Name: Söz konusu modelde Saponin permeabilize Kardiyak Elyaf Oksidatif Fosforilasyon Değerlendirmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Öğrenin saponin ile permeabilize edilmiş kardiyak liflerde oksidatif fosforilasyonu değerlendirme yöntemini. Bu protokol fare kalp dokusunda mitokondriyal fonksiyonu yüksek çözünürlüklü respirometri ile hassas şekilde ölçer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma ve Genom Kanada Enstitüsü tarafından desteklendi. JS, Alberta, Kanada Sağlık Araştırma, Kalp ve İnme Vakfı ve Kanada Diyabet Derneği Heritage Vakfı&#39;ndan maaş desteği ödül tutar. Laboratuvar saponin permeabilize fiber tekniği kazanılması sırasında Oroboros Araçların teknik yardım kabul etmek istiyorum.

<ol><li>Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilized+cell+and+skinned+fiber+techniques+in+studies+of+mitochondrial+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo.</a> Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Life+in+the+Cold%22">Life in the Cold</a>. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+solubilities+of+media+used+in+electrochemical+respiration+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements.</a> Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).</li>
<li>Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentobarbital+fails+to+reduce+cerebral+oxygen+consumption+early+after+non-hemorrhagic+closed+head+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats.</a> J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+conformance+of+cellular+respiration.+A+perspective+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology.</a> Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%3A+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.</li>
<li>Sena, S., Hu, P., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+signaling+accelerates+cardiac+mitochondrial+dysfunction+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction.</a> J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).</li>
<li>Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+mitochondrial+oxidative+capacity+and+increased+mitochondrial+uncoupling+impair+myocardial+energetics+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity.</a> Circulation. 112, 2686-2695 (2005).</li>
<li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+organization+of+mitochondrial+respiratory+complexes%3A+a+new+understanding+of+an+old+subject%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject.</a> Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.</li>
<li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the human heart.</a> J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li>
<li>O, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retarded+diffusion+of+ADP+in+cardiomyocytes%3A+possible+role+of+mitochondrial+outer+membrane+and+creatine+kinase+in+cellular+regulation+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation.</a> Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).</li>
<li>Endo, M., Kitazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-C+coupling+studies+in+skinned+cardiac+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Aspects+of+Cardiac+Muscle%22%5BJournal%5D)">E-C coupling studies in skinned cardiac fibers.</a> Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).</li>
<li>Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+parameters+in+cardiac+tissue%3A+a+novel+method+of+assessment+by+using+saponin-skinned+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers.</a> Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).</li>
<li>Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+saponin+on+biological+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Action of saponin on biological cell membranes.</a> Nature. , 196-952 (1962).</li>
<li>Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Lipids of mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).</li>
<li>Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmin+cytoskeleton+linked+to+muscle+mitochondrial+distribution+and+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function.</a> J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).</li>
<li>Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkladal%2C+D+%22What+is+Controlling+Life%3F%22">What is Controlling Life?</a>. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saponin-permeabilized+muscle+fibers+for+the+diagnosis+of+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases.</a> Biofactors. 7, 221-223 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Drug-Induced+Mitochondrial+Dysfunction%22">Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction</a>. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).</li>
</ol>

Saponin permeabilize kalp fiber tekniği, in vitro ve in vivo olarak değerlendirilmesi mitokondriyal Kadıköy oksijen tüketimi arasında eşsiz bir uzlaşma sunuyor. Bu tekniğin avantajları korunur hücresel mimarisi olarak izole mitokondri göre fizyolojik önemi artan içerir. Plazma zarı bozulmuş olsa da, mitokondri 12 olmak üzere hücre içi membran yapılar, 14, sarkoplazmik retikulum 14, myofilaments ve 1, 17 hücre iskeleti bozulmadan kalır . Ayrıca, mitokondri ve ...

