Bilinçli Rat hiperinsülinemik öglisemik Kelepçe

Bu prosedürün genel amacı, bilinci açık ve kısıtlanmamış sıçanda insülin duyarlılığını değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle sol karotis arterinin kateterize edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, optimal sonuçlar elde etmek için sağ juguler ven kateterize edilir.

Beş günlük ameliyat sonrası iyileşme süreci boyunca açıklığı korumak için kateterler her gün yıkanır. Nihayetinde, tüm vücut glukoz infüzyon hızlarını gösteren hiperinsülinemik öglisemik klempten sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin temel avantajı, yüksek fizyolojik insülin seviyelerinde tüm vücut glukoz uzaklaştırma hızlarının doğrudan ölçümlerinin elde edilebilmesidir.

Arteryel ve venöz kateterler, cerrahi işlemden önce hazırlanmalıdır. Kateterlerin uçları küt olmalı, heparinli salin ile doldurulmalı ve etanolle sterilize edilmelidir; ayrıca arteriyel kateterler için bir uçtan 2,7 cm, venöz kateterler için ise 3,2 cm mesafeye güvenli bir şekilde tutucu bir bant takılmalıdır. Bu işlemde yaklaşık 300 gram ağırlığında yetişkin erkek Sprague Dawley sıçanlar kullanılır.

Hayvanın başlangıç ağırlığını kaydedin ve ameliyat sonrası ağırlık artışını izlemek için bu ağırlığı kullanın. Aseptik bir cerrahi alanda çalışın. Sıçanı bir anestezi kutusuna yerleştirerek %3 isof fluorine ile anesteziye alın.

Hayvanı cerrahi alandan uzaklaştırın ve boyun ile omuzlar etrafındaki tüyleri temizleyerek insizyon bölgesini hazırlayın. Tüyler temizlendikten sonra, anestezinin yaklaşık %2 isoflurane ile sürdürülmesini sağlamak için hayvanı bir burun konisine yerleştirin. Hayvanı cerrahi masaya sabitleyin.

Ayak ve/veya göz reflekslerinin varlığını kontrol ederek sıçanın tamamen anestezi altında olduğundan emin olun. Kesi bölgesini %70 etanol ile temizleyin, ardından Betadine ile sürterek temizleyin ve tekrar %70 etanol ile temizleyin. Prosedürün ilk adımı, sternumun 10 millimeter üzerinde küçük bir dikey orta hat kesisi yapmaktır.

Dokuyu künt diseksiyonla uzaklaştırmak ve sol sternal mastoid kasını açığa çıkarmak için kavisli mikro diseksiyon pensleri kullanın. Sol karotis arterinin yaklaşık bir santimetresini ortaya çıkarmak için bu kası geri çekin. Bağ dokusunu nazikçe ayıklarken karotis arterini yerinde tutmak için arterin altına mikro diseksiyon pensleri yerleştirin.

Hem artere hem de sinire zarar vermeden vagus sinirini arterden ayırmak önemlidir. Sefalik ucu bağlamak için steril 4-0 ipek sütür kullanın. Damarı tırtıklı mikro diseksiyon pensi ile klempleyin.

Ligatürlü bölgeyi delin. 21 gauge ven ejekt çoklu örnek alma lümen adaptörü ile işlemi tamamlayın. Kateterdeki paslanmaz çelik tıpayı çıkarın ve artere yerleştirmek için steril bir kateter introdüsörü kullanın.

Kateterin sabitlendiğinden emin olmak için pens kullanın. Mikro disseksiyon pensini serbest bırakın, arteri klempleyin ve kateteri boncuğa kadar yerleştirmeye devam edin. Bu noktada, kateterin ucu aortik arkta olmalıdır.

Boncuğun altına iki, üstüne ise bir dikiş atarak sabitleyin ve hattı mililitre başına 10 ünite heparinli salin ile yıkayın. Kateterin örnekleme yapacağını doğrulamak için kateterin dış ucunu paslanmaz çelik bir tıpa ile tekrar kapatın. Ardından, sağ eksternal juguler veni açığa çıkarmak için dokuyu künt diseksiyonla ayırın, veni dikkatlice izole edin ve sefalik veni ligatüre edin.

İpek sütür ile bitirin. Venle 21 gauge venle ponksiyon yapın. Multis örnek alma lümen adaptörünü çıkarın.

