluk profillerini oluşturmaktır. Haznedeki dokuyu kapsayan dikdörtgen bir ilgi alanı veya ROI seçin.

Akış kanalından olan uzaklığa bağlı olarak ortalama yoğunlukların profilini oluşturmak için plot profile komutunu kullanın. Bu işlemi üç farklı zaman noktasına kadar tekrarlayın. Ardından, elde edilen yoğunluk profillerinden ortalama arka plan floresan yoğunluğunu çıkarın ve X ile T'nin bir fonksiyonu olarak C'yi elde etmek için her bir profili ilgili maksimum yoğunluğa göre normalize edin. C, doksorubisinin normalize edilmiş konsantrasyonu olup C değeri sıfır ile bir arasında değişir.

Sıradaki adım, tümör dokusu içindeki doksorubisinin etkin difüzyon katsayısını değerlendirmektir. Difüzyon, ERFC'nin tümleyici hata fonksiyonu olduğu aşağıdaki denklemle temsil edilebilir. X, kanaldan doku içine doğru olan mesafe ve T, doksorubisin uygulamasından sonraki süredir.

Dikkate alınan her zaman noktasında aşağıdaki yinelemeli şemayı kullanın. D için bir değer tahmin edin. Her X konumunda denklemin sağ tarafını hesaplayın. İki taraf arasındaki kare hataların toplamını hesaplayın ve artık ortalamasını minimize etmek için D değerini değiştirin.

Doksorubisinin dokudaki ortalama etkin difüzyon katsayısını tahmin etmek için her zaman noktasında elde edilen D'nin optimum değerleri. Mikroakışkan cihazlar, üç boyutlu tümör dokusunun büyümesi için 1 milimetre x 0,3 milimetre x 0,15 milimetre boyutlarında, optik olarak erişilebilir kültür odacıkları sağlamıştır. Asılı damla yöntemi, çeşitli hücre hatlarından tutarlı boyut ve şekilde tümör PHE'lerinin hızlı bir şekilde oluşturulmasına olanak tanımıştır.

PHE'ler cihaz üzerinde üç güne kadar başarıyla büyütüldü. Kameralardaki büyüme, mikroortamların tekrarlanabilir modifikasyonu ile ilişkilendirildi. PHE içinde, akış kanalına yakın hücrelerde apoptoz daha az gerçekleşirken, dokunun daha yüksek ve derin kısımlarında daha fazla gerçekleşti.

Cihaz, doksorubisin ve tümör dokusunun difüzyon katsayısını tahmin etmek için kullanılmıştır. Deneysel olarak elde edilen değer, daha önce insan meme kanserinde bildirilen değerle uyumluluk göstermiştir. Bu prosedür uygulanırken, PHE cihaza akıtılırken steriliteyi korumaya ekstra özen göstermek önemlidir çünkü bu işlem hücre kültürünün dışında gerçekleştirilmelidir.

Steriliteyi sağlamak için şırıngaları ve tüp uçlarını bol miktarda etanol ile püskürterek temizleyin. Bu videoyu izledikten sonra, ilaçların tümörlere sınırlı penetrasyonunun rolü hakkında bilgi sahibi olmalısınız. Üç boyutlu tümör dokularında ilaçların iletimini ve sistemik klirensini taklit eden ve penetrasyonlarını nicelleştiren bir teknik göstermiş bulunmaktayız.

Kötü penetrasyon gösteren ilaçların elenmesi, kanser ilacı geliştirme sürecini önemli ölçüde kolaylaştıracaktır.