Name: Zymography Fonksiyonel Matrix Metalloproteinazlar Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Öğrenin, jelatin zimografi kullanarak matris metaloproteinazların (MMP) aktivitesini nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, hücre kültürü süpernatantlarında ve biyolojik sıvılarda MMP aktivitesini kantitatif olarak analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr. S. Ressler (Moleküler ve Hücresel Biyoloji Bölümü, Baylor College of Medicine) hücre kültürü Süpernatantları MMP&#39;lerin konsantrasyonu artırmak için protein yoğunlaştırıcıların kullanımı önermek için teşekkür etmek istiyorum. Bu proje Bayan Clifford Yaşlı Beyaz Graham donatılmış Araştırma Fonu ve CB NIH / NIAMS (AR059838) hibe ile desteklendi. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. Yükleme ve Jel Koşu <ol><li> Tüm numuneler enzimlerin fonksiyonunu korumak için yeterince hazırlıklı ve toplandıktan sonra hemen kullanılabilir veya -80 dondurularak saklanan olmalıdır ° C Örnekler indirgeyici ajanlar içermeyen (böyle bir β-mercaptoethanol) veya jel yüklemeden önce kaynatılmalıdır. </li><li> Bir kaset içinde jel içeren kese aç kaseti, deiyonize su ile durulayın. <ul><li> Kasetin alt ve üst jel tarak koruyucu bandı çıkarın. </li><li> Çalışan tampon (1X için deiyonize su ile seyreltilmiş) kuyular üç kez durulayın. </li><li> Mini-Cell, kaset küçük yan içe karşı karşıya olduğu sağlamak jel yerleştirin. Jel Gerilim Kama ile yerine kilitleyin. Mini Hücre paralel olarak, bir ya da iki jeller çalışmasına olanak tanır. </li><li> Kuyuları seviyesi üstünde 1X tamponu ile (iç) üst kamara doldurun, herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Sızıntı durumunda, tampon çıkarın ve jel yeniden konumlandırmak. </li><li> 1X tamponu ile alt kamara doldurun. </li></ul></li><li> Iyi bir protein moleküler marker 10 mcL yükleyin. <ul><li> Jel yükleme ipuçları (her bir numune arasında değişmektedir) kullanarak jel kuyulara jel yükleme tamponu ile örnek ve yük eşit miktarda karıştırın. Bu kuyular 20 mcL toplam yüklenebilir. </li></ul></li><li> Mini-Cell kapak yerleştirin ve elektrot kabloları güç kaynağına bağlamak. Güç kaynağı açın ve 90 dakika boyunca sabit 125 V çalıştırmak için ayarlayın. Mevcut dolaşımını gösteren küçük kabarcıkların oluşumu, alt odasının tel kontrol edin. </li><li> Ilk jel çalışırken, bir göstergesi olarak yükleme tamponu dahil Bromophenol Mavi kullanarak, her 15 dakikada bir göç ilerlemeyi izlemek. Göstergesi boya jel alt ulaşıncaya kadar jel çalıştıralım. </li></ol> 2. Jel Renaturing ve Gelişmekte Olan <ol><li> Her jel için, 1X renaturing tampon ve tampon denatüre 200 ml, 100 ml deiyonize su hem de hazırlar. </li><li> Bromophenol Mavi izleme boya jel alt ulaştığında, güç kaynağını kapatın, Mini-Cell açık ve jel çıkarın. Jel bıçak kullanarak (ya da bir tartı spatula) kaset iki tarafı ayırın. Jel yönünü işaretlemek için bir köşe kesin. </li><li> Jel 100 ml renaturing tamponu ile bir kap içine kaset ve yerden dikkatlice çıkarın. Yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> Renaturing tamponu çıkarın ve jel tampon gelişmekte 100 ml. Yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> Gelişmekte olan tamponu çıkarın ve jel, gelişmekte olan tampon 100 mL daha eklemek. 