Paslanmaz çelik tıpayı kateterden çıkarın ve steril bir kateter yerleştirici kullanarak kateteri boncuğa kadar yerleştirin. Boncuğun altına iki, üzerine ise bir dikiş atarak sabitleyin. Ardından hattı mililitre başına 10 ünite heparin içeren buzlu salinle yıkayın.

Kateterin örnekleme yapacağını doğrulamak için, kateterin dış ucunu 14 gauge kör uçlu iğne kullanarak paslanmaz çelik bir tıpa ile tekrar kapatın, deri altında tünelleme yapın ve sırtın kürek kemikleri arasında bir insizyon gerçekleştirin. Ardından, kateterleri iğnenin içinden geçirerek sırt kısmından çıkmalarını sağlayın. Her bir kateterin yaklaşık dört santimetresi görünür olmalıdır.

0,5 santimetre uzunluğunda Tigon S 50 HL tıbbi tüp kesin ve her iki eksternalize kateterin etrafına yerleştirin. Venler için mavi bantla, arterler için ise kırmızı bantla sabitleyin. Geçirgenliği doğrulamak için kateterleri tekrar test edin, ardından pıhtılaşmayı önlemek için mililitre başına 150 ünite heparinli salin ile yıkayın ve doldurun.

Tüm kesiler 3-0 ipek sütürle kapatın. Sıçanı, yiyeceklere kolayca erişebileceği, önceden ısıtılmış temiz bir kafese yüzüstü (prone) pozisyonda yerleştirin. Sıçan tam hareket kabiliyetini ve uyanıklığını geri kazandığında, onu ana kafesine döndürün.

Sırtın iyileşmesi için üç ila beş gün bekleyin; bu süre zarfında enfeksiyon, ağrı ve kilo değişimlerini günlük olarak izleyin. Kateter açıklığının çalışma boyunca korunması önemlidir. Ameliyat sonrası her gün, bir mililitrelik slip uçlu şırıngaları mililitre başına 150 ünite heparinli salin ile doldurun ve 22 gauge küt uçlu iğne ile kapatın.

Küt uçlu iğne, diğer ucunda 23 gauge paslanmaz çelik tüp konnektörü bulunan 20 santimetre uzunluğundaki PE 50 tüpünün içine yerleştirilir. Hat üzerindeki tüm hava kabarcıklarının temizlendiğinden emin olun. Sıçandan dışarı çıkarılan arter hattını, tıpanın hemen altından hemostatlar ile klempleyiniz.

Başka bir hemostat çifti kullanarak çelik kateter tıpasını çıkarın. Şırıngaya bağlı olan tüp bağlantı aparatını arter hattına yerleştirin ve dışarı çıkarılmış arter kateterini kapatan hemostatları serbest bırakın. Ardından, kateterdeki arteriyel kanı şırıngaya aspire edin.

Kateterle çekim kolayca yapılamıyorsa, uçtaki tıkanıklığı gidermek için kateter yoluyla çok az miktarda çözeltiyi çok nazikçe içeri itmek gerekebilir. Kateterin yolu açılmış sayılır. Kan şırınga klemense ulaştığında, 1 mL'lik şırıngaya yakın olan P 50 hortumunu kapatın ve şırıngayı atın.

Taze heparinli buzlu salinle doldurulmuş yeni bir şırınga ile değiştirin. Tüpü klempten kurtarın ve yeni şırıngayı dik tutarken, hava kabarcıklarını yukarıya ve hattan uzağa itmek için yeni şırıngaya hafifçe vurun. Kateter hattı temizlenene ve kandan arınana kadar heparinli salin enjekte edin.

Arter hattını, boru bağlantı parçasının hemen altından klempleyiniz. Şırınga konnektörünü arter kateter hattından çıkarınız ve yerine paslanmaz çelik boru tıpasını takınız. Dışarı çıkarılmış arter kateterini tıkayan hemostatlari serbest bırakınız.

Bu prosedürü venöz hat için tekrarlayın. Düşük venöz basınç nedeniyle örnekleme yapılamayabilir. Genel olarak, heparinli salin minimum dirençle infüze edilebiliyorsa, kateterin ven içinde iyi konumlandığı söylenebilir.