<table><tbody><tr><td>100% Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC600</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5&amp;#8242;-difosfat monopotasyum tuzu dihidrat (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini, esasen yağ asidi&amp;#8211;içermeyen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>Antimisin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5&amp;#8242;-trifosfat disodyum tuzu hidrat (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Atraktilosid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6882</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum karbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>Karbonil siyanür p-(triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Sitokrom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Ditiyotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Etilen glikol-bis-(2-amino&amp;#8211;etileter)-N,N,N&amp;#8242;,N&amp;#8242;-tetraasetik asit (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Glutamik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27647</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td>Ketaset</td></tr><tr><td>Laktobiyonik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Malik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-Tetrametil- p-fenilendiamin dihidroklorür (TMPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>Oligomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Fosfokreatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum siyanür</td><td>Fluka</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum pentobarbital</td><td>Ceva Sante Animale</td><td>1715 138</td><td>Kons. 54.7 mg/ml</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Süksinik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>Rompun</td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oroboros Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>15ml polipropilen santrifüj tüpleri</td><td>VWR international</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>50ml polipropilen santrifüj tüpleri</td><td>VWR international</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>Düz kuyumcu pensi</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-50B</td><td></td></tr><tr><td>Eğri kuyumcu pensi</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-57B</td><td></td></tr><tr><td>Düz cerrahi makas</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-402</td><td></td></tr><tr><td>Steril cerrahi bistüri ucu</td><td>VWR international</td><td>BD371610</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&amp;mu;m şırınga filtreleri</td><td>VWR international</td><td>CA28145-485</td><td></td></tr><tr><td>pH metre</td><td>VWR international</td><td>CA11388-308</td><td></td></tr><tr><td>Cam Petri kapları</td><td>VWR international</td><td>89000-300</td><td></td></tr><tr><td>12 kuyucuklu polistiren doku kültürü plakaları</td><td>VWR international</td><td>82050-926</td><td></td></tr><tr><td>Plaka karıştırıcı</td><td>VWR international</td><td>97042-594</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand mikro manyetik balıklar</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-511-67</td><td></td></tr><tr><td>Hassas terazi</td><td>VWR international</td><td>CA11278-162</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;mu;l Hamilton mikro şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-1</td><td></td></tr><tr><td>25&amp;mu;l Hamilton mikro şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-7</td><td></td></tr><tr><td>50&amp;mu;l Hamilton mikro şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-5</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene sıkmalı şişeler</td><td>Wilkem Scientific</td><td>LNA2407-1000</td><td></td></tr><tr><td>Polistiren tartım kapları</td><td>VWR international</td><td>89106-750</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

söz konusu modelde saponin permeabilize kardiyak elyaf oksidatif fosforilasyon değerlendirmesi

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Mitokondri, enerji metabolizması, oksidatif stres, apoptoz, yaşlanma, mitokondriyal encephalomyopathies ve ilaç toksisitesinin yer olarak mitokondriyal fonksiyon araştırılması kalp fizyolojisi önemli bir parametre temsil eder. Bu göz önüne alındığında, kalp mitokondrial fonksiyonu ölçmek için teknolojiler talep vardır. Mitokondrial fonksiyonu ölçmek için bütüncül bir yaklaşım kullanır Bir teknik Söz konusu modelde oksidatif fosforilasyon (Kadıköy) analizi. Söz konusu modelde Kadıköy değerlendirme ilkesi Clark elektrot kullanan oksijen konsantrasyonu ölçüm etrafında merkezli. Permeabilize elyaf demeti, kapalı oda düşüşler, oksijen, oksijen konsantrasyonu tüketir. Seçilen substrat inhibitörü-uncoupler titrasyon protokolleri kullanarak, elektronlar, mitokondriyal fonksiyon değerlendirme sağlayan, elektron taşıma zinciri belirli siteleri sağlanmaktadır. Kas liflerinin sarcolemma permeabilize, mitokondriyal fonksiyon modelde aynı analizi öncesinde mekanik ve kimyasal hazırlık teknikleri kullanılmaktadır. Kimyasal permeabilization hücresel mimarili korurken seçici hücre zarı perfore saponin kullanmaktadır. Bu kağıt iyice mitokondriyal Kadıköy değerlendirmek için, oksijen tüketimi ölçümleri için saponin tenli kalp lifleri hazırlanmasında yer alan adımları açıklamaktadır. Ayrıca, danışmanlık hizmetlerinin yanı sıra özel substratlar gidermeye, elektron taşıma zinciri belirli siteleri mitokondri fonksiyonunu belirlemek için kullanılıyor olabilir inhibitörleri ve uncouplers sağlanmaktadır. Önemlisi, açıklanan protokol çeşitli hayvan modellerinde ve insan örnekleri kalp ve iskelet doku kolayca uygulanabilir.

Söz konusu modelde oksidatif fosforilasyon analizi ile birlikte Saponin-permeabilize elyaf hazırlama, mitokondriyal fonksiyon bütünleştirici değerlendirme sağlar. Mitokondriyal solunum fizyolojik ve patolojik durumlar mitokondriyal etkileşimleri, morfolojisi ve biyokimya da dahil olmak üzere çeşitli düzenleyici etkileri yansıtabilir.