37 ° gece boyunca inkübe edin (16-18 saat) ° C </li><li> Gelişmekte olan tampon çıkartın ve oda sıcaklığında yavaşça sallanarak altında deiyonize su ile üç kez (5 dakika) sonra durulayın. </li><li> Jel, jel boyama sonra daha az ya da görünmez olacak gibi standart protein bantları tam konumlandırma kaydetmek için tarayın. </li><li> Leke Jel 20 ml SimplyBlue Safestain ekleyerek jel. Yavaşça sallanarak altındaki oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> SimplyBlue SafeStain ve yavaşça sallanarak altındaki oda sıcaklığında bir saat için 100 ml veya daha fazla deiyonize su içinde de leke jel çıkarın. </li><li> Daha iyi sonuçlar için, yavaşça sallanarak altındaki oda sıcaklığında bir saat veya daha fazla taze deiyonize su ve inkübe ile değiştirin. </li></ol> 3. Veri Analizi <ol><li> Jel, su ve bir plastik levha koruyucusu yerden dikkatlice çıkarın. </li><li> 300 dpi veya daha yüksek çözünürlüğe sahip jel tarayın. TIFF formatında görüntü kaydetme (Şekil 1A). </li><li> ImageJ (veya başka bir benzer yazılım) ile bant yoğunlukları ölçün. <ul><li> ImageJ (Şekil 1A) TIFF dosya açın. </li><li> Seçerek siyah ve beyaz olarak gözünüzde canlandırın "Image&gt; Yazım&gt; 8-bit" (Şekil 1B). </li><li> En az iki kat daha yüksektir (bu bir yazılım gereksinimi) geniş daha bir dikdörtgen çizim, ilk grup anahat dikdörtgen seçim aracını kullanın. </li><li> "1" tuşuna basın veya "Analiz&gt; Jeller&gt; Seç ilk şeritli" ve grubun ana hatlarıyla olacak. </li><li> Yeni bir dikdörtgen görünür, bir sonraki grup taşımak ve "Analyze&gt; Jeller&gt; Seç sonraki şeritli" seçecektir. Bütün bantları (Şekil 1B) seçilene dek tekrarlayın. </li><li> "3" tuşuna basın veya her bir band (Şekil 1C) Profil arsa üretmek için "Analyze&gt; Jeller&gt; Arsa şerit" seçeneğini seçin. </li><li> Ilgi tepe tamamen kapalı bir alan olduğunu, bu nedenle temel çizgiler çizmek için, düz bir çizgi seçimi (zaten otomatik olarak seçili olmalıdır) kullanın. </li><li> Değnek aracını seçin ve seçmek için her tepe noktası içini tıklatın. </li><li> Seçilen her pik alanı içeren bir tablo elde etmek için "Analyze&gt; Jeller&gt; Etiket tepeler" seçin. Bu veriler, (F gibi çizilebilirigure 1D) veya seçilen bir grubun değerine normalize edilebilir. Bu normalleşme, sonuçların istatistiksel olarak anlamlı belirlemek için çeşitli çoğaltmak jeller değerler havuzu özellikle önemlidir. </li></ul></li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Biz, MMP-2 (Şekil 1A) farklı miktarlarda içeren farklı hücre kültürü süpernatantlar yüklü 11 kuyusu olan bir jel göstermektedir. Bu jel, doğrudan gözlem, MMP-2 konsantrasyonları bazı kuyuların arasında belirgin farklılıklar gösterir. Örneğin, kuyular # 4 ve 5 çok daha iyi # 11 veya # 10 MMP-2 içerdiği açıktır. Bantlar objektif ölçümü için de # 11 ve kuyu # 4 ve 5 ve yaklaşık 2 kat fark arasında MMP-2 miktarlarda yaklaşık 4 kat fark teyit ImageJ yazılım (Şekil 1B-D) ile dansitometrisi kullanmış MMP-2 de # 10 ve kuyu # 4 ve 5 arasında tutarındadır. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1, MMP-2 jelatin zymography Algılama . Jelatin jel Taranan görüntü. Peki numaraları jel üst kısmında gösterilir. B, Aynı jel gibi siyah ve beyaz dansitometrisi için gösterilir. Her bandın ImageJ bir dikdörtgen ile seçildi. C, A ve B iki örnek gösterilen jel dansitometrisi profilleri (bantları # 4 ve # 11). Kapalı bir alan oluşturmak için her tepe dibinde düz bir çizgi çizildi. D, A ve B # 1 bant yoğunluğu önce (sol) ve sonrası (sağ) normalleştirme gösterilen jel için pik alanları Arsa. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Bu rakam zymography yarı-kantitatif bir teknik olarak nasıl kullanılabileceğini göstermektedir . 7 kuyularda üst üste seri dilüsyonları (01:01 dilüsyonları adımlarla) yüklenir ve pro-MMP-2 ve MMP-2 hem de bant yoğunlukları ölçüldü.

