Name: Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Öğrenin, organotipik hipokampal dilim kültürü yöntemini; beyin dokusının diseksiyonu, dilimleme ve membran üzerinde kültürleme adımlarını kullanarak. Bu teknik, hipokampus mimarisini iki hafta boyunca korur ve sinirbilim araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NINDS tarafından finanse edildi - NIH R01NS060756

1. Hipokampal Dilimleri Hazırlama Başlamadan Önce. <ol><li> Teflon levha bir parça yerleştirerek yeni bir bıçak montaj doku dilimleme makinesi hazırlayın. </li><li> % 70 etanol ile silin ve doku kültürü (TC) kaput diseksiyon mikroskobu içine yerleştirilmiş. Davlumbaz, mikroskop, doku dilimleme makinesi ve UV ışığı ile 15 dakika boyunca tüm diseksiyon aletleri sterilize edin. </li><li> Altı iyi TC tabak hazırlayın. Her bir kuyunun 750 mcL dilim kültür ortamı (SCM), başına iyi yer ve hücre kültürü ekler ekleyin. Membranlar altında kabarcıklar ile iyice ıslak emin olun. 35 kuvöz tabak yerleştirin ° C kadar gerekli% 5 CO 2 ile gaz verilerek. </li><li> 100 ml beher içine 50 ml düşük Na + ACSF (çözüm diseksiyon) dökün ve buz-tuz karışımı yerleştirin. Kabarcık düşük Na + ACSF% 5 CO 2 /% 95 O 2 ile renk değişimleri ve ACSF, dondurulmuş ve sıvı solüsyonu (10-20 dakika) bir bulamaç karışımı oluşturana kadar . </li><li> P5-P7 sıçan yavru alın. Kadar üç yavrular kullanılabilir. </li></ol> 2. Hipokampal Dilimleri hazırlanması. <ol><li> Hayvan başkanı, keskin bir yardımcı program makas ile kesin. Cildi kesin ve kafatası maruz. Sonra küçük makas ile sagital sütür boyunca interaural hat boyunca yan yana gelen kesme ve kafatası açın. Kemik ve beyin maruz kaldırarak kolaylaştırmak için ön yan yana isteğe bağlı kesim yapılabilir. Yuvarlak bir kaşık mikro spatula ile hızlı bir şekilde beyin kepçe ve yaklaşık 1 dakika süreyle soğuk çözüm diseksiyon bulamaç yerleştirin. 60 mm bir tabağa buz soğuk diseksiyon çözüm ~ 10 ml dökün ve beher çanak beyin transferi. Beyin çözüm diseksiyon ile kaplanmış olmalıdır. </li><li> Altında mikroskop diseksiyon: Yer beyin ve 60 mm çanak alt basıldığında diseksiyon forseps ile orta hat tutun. Ortabeyin bırakarak hemisferlerin ayrı hipokampus kesme aleti kullanın. Hippocampi sonra her yarımkürede maruz kalmaktadır. Sonra yavaşça aracı diseksiyon hipokampus hipokampus kepçe. Hipokampus tamamen izole etmek ve mümkün olduğunca temiz diseksiyon iğnesi kullanın. </li><li> Snipped P1000 filtre pipet ucu hafifçe hipokampus aspirat ve doku dilimleme makinesi teflon levha aktarmak. Konkav hipokampus yerleştirin. </li><li> Koronal bölümleri almak ve aşırı sıvı drenaj hippocampi dik bıçak hizalayın. </li><li> Hippocampi her 400 mikron dilimleyin. </li><li> ~ 10 ml soğuk SCM, dilimleme makinesi, başka bir snipped P1000 filtre ucu ve soğuk SCM kullanarak hippocampi dilimlenmiş bir 60 mm bulaşık ve transfer içine dökün. Kabarcıklar yapmak kaçının. </li><li> Iris spatula ve düz bir spatula yardımıyla hafifçe birbirinden dilim ayırın. </li><li> Iyi tanımlanmış ve hasarsız hasarlı dilim dilim ayırın. </li></ol> 3. Hipokampal Dilimleri Kültür <ol><li> Inkübatör SCM ve hücre kültürü ekler ile altı kuyucuğu getirin. Başka bir snipped P1000 filtre ucu yardımı ile tek tek dilimler, membran üzerine aktarın. Membran başına 4-5 dilimleri yerleştirin. Dilimleri eklemek duvar ya yakın ya da birbirlerine yakın yerleştirmek için dikkatli olun. Gerektiğinde ayrı dilim iris spatula kullanın. Aşırı orta çıkarın. Membran bir dilim mümkün olduğunca az dokunun. </li><li> Geri inkübatör plaka ve kültür 35 ° C ve% 5 CO 2 taşıyın. </li><li> SCM