Söz konusu modelde Saponin permeabilize Kardiyak Elyaf Oksidatif Fosforilasyon Değerlendirmesi

Mitokondriyal fonksiyonun incelenmesi, mitokondrilerin enerji metabolizmasında rol oynamaları nedeniyle kardiyak fizyolojinin önemli bir parametresini temsil eder, ...

Bu prosedürün genel amacı, polarografik ölçümler için saponin permele kardiyak lifler hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle kalbin fareden çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, gevşek bir şekilde birbirine bağlı en fazla altı ila sekiz lif içeren kardiyak lif demetlerinin mekanik olarak hazırlanmasıdır.Ardından, kardiyak demetler saponin ile kimyasal olarak permeabilize edilir. Daha sonra kardiyak demetler, saponinden ve kalan tüm metabolitlerden arındırılmak üzere yıkanır. Sonuç olarak, polarigrafik ölçümler aracılığıyla mitokondriyal oksidatif fosforilasyona dair içgörüler sağlayan sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben Calgary Üniversitesi Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Bölümü'nde Dr. Jane Sheer'in laboratuvarından Curtis Huey. Bugün size saponin ile permeabilize edilmiş kalp liflerinin hazırlanma prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, in situ mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu değerlendirmek için kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamak için bir deniz kalbi çıkarın ve buz üzerinde RP çözeltisi içeren bir Petri kabına yerleştirin. Bir disseksiyon mikroskobu kullanarak, tüm bağ dokusunu ve/veya yağları dikkatlice temizleyin.Kalbi septum boyunca ikiye bölün ve sol ventrikülün endokardiyum yüzeyinden keserek 10 ila 25 mg yaş ağırlıkta doku çıkarın. Miyokarddaki mekanik hasarı en aza indirmek için insizyonun lif yönü boyunca yapıldığından emin olun. Diseke edilen doku alt örneğini, buz üzerinde RP çözeltisi içeren ayrı bir Petri kabına yerleştirin.Kalbi, lif yönü boyunca 1 ile 1,5 milimetre çapında boyuna şeritler halinde kesin. Şeritleri, yüksek dikkat ve keskin pensler kullanarak bir skalpel yardımıyla iki ile dört milimetre arasındaki uzunluklara getirin. Lif demetlerini mekanik olarak ayırın.Final fiber demetleri, küçük temas alanlarıyla birbirine bağlanmış maksimum altı ila sekiz fiber içermeli ve ıslak ağırlığı bir ila üç miligram arasında olmalıdır. Görsel olarak, kalp dokusu orijinal kırmızı renkten soluk pembe bir renge dönüşmelidir. Kalp fiber demeti hazırlama işlemine, 12 kuyucuklu bir plakayı buz üzerine yerleştirerek başlayın.Kalsiyum kontaminasyonunu en aza indirmek için kuyucukları RP solüsyonu ile durulayın. Kuyucuklardan birine, mililitrede 50 mikrogram saponin içeren üç mililitre buz gibi soğuk RP solüsyonu ekleyin. Ardından, mekanik olarak hazırlanan fiber demetlerini kuyucuğa aktarın.Fiber demetlerini buz üzerinde, hafifçe karıştırarak 20 dakika inkübe edin. Yeni bir kuyucuğu mirror five çözeltisi ile durulayın ve yeni kuyucuğun içine 10 milliliters buz soğukluğunda mirror five pipetleyin. Kardiyak demetleri kuyucuğa aktarın ve buz üzerinde, hafifçe karıştırarak 10 dakika inkübe edin.İnkübasyonun ardından, mirror five işlemini tekrarlayın. Taze mirror five ile iki ila üç kez yıkayın. Her seferinde kardiyak demetleri 10 mL buz gibi soğuk mirror five içerisine aktarın.Tekrarlayan yıkama adımları, solunum analizinden hemen önce saponin A-T-P-A-D-P'nin ve kalan tüm substratların fiber demetlerinden uzaklaştırılmasını sağlamak içindir. Fiber demetlerini pens yardımıyla emici bir yüzeye bastırıp, tüm nem çekilene kadar veya beş saniye boyunca yüzeyde tutarak tekil fiber demetlerinin ıslak ağırlığı belirlendi. Başka bir emici yüzey kullanarak, pens üzerindeki fazla sıvı uzaklaştırıldı.Teraziyi sıfırlayın ve kütle ölçümü için fiber demetini plastik bir tartım kabına yerleştirin. Kardiyak fiber demetini, buz gibi soğuk yakın beş içeren yeni bir kuyucuğa aktarın. Fiber demeti artık oksijen tüketimi değerlendirmesi için hazırdır.Aşağıdaki validasyon titrasyonları, iki hazneli bir titrasyon enjeksiyon XI grafiği ile gerçekleştirilir. Bu deneyler, respir barometri çalışmalarının deneysel ve diyagnostik amacına bağlı olarak, bireysel bir protokol olarak yürütülebilir veya bir titrasyon protokolüne dahil edilebilir. Burada kullanılan ERO GRA 2K, oksijen konsantrasyonunu ölçebilmektedir.Cihaz, DAT laboratuvar yazılımı yüklü bir bilgisayara bağlanmıştır; bu sayede deney süresi boyunca oksijen konsantrasyonundaki değişiklikler, gerçek zamanlı oksijen tüketim ölçümleri olarak raporlanabilir. Aynalanmış kardiyak lifleri XI greft odacıklarına yerleştirmeden önce, polarografik oksijen sensörlerini (POS) barındıran odacık yuvalarına 2,1 milliliters mirror five ekleyin. Odacıklar kapatıldığında, XI greft odacığında iki milliliters mirror five bulunacaktır.Hava saturasyonu ve mirror five sisteminin 37 °C'de dengelenmesi için yeterli süre tanıyın. Dengelenme tamamlandıktan sonra, kardiyak fiber örneklerini poli-odine florür kaplı manyetik karıştırıcılarla karıştırılan XI greft odaları içerisindeki mirror five sistemine yerleştirin.Oksijenle doldurulmuş bir şırınga kullanarak GRAT kamaralarının oksijen konsantrasyonunu 250 ile 550 micromolar arasına yükseltin. 