<ol><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li>
<li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteinases+and+their+inhibitors+-+diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop%22%5BJournal%5D)">Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li>
<li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+regulators+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li>
<li>Lagente, V., Boichot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+matrix+metallopreoteinases+in+the+inflammatory+process+of+respiratory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).</li>
<li>Rodríguez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metallopreoteinases%3A+what+do+they+not+do%3F+New+substrates+and+biological+roles+identified+by+murine+models+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).</li>
<li>Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+%28MMPs%29+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+%28TIMPs%29%3A+positive+and+negative+regulators+in+tumor+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion.</a> Semin. Cancer Biol. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochem. , 102-196 (1980).</li>
<li>Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+matrix+metalloproteinases+%28MMPs%29+activities%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review.</a> Biochimie. 87, 265-272 (2005).</li>
<li>Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Biotechniques. 38, 73-83 (2005).</li>
<li>Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+activity+assays%3A+importance+of+zymography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).</li>
<li>Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+zymography%3A+detection+of+pictogram+quantities+of+gelatinases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases.</a> Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).</li>
<li>Yu, W. H., Woessner, J. F. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-enhanced+zymographic+detection+of+matrilysin+and+collagenases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases.</a> Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).</li>
</ol>

Biz, MMP-2 hücre kültürü Süpernatantları zymographic analizi gerçekleştirmek için nasıl göstermiştir. Ampirik ilgi kökeni ve MMP bağlı olarak örnek bir jel üzerinde yük miktarı tespit edilmelidir. Sadece bir proteaz bant alanında sindirimi çok substrat var çok yüklenirken biraz algılanmasını önlemek çok Yükleniyor doygunluk yol açabilir. Gerekirse, örnek, yükleme tamponu ya da gelişmekte olan zaman ile karıştırılarak önce deiyonize su ile seyreltilmiş de 4 saat için bir gecede indirilmiştir. Bu konsantratörleri (örneğin Millipore katalog # UFC803024) kullanarak bir çözüm proteinlerin konsantre olmak