Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Bu 10 günlük bir fare yavrusu ve ben kuyruk biyopsisi alacağım ve sonra kuyruğundan genomik DNA çıkaracağım. Yapacağım şey kuyruğunun bir kısmını kesmek, kabaca üç milimetre kadar, ve sonra kuyruk parçasını bir einor tüpüne yerleştireceğim ve einor tüpünü kuru buzun üzerine yerleştireceğim. Şimdi, bir fareden diğerine bulaşmayı önlemek için, genellikle tıraş bıçağını son kesimi yaptığım kısımda işaretlerim.

Bu şekilde, bir sonraki fare için, bir sonraki kuyruk biyopsisini almak için temiz bir tıraş bıçağı kullandığımdan emin olacağım. Çöpünüzdeki farklı fareleri ayırt etmek için, fareleri tanımlamanın bir yoluna ihtiyacınız olacak. Bunu yapmanın bir yolu, burada gösterilen bir kulak deliği zımbası kullanarak kulaklarına bir delik açmaktır.

Fareyi nazikçe boynunun ensesinden alın, bu şekilde ters çevirin ve kuyruğunu parmaklarınızın arasına sıkıştırın. Diğer elinizle kulak deliği delinmesini alın ve farenin kulağına hızlı bir şekilde vurun. Bunun ne kadar acısız olduğunu gördün mü?

Tamam, şimdi gördüğünüz gibi bu einor tüplerinde bazı kuyruk parçalarım var ve şimdi onların sindirmesine yardımcı olacak solüsyonları ekleyeceğim. Önce 720 mikrolitre STE solüsyonu ekleyeceğim, sonra da 30 mikrolitre protein ekleyeceğim. Ace K.So işte sindirimden önce kestiğimiz kuyruk parçasına bir bakış.

Şimdi kuyruk parçalarını 55 derecelik bir ısıtma bloğuna yerleştireceğim. Birçok protokol, 55 derecede sürekli hareket sallanmasını gerektirir, ancak benim amaçlarım için bu gerekli olmayacak çünkü kuyruk parçalarını girdaplayacağım. Şimdi kuyruk parçasını iki saniye boyunca girdap haline getireceğim.

Bir, iki. Girdaplamadan sonra, einor tüpünün içinde ne kaldığına bir göz atalım, ve kuyruk parçasının tamamen çözüldüğünü ve proteinaz K'yi 70 santigrat derecede beş dakika boyunca aktive ettiğini görebilirsiniz. Beş dakika buz üzerinde söndürün.

Kuyruk parçalarını bir mikro santrifüjde 10 dakika boyunca tam hızda döndürün. Bu mikro santrifüjde tam hız 13.000 RPM'dir. Sindirim kuyrukları aşağı doğru dönerken, bazı einor tüplerini etiketleyin, einor tüplerini 750 mikrolitre izopropanol ile doldurun.

Sindirilmiş kuyrukları aşağı doğru döndürdükten sonra, saç ve sindirilmemiş materyal tüp dekantının dibinde bir pelet oluşturacaktır. İzopropanol DNA'sını içeren einor tüpüne sindirilmiş materyal, STE ve proteinaz K'yi içeren çözelti, çözeltiden çıkmaya başlayacak, hayalet gibi ve tüy gibi görünecek ve tam orada, bu balonun etrafında yüzen, farenin kuyruğundan izole edilmiş genomik DNA'dır. İzopropanol ve STE çözeltisini karıştırdıktan sonra, genomik DNA çözeltiden çıkacak ve burada bu küçük top olarak görünecek, çökelmiş genomik DNA'yı bir mikro santrifüjde tam hızda beş dakika boyunca döndürün.

Tüpün dibinde peletlenmiş genomik DNA'mıza bir bakış var. Şimdi tüpün içindeki solüsyonu aspire edeceğim, geride sadece genomik DNA topağını bırakacağım. Her seferinde başka bir tüp aspire ettiğimde, boruyu değiştireceğim.

Bu aspiratörün ucundaki evcil hayvan ucu. STE ve izopropanolü aspire ettikten sonra, genomik DNA peletini yıkamak için bir mililitre %70 etanol ekleyeceğim. Genomik DNA peleti genellikle bir mikro füj tüpünün yan tarafına yapıştığından ve %70 etanolde iyice yıkamak için çıkarılması zor olduğundan, onu burada sahip olduğum mikro füj tüpü rafından geçirmeniz gerekecek.

Bunu böyle yapabilirsiniz. İşte %70 etanol içinde peletlenip yıkandıktan sonra genomik DNA'ya bir bakış. Bunu beş dakika boyunca tam hızda tekrar döndüreceğim ve ardından yıkandıktan sonra genomik DNA peletlerini aşağı indiren %70 etanolü aspire edeceğim.

% 70 etanol beş dakika tam hızda,% 70 etanolü aspire edecek ve DNA'yı beş dakika kurumaya bırakacak. Tüpün dibindeki genomik DNA topağına bir bakış var ve bu, onu elde etmek istediğiniz kadar kuru. Fare kuyruklarındaki genomik DNA topaklarını kuruttum ve şimdi pH sekizde yüz mikrolitre 40 milimolar triss ekleyeceğim.

50 santigrat derecede genomik DNA'ya sahibim, oda sıcaklığından daha hızlı bir şekilde çözeltiye girecek. 50 derecede yaklaşık bir saat sonra, transgenim için hangi farelerin pozitif olduğunu gerçekten anlamak için PCR reaksiyonlarımı çalıştırmak isteyene kadar ya donduracağım ya da dört dereceye koyacağım.