10 microliter Hamilton şırınga kullanarak oksijen konsantrasyonunun stabilize olması için beş ila 10 dakika bekleyin. Final konsantrasyonu 10 millimolar olacak şekilde kamaraya 10 microliters iki molar glutamat ekleyin.Ardından, oda içerisindeki nihai konsantrasyonun 2 mM olması için ayrı bir Hamilton şırıngası kullanarak 5 µL 800 mM malat ekleyin. Bu titrasyon, bazal kompleks bir destekli solunumu belirlemek için kullanılır. Oksijen akışı, titrasyondan sonra yaklaşık beş dakika içinde stabilize olmalı ve böylece oksijen tüketimi olan durum iki oksijen tüketiminin belirlenmesine olanak sağlamalıdır.İki ila beş dakikalık stabil oksijen tüketiminin ardından DP yokluğunda, final doygunluk konsantrasyonunun 5 mM olması için 25 µL'lik bir Hamilton mikro şırınga kullanarak 20 µL 500 mM A DP ekleyin. Bu konsantrasyon, maksimal durumun belirlenmesine olanak tanıyarak %90'ın üzerinde doygunluğa ulaşmak için kullanılır. Üç. Kompleks bir üzerinden mitokondriyal solunum için ek olarak iki ila beş dakikalık stabil oksijen tüketimine izin verin.Ardından, final konsantrasyonu 10 µM olacak şekilde, 4 mM sitokrom C'den 5 µL eklemek için 10 µL'lik bir Hamilton mikro şırınga kullanın. Bu noktadaki oksijen konsantrasyonu, dış mitokondriyal membran bütünlüğünün kalite kontrol analizini gerçekleştirmek için kullanılır. Stabil oksijen tüketiminin iki ila beş dakika daha sürmesinin ardından, bir TP sentazı inhibe etmek için 4 mg/mL ACIN'den 1 µL ekleyin.Bu titrasyon adımı, iç mitokondriyal membran bütünlüğünü doğrulamak için kullanılır. Repi metric oxphos değerlendirmesinden sonra, kuru ağırlık veya mitokondriyal belirteç tayini için örneği alın. Ardından, mirror five'ı XI Grat cam bölmelerinden çıkarın.Odacıkları distile su ile en az üç kez yıkayın. Ardından, oligomisin gibi etanolde çözünen inhibitörleri uzaklaştırmak için odacıkları %100 etanol ile en az üç kez daha yıkayın.Bunu %70 etanol ile iki ek yıkama ile takip edin. Ardından, sterilizasyon için %70 etanol ekleyin ve XI greft odalarının 30 dakika boyunca buna temas etmesini sağlayın. Son olarak, POS içeren odaları çift distile su ile en az beş kez yıkayın; uygun şekilde hazırlanmış aynalama kalp liflerinde oksijen tüketimi, gösterildiği gibi kalite kontrol protokolü ile değerlendirilir; solunum kontrol oranı veya RCR, perme lif preparasyonlarında oksijen tüketimi ile oksidatif fosforilasyon arasındaki eşleşmeyi temsil eder.RCR, durum üçteki solunum hızının durum ikiye veya alternatif olarak durum üçünün durum dörde oranıdır; iyi kenetlenmiş permeabilize preparatlar, kardiyak preparatları yansıtan 3 ile 6 arasında bir RCR değeri verir. Sitokrom C titrasyonu, doku preparasyonunun uygunluğunun doğrulanması için kullanılır. Sitokrom C, mitokondri iç membranındaki membranlar arası boşlukta bulunan bir proteindir.Mitokondrilerin dış membranı bütün olduğunda, endojen sitokrom C intermembran boşlukta kalır ve ekzojen sitokrom C titrasyonunun respirasyon üzerinde ihmal edilebilir bir etkisi olur. Aksine, mitokondrilerin dış membranı hasarlıysa, endojen sitokrom C intermembran boşluktan salınabilir ve ekzojen sitokrom C eklenene kadar respirasyonu inhibe eder; bu durum, patolojik veya deneysel stresörlerin mitokondri dış membran bütünlüğü üzerindeki etkisinin değerlendirilmesine olanak tanır. CIN eklenmesi, DP'ye katkıda bulunmayan oksijen tüketimi olan sızıntı respirasyonundaki değişiklikleri değerlendirmek için kullanılır. Fosforilasyon kontrol veya yabani tip lifler, CIN eklenmesine duyarlı olmalı ve oksijen akışında önemli bir azalma göstermelidir.Düşük bir RCR ve oligomycin'e karşı azalmış duyarlılığın sonucunda ortaya çıkan nispeten yüksek oksijen akışı, hazırlama sırasında iç mitokondriyal membranının hasar gördüğünü gösterir. Burada görüldüğü gibi, substrat inhibitör ayrıştırma titrasyonlarına yanıt verilmemesi, sasin ve deriyle soyulmuş fiber demetlerinin RP ve mirror five solüsyonlarında uzun süreli inkübasyon sürelerine maruz kaldığının bir göstergesi olabilir. Gelecekteki çalışmalarda, hayvan kurban edilmesi ile oksijen tüketimi ölçümleri arasındaki süreler minimize edilmelidir.Kardiyak fiber demetlerinin polar grafik ölçümleri için nasıl hazırlanacağını az önce gösterdik. Bu prosedürü uygularken, kardiyak fiberlerin mekanik ayrıştırması sırasında son derece dikkatli olunması gerektiğini hatırlatmak önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