da mümkündür. Bantlar zor görünür kalırsa, hatta 48 saate kadar, uzun bir süre için jeller geliştirmek için gerekli olabilir. Doku kültürü süpernatantlar örnekler hazırlarken, fetal sığır serumu (ve diğer sera) sonuçları etkileyebilir MMP&#39;ler içerdiğini belirtmek gerekir. Bu nedenle, serum serbest ortamda kültürden sonra bizim süpernatantlar toplamak. Protokolün paragraf 2.9 ve 2.10 &#39;da açıklanan yıkar sindirilir bantların boyama arka plan çıkarmak için gereklidir. Daha uzun yıkama süreleri boyunca substrat jel boyama daha fazla arka plan kaldırmak, ancak aynı zamanda loş. Uzun yıkama süreleri gerekli ise, jel, en iyi kontrast ile tarama seçmek için birkaç saatte bir tarama önermektedir. Bu teknik diğer MMP&#39;ler tespit etmek için kullanılabilir. Örneğin, jelatin tercih ettikleri substrat olarak MMP-9 daha düşük bir oranda MMP-1, MMP-8 ve MMP-13 Jellerin tespit ve olabilir. Kazein, MMP-11 için tercih edilen substrat ve algılama MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 ve MMP-13 için de sağlar MMP-1 ve MMP-13 en iyi kollajen zymography tespit 9 - MMP-7 (matrilysin) ve kolajenazlar (MMP-1 ve MMP-13), kazein veya Jellerin düşük seviyelerde tespit etmek zordur. Jel yükleme sırasında örnek heparin eklenmesi için algılama sınırı MMP-7 önemli ölçüde artırır. MMP-1 ve MMP-13, heparin elektroforetik vadede şekilde 12 altında zaten sonra jel eklenecek gerekiyor. Zymography enzimlerin denatürasyon ve Yeniden doğallaştırmanın sonra enzimatik aktivite ölçer, örnek mevcut tüm MMP aktivitesini ölçmek. Bu enzimler, pro-enzimler ve endojen inhibitörleri (örneğin TIMP-2) bağlı enzimler içerir. Bu örnek MMP aktivasyonunun aktif enzim grubun yoğunluğu karşılaştırarak ve biraz daha yüksek moleküler ağırlığa sahip olan, pro-enzim düzeyini belirlemek için ancak mümkündür. Zymography genellikle bir MMP tanımlamak için yeterli değildir. Karşılaştırma bilinen molekül ağırlığı standartları ile MMP göç düzeyi belirlenmesinde yardımcı olur ama bu standartların bazı indirgen içerir ve bu düşürücü olmayan koşullar altında kullanıldığında 9 farklı molekül ağırlıkları gösterebilir dikkat edilmelidir. Test örnekleri aynı jel üzerinde bir çözünür rekombinant MMP yüklemek için bir seçenek. MMP Ancak, molekül ağırlığı belirgin bir değişiklik indükleyen diğer proteinler ile ilişkili olabilir. Seçici MMP inhibitörleri interest.A ikinci tekniği (Western Blot, immünsitokimya veya ELISA) MMP tavsiye edilir kimliği farmakolojik araçları gibi gelişmekte olan tampon kuluçka sırasında jel (ya da yarım bir jel kesme parçası) eklenebilir ilgi MMP belirlenmesinde yardımcı olur. Western blot için algılama sınırları, bu tekniği kullanarak bir potansiyel yalancı negatif sonuçlara yol açan, sık sık zymographic jeller oranla çok daha düşük olduğu unutulmamalıdır.

