Fare diş dokusu kesitlerinde bakterilerin yerinde tespiti

Patojenik bakterilerle enfekte edilmiş bir fare diş eti bölümü alın, bakteriyel DNA'ya erişim için önceden tedavi edilmiş.

Bakteriyel DNA'yı hedefleyen digoksigenin etiketli bir DNA probu ile bir tampon uygulayın.

Numune kurumasını önlemek için bir kapak ve sızdırmazlık takın.

DNA'yı denatüre etmek için ısı ekleyin, ardından sıcak ve nemli koşullarda kuluçka yapın ve prob hibritleşmesine izin verin.

Sürgüyü soğutun ve kapak kaydırmasını çıkarın, ayrıca açılan probları çıkarmak için tampon ile birkaç kez yıkayın.

Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bir bloklama çözeltisi ekleyin.

Digoksigenine bağlanan enzimle konjuge edilmiş antikorlarla kuluçka yapın.

Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkama.

Endogen enzimi seçici olarak inaktive etmek için bir inhibitör ekleyin.

Enzimle reaksiyona girerek renkli bir çökelti veren bir substrat uygulayın.

Fazla substratı çıkarmak için suyla durulayın.

Çekirdekleri boyamak için bir boya ekleyin.

Fazla boya gidermek için yıkayın.

Etanolde kurutma ve doku şeffaflığını artırmak için ksilen ile tedavi edin.

Bölümü monte et.

Mikroskop altında, kesitteki bakterileri görselleştirin.

Önce slaytları 2x SSC'ye 20 dakika batırarak yerinde başlayın. Bu arada, etiketlenmiş probu hibridizasyon tamponunda mikrolitre başına 1 nanograma kadar seyreltirin. Negatif kontrol için, etiketlenmemiş probun konsantrasyonunun 10 katı kullanın. Sonra, sondaları 90 derece Celsius'ta 10 dakika ısıtarak denatüre edin ve ardından hızla buz üzerinde soğutun.

Sonra, her slayta proteinaz K ile aynı miktarda sonda seyreltme hacmi uygulanır. Sonra, kayma bölümlerini dikkatlice kapatın ve tırnak ojesi ile kapatın. Şimdi, slaytları PCR makinesi bloğunda 90 derece Celsius'ta 10 dakika ısıtın ve gece boyunca 45 derece nemli kuluçka makinesine aktarın.

Ertesi gün, slaytları yarım saat boyunca 4 derece Celsius'ta soğutun ve ardından örtük kapaklarını dikkatlice çıkarın. Dokular kırılgan. Son olarak, slaytları oda sıcaklığında bir dizi SSC tamponundan geçirin.

Yerinde hibritize edilmiş slaytları MABT'de 5 dakika boyunca yıkayın. Sonra, %1 Tween 20 içine 20 dakika boyunca 50 ila 400 mikrolitre bloklayıcı çözelti uygulayın. Blok kuluçkasından sonra, bloklayıcı çözeltiye 1 ila 1000 anti-DIG alkalin fosfataz antikoru 50 ila 400 mikrolitre uygulanır.

37 derece Celsius'ta 90 dakika boyunca bağlanmasına izin verin. Birincil uygulandıktan sonra, slaytları MABT'de 10 dakika boyunca yıkayın. Sonra, 5 dakika boyunca, slaytları %1 Tween 20 ile tespit tamponuna alın.

Şimdi her slayta 50 ila 400 mikrolitre 1 milimolar levamisol salgılama tampon çözeltisine uygulayın ve 5 dakika kuluçka geçirerek endogen alkali fosfatazı inaktive edin. Sonra, her slayta 1 ila 100 hassasiyet aralığında algılama tamponunda seyreltilmiş 50 ila 400 mikrolitre NBT/BCIP ekleyin ve deneyimlere dayanarak slaytların nemlendirilmiş bir odada 2-3 saat kuluçka beklemesine izin verin.

Slaytları DI suyla durulayın. Sonra, hacim oranında %0,05 ağırlıkta metil yeşili uygulayın ve karşı boyamanın dokuda 37 derece Celsius'ta 10 dakika boyunca etkisi olmasına izin verin. Slaytları tekrar DI suyla yıkayın, ardından %100 etanol ile kurutulun, ardından ksilenle daldırın. Son olarak, 80 mikrolitre montaj ortamı uygulayın ve slaytları kapatın.