respirometric-oxidative-phosphorylation-assessment-saponin

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Aşağıdaki protokol, izole edilmiş çalışan sıçan kalbinde glikoz ve yağ asidi oksidasyon oranlarının kantitatif ölçümü için tamponların hazırlanmasını ve kullanılmasını açıklar. Örneklem analizi ve verilerin yorumlanması için kullanılan yöntemler de tartışılmaktadır.

İzole Çalışma Sıçan Kalp Glukoz ve Yağ Asidi Oksidasyonu Oranlarının Belirlenmesine Yöntemleri

Bu çalışma, insan iskelet kasındaki mitokondriyal oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) kapasitesini ölçmek için in vivo fosfor-31 manyetik rezonans spektroskopisi (31PMRS) tekniğinin fizibilitesini göstermektedir.

Fosfor-31 Manyetik Rezonans Spektroskopisi: Ölçme için Aracı İn Vivo Mitokondriyal Oksidatif Fosforilasyon Kapasitesi

Yüksek çözünürlüklü Solunum mitokondriyal oksijen tüketimini belirlemek için kullanılır. Bu mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri '(I-IV) solunum hızları, maksimum mitokondriyal elektron transport sistem kapasitesi ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü belirlemek için basit bir tekniktir.

Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

Bu iletişim kuralı calorespirometry, ısı dağılımı ve enerji metabolizmasını değerlendirmek için invaziv olmayan bir yaklaşım sağlar solunum yolu tarif etmek ve aynı anda ölçümü anlatılmaktadır. Bu teknik enerji kullanımı aerobik ve anaerobik yolları katkısı toplam hücresel enerji akışı izleyerek değerlendirmek için kullanılır.