<table><tbody><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell CE mark elektroforez düzeneği</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Güç kaynağı (model 302)</td><td>VWR international</td><td>93000-744</td><td></td></tr><tr><td>Novex %10 jelatin zimogram jelleri, 1.0 mm, 12 kuyucuklu</td><td>Invitrogen</td><td>EC61752BOX</td><td></td></tr><tr><td>Blue Juice jel yükleme tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>10816015</td><td></td></tr><tr><td>Jel yükleme uçları</td><td>VWR international</td><td>53509-015</td><td></td></tr><tr><td>Protein moleküler ağırlık standardı</td><td>Invitrogen</td><td>LC5800</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine-SDS yürütme tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>LC2675</td><td></td></tr><tr><td>Novex zimogram renatürasyon tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>LC2670</td><td></td></tr><tr><td>Novex zimogram geliştirme tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>LC2671</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection 4490 Fotoğraf Tarayıcı</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ yazılımı</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/</td><td>n/a</td><td>Yazan: W. Rasband, NIH/NIMH</td></tr></tbody></table>

zymography fonksiyonel matrix metalloproteinazlar tespiti

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matriks metalloproteinazlar (MMP) çinko içeren endopeptidazlar. Bunlar peptit bağlarının ayrılması ile proteinlerin bozulmasına yol açar. Yirmiden fazla MMP&#39;ler tespit edilmiş ve kendi yapısı ve substrat özgüllüğü (kolajenazlar, gelatinases, membran tipi [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, ve diğerleri) göre altı gruba ayrılır. MMP hücre işgali, kıkırdak bozulması, doku remodeling, yara iyileşmesi, ve embriyogenez kritik bir rol oynamaktadır. Bu nedenle hem normal süreçleri ve romatoid artrit, kanser veya kronik obstrüktif akciğer hastalığı 1-6 gibi pek çok hastalıkların patogenezinde katılırlar . Burada, MMP-2 (jelatinaz A, Tip IV kollajenaz), yaygın olarak ifade MMP üzerinde durulacak. Biz tarafından 1980 yılında açıklanan ilk olarak C. Heussen ve EB Dowdle 7-10 yaygın olarak kullanılan, çok hassas ama basit ve teknik zymography, MMP-2 hücre kültürü süpernatantlar nasıl algılamak için gösterecektir . Bu teknik, yarı-kantitatif, bu nedenle aynı jel 11 rekombinant MMP bilinen konsantrasyonlarda yüklendiğinde test örneklerinde MMP düzeylerini belirlemek için kullanılan olabilir. Ve jelatin (MMP-2 için substrat), MMP (örneğin hücre kültürü süpernatantlar, idrar veya serum) içeren çözeltiler, sodyum dodesil sülfat (proteinler linearize SDS) içeren bir poliakrilamid jel üzerine yüklenir. Örnek tamponu (jel yükleme kolaylaştırmak için) örnek viskozitesini arttırmak için tasarlanmış, bir izleme boya (Bromophenol Mavi örnek göç izlemek için), denatüre moleküllerin (proteinler linearize) sağlamak ve örnek pH kontrolü. Proteinler, daha sonra sürekli bir göç oranı sağlamak üzere tasarlanmıştır çalışan bir tampon bir elektrik akımı altında göç izin verilir. Göç mesafe proteinin moleküler ağırlığı (küçük proteinler jel ile büyük proteinler daha hızlı hareket ve bu nedenle jel daha aşağı göç) ile ters ilişkilidir. Geçişten sonra, jel proteinler enzimatik aktivite için gerekli üçüncül yapısı, yeniden sağlamak için bir renaturing tampon yerleştirilir. Jel sonra proteaz substrat sindirmek için izin verecek şekilde tasarlanmıştır gelişmekte olan bir tampon yerleştirilir. Gelişmekte olan tampon da aktif MMP-proteolitik olmayan pro-MMP etkinleştirmek için p-aminophenylmercuric asetat (APMA) içerir. Bir sonraki adım, substrat (bizim örneğimizde jelatin) boyama oluşur. Jel kapalı aşırı boya yıkadıktan sonra, proteaz sindirim alanları net bantları olarak görünür. Net grup, daha konsantre proteaz içerir. Band boyanma yoğunluğu gibi ImageJ gibi bir yazılım kullanarak, örnek karşılaştırma için izin dansitometrisi tarafından belirlenir.

Bu protokol, kültür süpernatantlar veya vücut sıvıları matriks metalloproteinazların tespit etmek için bir faaliyet tabanlı test açıklamaktadır.

Zymography Fonksiyonel Matrix Metalloproteinazlar Tespiti

Matriks metalloproteinazlar (MMP'ler), çinko içeren endopeptidazlardır. Peptit bağlarını kopararak proteinleri degrade ederler. Yirmiden fazla MMP...