Pasteur pipeti ile aspire TC kaput içinde SCM her 48 saat değiştirin. Taze önceden ısıtılmış SCM de ortalama 750 mcL ekleyin. Membranın altında kabarcıklar oluşur emin olun. </li></ol> 4. Çözümler <ol><li> Düşük Na + ACSF - dilim kültürlere Diseksiyon Çözüm Deiyonize ve steril H 2 O eklemek için: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 500 ml için </td><td> 1000 ml için </td><td> Final Konsantrasyon </td></tr><tr><td> CaCl 2 (1 M) </td><td> 0,5 mL </td><td> 1 ml </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> D-glikoz </td><td> 0,901 g </td><td> 1,802 g </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 0,149 g </td><td> 0,298 g </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 (1 M) </td><td> 2.5 mL </td><td> 5 ml </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 1.092 g </td><td> 2.184 g </td><td> 26 mm </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> 40 g </td><td> 80 g </td><td> 234 mm </td></tr><tr><td> DPBS Fenol Kırmızı Çözüm% 0.5 </td><td> 0,5 mL </td><td> 1 ml </td><td> % 0.1 v / v </td></tr></tbody></table> Mix ~ 30 dk. Steril0.22μm filtre geçişi tarafından ize 4 ° C artık 2 aydan az 50 ml alikotları ve mağaza olun. </li><li> Dilim Kültür Orta (SCM) <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 500 ml için </td><td> 1000 ml için </td><td> Final Konsantrasyon </td></tr><tr><td> MEM Eagle orta </td><td> 4.2 g </td><td> 8.4 g </td><td> 8.4 g / l </td></tr><tr><td> At serum ısı inaktive </td><td> 100 mL </td><td> 200 mL </td><td> % 20 </td></tr><tr><td> L-Glutamin (200 mM) </td><td> 2.5 mL </td><td> 5 ml </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 (1 M) </td><td> 0,5 mL </td><td> 1 ml </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 (1 M) </td><td> 1 ml </td><td> 2 mL </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> İnsülin (1 mg / ml), 0.01 N HCl içinde çözünmüş </td><td> 0,5 mL </td><td> 1 ml </td><td> 1 mg / l </td></tr><tr><td> Askorbik Asit, çözüm (% 25 w / v) </td><td> 0.024 ml </td><td> 0.048 ml </td><td> 0,00125% </td></tr><tr><td> D-glikoz </td><td> 1.16g </td><td> 2.32g </td><td> 13 mm </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 0.22g </td><td> 0.44g </td><td> 5.2 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 3.58g </td><td> 7.16g </td><td> 30 mm </td></tr></tbody></table> Iyice eriyene kadar karıştırın ve oda sıcaklığına getirmek. 1 N NaOH ile pH 7,27-7,28 için ayarlayın. Ölçü ozmolarite. Deiyonize ve sterilize H 2 O. ile 320 mmol / kg ayarlayın Yaklaşık 25-40 ml eklemek için bekliyoruz. Ozmolarite yeniden kontrol edin. Ozmolarite ayarlayarak, *** pH biraz değişebilir, bu tamam, ozmolarite doğru aralığı (317-323) olduğunu daha önemlidir. 0.22 mikron filtre geçişi ile sterilize edin. 20 ml alikotları ve mağaza olun az iki-üç hafta kadar 4 ° C Gluatamine stok: -20 ° C&#39;de 2.5 mL hacimde 200 mM ve mağaza bir konsantrasyon hazırlamak. Askorbik asit stoğu:% 25 (w / v) &#39;lik bir konsantrasyon hazırlamak ve 100 mcL hacimde -20 ° C&#39;de saklanır. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Dilimler diseksiyon kapsamında beyaz, siyah noktalar olmadan bakmak ve iyi tanımlanmış ve hasarsız CA1, CA3 ve dentat girus bölgelerinin. Bakteriyel kontaminasyon kolayca SCM orta veya bulanıklık hareket eden siyah lekeler olarak görülür. Mikroskop altında konulduğunda, dilim yüzey açık ve ayırt edilir hücre organları ile 4 gün sonra kültür temiz görünmelidir. Net hücre gövdeleri görülür ve çok enkaz 4 gün sonra yüzeyini kaplayan, daha sonra sağlıklı bir dilim değildir.