Prosedüre başlamadan önce hayvanlar tartılmalı, çözeltiler hazırlanmalı ve klempe aparatı kurulmalıdır. Hayvan tartılıp kateter açıklığı onaylandıktan sonra, hayvanı hareketi sınırlayan ancak tamamen engellemeyen altlıklı küçük bir kaba yerleştirin. Bu çalışmada kullanılan sıçanlar en az beş saat boyunca aç bırakılmış ve ameliyat sonrası kilo alımı gerekliliklerini karşılamıştır. Sıçanın ağırlığı, burada gereken insülin miktarını belirler.

Kilogram başına dakika başına dört mili ünite, dakika başına iki mikrolitre hızında uygulanır. %50 dekstroz çözeltisi hazırlayın ve burada her iki çözeltinin de yaklaşık iki saat yetecek miktarda olduğundan emin olun; üç mililitrelik şırıngalar kullanılır. Artık klemp düzeneğini kurmaya hazırsınız.

Hatlarda ve infüzyon pompalarında burada görüldüğü gibi kurulum yapın. Glikoz ve insülin şırıngalarını şırınga pompasına yerleştirin. Hatları klempleyin ve deneye başlamadan önce sıçanın 30 dakika boyunca dinlenmesini sağlayın.

Prosüdüre başlamak için, bazal insülin ve hematokrit örneği alın; hematokrit örnelemesi, deney boyunca kan hacminin korunduğundan emin olmayı sağlar. Genellikle hematokrit seviyeleri, başlangıç değerinin %10'undan fazla düşmemelidir. Bazal glikoz örneği alın ve klemplenecek glikoz seviyesini belirleyin.

Burada glisemiyi U seviyesinde veya 5 mM değerinde sabitliyoruz. Pıhtılaşmayı önlemek için her kan örneğinden sonra arteryel hattı düşük hacimli 10 ünite/mL heparinli salin ile yıkayın. Sabitlenecek glukoz seviyesi belirlendikten sonra insülin solüsyonu infüzyonuna başlayın.

Kan glukozunu beş ila 10 dakikalık aralıklarla kaydedin ve kararlı bir durum elde edilene kadar glukoz infüzyon hızını gerektiği şekilde ayarlayın. Bu genellikle deneme yanılma yoluyla ilerleyen bir süreçtir ve 30 dakikadan iki saatin üzerine kadar sürebilir. Glisemiyi korumak için gereken glukoz seviyesi, deneysel protokole bağlıdır.

Türlerin ve koşulların klemplenmiş sayılabilmesi için, art arda alınan üç okumanın belirlenmiş bir aralıkta olması gerekir. Birbirine yaklaşık bir milimolar yakınlıktaki üç okuma, glikoz seviyelerinin kararlı bir duruma ulaştığı anlamına gelir. Glisemiyi 30 dakikalık bir süre boyunca korumak için gereken glikoz infüzyon hızı belirlenirken, bu süre zarfında en az ek kan örnekleri alınabilir.

Klempleme işlemi tamamlandıktan sonra ikinci bir plazma insülin hematokrit örneği alınmalıdır. Hayvanlar daha ileri testler için kullanılabilir veya daha sonraki analizler için doku toplandıktan sonra ötanazi edilebilir. Hayvanın durumuna bağlı olarak, doğru şekilde uygulandığında kateter hatları beş ila yedi gün boyunca açık kalabilir.

Klemçleme prosedürü ile kararlı durum insülin duyarlılığı ölçülebilir. İnsülin ve glukoz seviyelerinin yanı sıra glukoz infüzyon hızlarının ve hematokrit değerlerinin kaydedilmesi esastır. Glukoz seviyeleri 30 dakikalık bir zaman dilimi boyunca birbirine bir milimolar yakın kaldığında kararlı duruma ulaşılmış olur.

Glikoz infüzyon hızı, euglisemiyi korumak için gereken ekzojen glikoz seviyesini ortaya koyar; burada hız, tek bir ortalama zaman noktası yerine zamana göre grafikleştirilmelidir. Hem açlık hem de klempli insülin seviyeleri raporlanmalıdır. Bu ölçümler, insülinin başarıyla verildiğini teyit eder ve tedavi grupları arasındaki insülin yanıtındaki herhangi bir farkı tespit eder; başlangıçta ve işlemden sonra hematokrit seviyelerinin tekrar ölçülmesi, deney süresince seviyelerin başlangıç değerinin %5'inden fazla düşmediğinden emin olmayı sağlar.

Tüm vücut ve dokuya özgü glukoz kullanımını değerlendirmek için izotopik izleyici uygulaması gibi diğer yöntemler kullanılabilir.