Bu prosedürün genel amacı, fonksiyonel matriks metalloproteinazları tespit etmektir. Bu işlem, öncelikle örneğe indirgeyici ajanlar içermeyen bir yükleme tamponu ekleyerek zymography için hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, jelatin zymography jeli örnekle yüklenir ve takip boyası jelin sonuna ulaşana kadar çalıştırılmasına izin verilir.Elektroforezin ardından jel yeniden doğallaştırılır, geliştirilir, boyanır ve boyası giderilir. Prosedürün son adımı, veri analizi için jelin taranmasıdır. Nihayetinde, bant yoğunluğu analizi yoluyla örneklerdeki matriks metalloproteinaz aktivitesini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben LER Tıp Fakültesi Moleküler Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'ndeki Dr. Kristin Bitten'ın laboratuvarındanım. Bugün size zymography yöntemiyle matriks metalloproteinazların saptama prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, kültüre edilmiş primer hücreler tarafından salgılanan matriks metalloproteinazları incelemek için kullanıyoruz.Öyleyse çalışmaya başlayalım. Bu protokole başlamadan önce, enzimlerin fonksiyonunu korumak için tüm matris metalloproteinazları veya MMP'leri uygun şekilde hazırlayın. Örnekler hemen kullanılabilir veya -80 °C'de saklanabilir.Burada, jelatinaz A veya tip 4 kollajenaz olarak da bilinen MMP 2, zymography ile MMP aktivitesinin görselleştirilmesini göstermek için kullanılır. MMP enzimleri hazırlandıktan sonra, bir kaset içerisinde jel bulunan %10 jelatin zymogram jel kesesi temin edin. Kaseti deiyonize su ile durulayın.Kasetin altındaki koruyucu bandı ve jelin üstündeki tarağı çıkarın. Kuyucukları tris glisin SDS çalışma tamponu ile üç kez durulayın.Kasetin daha küçük tarafının içe baktığından emin olarak jeli mini hücre elektroforez cihazına yerleştirin. Jeli, jel gerginlik kamasıyla sabitleyin. Cihazın üst haznesini, kuyucukların seviyesinin üzerine çıkacak şekilde tris glisin SDS çalıştırma tamponu ile doldurun ve sızıntı olup olmadığını kontrol edin.Jel elektroforez düzeneğinin alt haznesini de çalışma tamponu ile doldurun. Ardından 10 µL protein moleküler marker yükleyin. Eşit miktardaki örneği, indirgeyici ajanlar içermeyen bir jel yükleme tamponu ile karıştırın.Standart SDS-PAGE'den farklı olarak, örnekleri kaynatmayın ve bunun yerine doğrudan jel kuyucuklarına yükleyin. Jel yükleme uçları kullanıldığında, bu kuyucuklar 20 µL hacme kadar örnek alabilir. Mini hücrenin kapağını kapatın ve elektrot kablolarını güç kaynağına bağlayın.Güç kaynağını açın ve jeli 125 volt sabit gerilimde 90 dakika boyunca çalışacak şekilde ayarlayın. İlk jeli çalıştırırken, akım sirkülasyonunu gösteren küçük kabarcıkların alt haznenin telinde oluşup oluşmadığını kontrol edin. Her jel için, yükleme tamponuna dahil edilen bromo fenol mavisini indikatör olarak kullanarak migrasyonun ilerlemesini her 15 dakikada bir takip edin.Deiyonize su içerisinde 100 mililitre bir kat xmo gram Rena tamponu ve 200 mililitre xmo gram geliştirme tamponu hazırlayın. Bromofenol mavisi takip boyası jelin altına ulaştığında, güç kaynağını kapatın. Mini hücreyi açın ve jeli çıkarın.Kasetin iki tarafını ayırın. Bir jel bıçağı kullanarak, jelin yönünü belirtmek için bir köşeyi kesin. Jeli dikkatlice kasetten çıkarın ve 100 mililitre Rena Buffer içeren bir kaba yerleştirin.Jeli, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin, Rena tampon çözeltisini uzaklaştırın ve jele 100 mililitre geliştirme tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Ardından geliştirme tamponunu uzaklaştırın ve jele 100 mililitre