Calorespirometry: Hücresel enerji metabolizması araştırmak için bir güçlü, invaziv olmayan bir yaklaşım

Burada, kalp duvarında emici spektroskopisi gerçekleştirmek için perfkullanılmış kalplerinde intra ventrikül optik kateter kullanmanın bir yöntemini tanıtıyoruz. Elde edilen veriler, doku oksijen geriliminin yanı sıra substrat kullanımı ve membran potansiyeli ile aynı anda bu her yerde yapılan hazırlıkta kardiyak performans önlemleri ile ilgili güçlü bilgiler sağlar.

Perfkullanılmış Mammalin kalpleri transmural absorbance spektroskopisi kullanarak hücresel metabolizmayı Izleme için kalp içi yan ateş ışık kateter

Yüksek çözünürlüklü respirometreler kullanılarak oksidatif fosforilasyonun değerlendirilmesi, mitokondri ve hücresel enerji metabolizmasının fonksiyonel analizinin ayrılmaz bir parçası haline gelmiştir. Burada, oda ve mikroplaka tabanlı yüksek çözünürlüklü respirometreler kullanılarak hücresel enerji metabolizmasının analizi için protokoller sunuyoruz ve her cihazın temel faydalarını tartışıyoruz.

Oda ve Plaka Tabanlı Respirometreler Kullanarak Hücrelerdeki ve Dokulardaki Biyoenerjetik Değerleri Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri

Floresan sensörlerine bağlı yüksek çözünürlüklü respirometri, mitokondriyal oksijen tüketimini ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu belirler. Bu protokol, geçirgenleştirilmiş siyatik sinirde mitokondriyal solunum hızlarını ve ROS üretimini değerlendirmek için bir teknik tanımlamaktadır.

Siyatik Sinirde Mitokondriyal Fonksiyonun Yüksek Rezolüsyonlu Respirometri ile Değerlendirilmesi

Atlar olağanüstü bir aerobik egzersiz kapasitesine sahiptir, bu da at iskelet kasını hem at egzersiz fizyolojisi hem de memeli mitokondriyal fizyolojisi çalışmaları için önemli bir doku haline getirir. Bu makalede, at iskelet kasında mitokondriyal fonksiyonun kapsamlı değerlendirilmesi için teknikler açıklanmaktadır.

At İskelet Kasının Yüksek Çözünürlüklü Floro-Respirometrisi

Sperm mitokondriyal fonksiyonunun yüksek çözünürlüklü respirometri ile analizi, kapalı bir oda sisteminde serbestçe hareket eden spermatozoanın oksijen tüketiminin ölçülmesine izin verir. Teknik, sperm mitokondriyal özellikleri ve bütünlüğü hakkında bilgi sağlayan insan spermatozoasında solunumu ölçmek için uygulanabilir.

İnsan Spermatozoasında Mitokondriyal Fonksiyonu Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri

Burada, insan veya fare kasından taze geçirgen iskelet kası liflerinde mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu ölçmek için kapsamlı bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, mevcut mitokondriyal ağları ve membran bütünlüğünü korurken mitokondriyal solunumun gerçek zamanlı olarak ölçülmesine ve yakıt tercihinin ve metabolik esnekliğin değerlendirilmesine olanak tanır.

İnsan ve Fare İskelet Kası Liflerinde Mitokondriyal Solunumun Yüksek Çözünürlüklü Respirometri ile Ölçülmesi

Bu makalede, ex vivo yetişkin zebrafish ventriküllerinin oksijen tüketim oranı ve hücre dışı asitlenme oranını niceltmek için ayrıntılı bir protokol tanımlıyoruz; böylece oksidatif ve glikolitik metabolik kapasitelerini karakterize ediyoruz.

Tüm yenilenen zebrafish ventriküllerinin metabolik aktivitesinin ex vivo olarak değerlendirilmesi ve ekstraselüler akı testi kullanılarak

Öğrenin saponin ile permeabilize edilmiş kardiyak liflerde oksidatif fosforilasyonu değerlendirme yöntemini. Bu protokol fare kalp dokusunda mitokondriyal fonksiyonu yüksek çözünürlüklü respirometri ile hassas şekilde ölçer.

Söz konusu modelde Saponin permeabilize Kardiyak Elyaf Oksidatif Fosforilasyon Değerlendirmesi

Daha fazla video keşfet