taze geliştirme tamponu daha ekleyin.Jeli 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, geliştirme tamponunu uzaklaştırın ve jeli deiyonize su ile hafifçe çalkalayarak inkübe ederek yıkayın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca bu yıkama işlemini iki kez tekrarlayın.Jeli plastik bir şeffaf dosyaya yerleştirin ve hava kabarcıklarını giderin. Ardından, protein standart bantları jel boyama işleminden sonra neredeyse görünmez hale geleceği için, bantların kesin konumlarını kaydetmek amacıyla jeli bir fotoğraf tarayıcı ile tarayın.Jele 20 mililitre simply blue safe boya ekleyerek jeli boyayın. Jeli oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Hafif ajitasyon altında simply blue safe boyayı uzaklaştırın ve jeli oda sıcaklığında hafif ajitasyon altında 100 mililitre deiyonize su ile yıkayın.Bir saat sonra, taze deiyonize su ile değiştirin ve jeli en az bir saat daha inkübe etmeye devam edin. Verileri sitometri kullanarak analiz etmek için, önce jeli sudan dikkatlice çıkarın ve plastik bir şeffaf dosyaya yerleştirin. Bir fotoğraf tarayıcı kullanarak, jeli 300 dpi veya daha yüksek bir çözünürlükte tarayın.Görüntüyü TIFF formatında kaydedin. Bant yoğunluklarını ölçmek için TIFF dosyasını Image J veya benzeri bir kantifikasyon yazılımında açın. Görüntü tipini sekiz bit seçerek görüntüyü siyah beyaz olarak görselleştirin.İlk bandı çevrelemek için dikdörtgen seçim aracını kullanarak, yüksekliği genişliğinin en az iki katı olan bir dikdörtgen çizin. Jel analizini seçin. İlk şeridi seçin; böylece bant seçilecektir.Ardından yeni bir dikdörtgen belirecektir. Bu dikdörtgeni bir sonraki banda taşıyın ve Analyze gels seçeneğini seçip ardından next lane seçeneğine tıklayın. Tüm bantlar seçilene kadar bu işlemi tekrarlayın.Her bant için profil grafiğini oluşturmak için analyze gels plot lanes seçeneğini belirleyin. İlgilenilen pikin tamamen kapalı bir alan olması için düz çizgi seçimini kullanarak taban çizgilerini çizin. Sihirli değnek aracını seçin ve her piki seçmek için içine tıklayın.Seçilen her bir pikin alanını içeren bir tablo elde etmek için jelleri analiz et (analyze gels) ve pikleri etiketle (label peaks) seçeneklerini belirleyin. Bu veriler olduğu gibi grafiğe dökülebilir veya seçilen bir bandın değerine göre normalize edilebilir. Bu normalizasyon, sonuçların istatistiksel anlamlılığını belirlemek için birkaç replikat jelden gelen değerler birleştirilirken özellikle önemlidir.Burada gösterilen jelin her bir kuyucuğuna farklı bir hücre kültürü yüklenmiştir. Supinatlar farklı miktarlarda MMP two içermektedir. Bu jelin doğrudan gözlemlenmesi, bazı kuyucuklar arasında MMP two konsantrasyonlarında belirgin farklar olduğunu göstermektedir.Örneğin, bantların objektif kantifikasyonu için dört ve beş numaralı kuyucukların her ikisinin de 10 ve 11 numaralı kuyucuklardan çok daha fazla MMP two içerdiği açıktır. Image J yazılımı ile yoğunluk sitometrisi yapılmıştır. Bu yazılım, mmp miktarında yaklaşık dört katlık bir fark olduğunu ortaya koymuştur.Kuyu 11 ile kuyu dört ve beş arasında iki miktar farkı bulunmaktadır. Benzer şekilde, MMP2 miktarlarında kuyu 10 ile kuyu dört ve beş arasında iki kat fark gözlemlenmiştir. Burada size fonksiyonel metriklerin nasıl tespit edileceğini gösteriyoruz.Metal persis xog tarafından gerçekleştirilmiştir. Bu prosedürü uygularken, örneğinizi kaynatmamanız gerektiğini hatırlamak önemlidir. Aksi takdirde, jelinizde herhangi bir bant göremezsiniz.İşte tamamı. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneyinizde başarılar dileriz.

detection-of-functional-matrix-metalloproteinases-by-zymography

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yazıda son derece parallelizable şekilde tek bir molekül düzeyinde enzimatik proteolizin yürürlüğe etkisini incelemek için manyetik cımbız kullanımı açıklanır.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

Bu videoda, biyolojik örneklerdeki proteolitik aktiviteyi analiz etmek için elektroforetik bir teknik olan zimografi uyguluyoruz.

Floresan Peptit Zimografi: Zymogram Jellerinde Florojenik Substratlar Kullanılarak Proteaz Aktivitesini Tespit Etmek İçin Modifiye Edilmiş Bir Teknik

Bu video, hücre kültürü süpernatanında bulunan matris metaloproteinazların (MMP'ler) aktivitesini değerlendirmek için zimografi jel elektroforezi tekniğini göstermektedir. Aktif MMP'ler, boyamayı takiben koyu lekeli bir arka plana karşı şeffaf bantlar olarak görünen bir poliakrilamid jel içine gömülü MMP'ye özgü substratı bozar.

Zymography Jel Elektroforezi: Enzimatik aktiviteyi değerlendirerek matris metaloproteinazları tespit etmek için elektroforetik bir teknik

Doğru kütle ölçüm proteinlerin soruşturma sırasında önemli bir adımı temsil etmektedir. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi (MS) gibi tespiti için kullanılabilir ve önemli avantajı tuzları, deterjan ve kirleticilere karşı tolerans. Burada MALDI-MS ile 100 kDa'dan daha büyük proteinlerin analizi için erişilebilir bir yaklaşımı göstermektedir.

Uçuş lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman sağlam proteinler (MALDI-TOF) kütle spektrometrik analizi Matris destekli daha büyük 100 kDa

Bu protokol, jelatin ve kollajen I'den oluşan bir 2D karışık matristin nasıl hazırlanacağını ve lineer invadozomaları incelemek için bir 3D kolajen I fünyesinin nasıl hazırlandığını açıklamaktadır. Bu protokoller lineer invadozom oluşumunun, matris bozulma aktivitesinin ve birincil hücrelerin ve kanser hücre çizgilerinin invazyon yeteneklerinin incelenmesine izin verir.

Doğrusal Invadozom Oluşumu ve Aktivitesi Çalışmak İçin 2D ve 3D Matrisler

Burada, proteaz özgüllük ham fare doku belirlemek için bir protokol MALDI-TOF spektrometresi kullanılarak özleri mevcut.

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Burada, floresan peptidler yerli protein yerine parçalanabilir substrat olarak kullanıldığı bir değiştirilmiş zymographic teknik için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Elektroforez floresan peptid zymograms Biyolojik örneklerin daha önceki zymographic teknikleri geniş proteaz tespiti sağlar.

Floresan peptid Zymography tarafından proteaz aktivitesinin algılama

Burada, bir protokol Kapsüllenen ve bir fluorogenic matriks metalloproteinaz (MMP) functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels hücrelerde kültür sunulan-parçalanabilir peptid. Hücresel MMP ve metabolik aktivite doğrudan bir standart Mikroplaka Okuyucu kullanarak hidrojel kültürler ölçülür.

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Onun etiketi saflaştırma, diyaliz ve aktivasyon, bakterilerde çözünür, aktif matriks metalloproteinaz-3 katalitik alan protein ekspresyonunun verimini arttırmak için kullanılır. Protein fraksiyonları SDS-PAGE jelleri ile analiz edilir.

Afinite Kromatografisi Kullanılarak İnsan Matriksi Metalloproteinaz-3'ün Bakteriyel İfadesi ve Saflaştırılması

Proteinazlar bakteriyel patogenez için hayati öneme sahiptir, invazyon ve immün kaçışı sağlar. Bakterilerin sitoplazmik ve membran proteinlerinin aktif formlarında tek aşamalı ekstraksiyonu üzücüdür. Bu video makalesi, jelatinazları tespit etmek ve karakterize etmek için zimografi analizi için Leptospira'nın tüm hücresel proteinlerinin ekstraksiyonunu göstermektedir.

Bakteriyel Jelatinazların Tek Adımda Ekstraksiyonu ve Zymografik Analizi

Öğrenin, jelatin zimografi kullanarak matris metaloproteinazların (MMP) aktivitesini nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, hücre kültürü süpernatantlarında ve biyolojik sıvılarda MMP aktivitesini kantitatif olarak analiz etmenizi sağlar.

Zymography Fonksiyonel Matrix Metalloproteinazlar Tespiti

Daha fazla video keşfet