<ol><li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+memory%3A+an+evaluation+of+the+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).</li>
<li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+and+structure+of+the+issue%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation and structure of the issue.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).</li>
<li>Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShepherd%2C+GM+%22The+synaptic+organization+of+the+brain%22">The synaptic organization of the brain</a>. , 5th edn, University Press. Oxford. (2004).</li>
<li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+enhancement+shown+by+whole-cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346, 177-180 (1990).</li>
<li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+green+fluorescent+protein+%28GFP%29+into+hippocampal+neurons+through+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-specific+rules+governing+AMPA+receptor+trafficking+to+synapses+in+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons.</a> Cell. 105, 331-343 (2001).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Esteban, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKA+phosphorylation+of+AMPA+receptor+subunits+controls+synaptic+trafficking+underlying+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity.</a> Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).</li>
<li>Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+in+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging in living brain slices.</a> Methods. 18, 231-239 (1999).</li>
<li>Barria, A., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-specific+NMDA+receptor+trafficking+to+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses.</a> Neuron. 35, 345-353 (2002).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices%3A+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> J Physiol. 550, 135-147 (2003).</li>
</ol>

Bu yöntem 11 ilk Stoppini ve ark tarafından tanımlanan yöntem ve kültür hipokampal dilimleri hızlı bir şekilde sunuyor. Bu protokolün en önemli yönü dilim steril korumak için, bu nedenle uygun steril teknikler kullanmak ve düzgün doku ile temas eden tüm malzeme dezenfekte ve sterilize etmek için kritik öneme sahiptir. Farklı serumlar kaynakları dilimleri kalitesini etkileyebilir. Biz ilk birkaç toplu test tavsiye ederiz. Kontaminasyon tekrarlayan bir sorun ise, inkübatör ...

<table><tbody><tr><td>Hücre kültürü insertleri</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyucuklu plakalar</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Doku Dilimleyici</td><td>Stoelting Co.</td><td>51425/51415</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX7-ILLD2-100</td><td></td></tr><tr><td> Hippocampus diseksiyon aleti</td><td>F.S.T.</td><td>10099-15</td><td></td></tr><tr><td>Büyük kullanım makasları. Perfection</td><td>F.S.T.</td><td>37500-00/37000-00 Sağ/ Sol el</td><td></td></tr><tr><td>İris Spatulası</td><td>F.S.T.</td><td>10093-13</td><td></td></tr><tr><td>Düz spatula</td><td>F.S.T.</td><td>10094-13</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak kaşıklı mikro spatula</td><td>VWR international</td><td>57949-039</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon için tek keskin kenarlı iğne</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72946</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon cımbızı</td><td>Dumont</td><td>#2</td><td></td></tr><tr><td>Küçük diseksiyon makasları</td><td>F.S.T.</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>MEM Eagle besiyeri</td><td>Cellgro</td><td>50-019 PB</td><td></td></tr><tr><td>Isıl olarak inaktive edilmiş at serumu</td><td>Invitrogen</td><td>26050-88</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin (1 mg/ml), 0.01 N HCl içinde çözülmüş</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik Asit, çözelti (%25)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>DPBS içinde %0,5 Fenol Kırmızısı Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr></tbody></table>

organotipik hipokampal dilim kültürler

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Hipokampus, limbik sistemin bir bileşeni, uzun süreli hafıza ve mekansal navigasyon 1 önemli roller oynar. Hipokampal nöron bağlantıları güçlü aktivasyon kısa bir süre sonra gücünü değiştirebilirsiniz. Uzun vadeli potansiyasyonu (LTP) olarak bilinen bu fenomen, saatler veya günler sürebilir ve öğrenme ve hafıza 2 için en iyi aday mekanizması haline gelmiştir. Buna ek olarak, 3 hipokampus iyi tanımlanmış anatomi ve bağlantı sinaptik iletim ve sinaptik plastisite 4 çalışmada klasik bir model sistem yaptı. Hipokampal sinaps fizyolojisi anlayışımız büyüdü ve moleküler oyuncular tespit oldu, sinaptik proteinlerin işlemek için zorunlu bir ihtiyaç haline geldi. Organotipik hipokampal kültürler kolay gen manipülasyon ve hassas farmakolojik müdahale imkanı sunan ancak sinaptik organizasyon korumak, rutin kültür ayrışmış nöronlar yöntemleri daha natüralist bağlamında sinaps fonksiyonu anlamak için kritik. Burada diğer beyin bölgelerine kolayca adapte edilebilir hipokampal dilim hazırlamak ve kültür bir yöntem mevcut. Bu yöntem viral enfeksiyon 5,6 veya biolistics 7 gibi farklı yaklaşımlar kullanarak genetik manipülasyon dilimleri için kolay erişim sağlar. Buna ek olarak, dilim kolayca biyokimyasal testleri 8 için geri olabilir, ya da görüntüleme 9 veya elektrofizyolojik deneylerde 10 mikroskoplar aktarılır.

Biz diğer beyin bölgelerine kolayca adapte edilebilir Organotipik hipokampal dilim hazırlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Beyin dilimlerini bir arayüz oluşturmak için izin gözenekli membranlar ve kültür ortamı üzerine koydu. Bu yöntem, kültür 2 hafta kadar hipokampus brüt mimarisi korur.

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

Limbik sistemin bir bileşeni olan hipokampus, uzun süreli bellek ve uzamsal navigasyonda önemli roller oynar 1. Hipokampal nöronlar ...'yı modifiye edebilir.

Bu prosedürün genel amacı organotipik hipokampal kesitler kültüre etmektir. Bu işlem, öncelikle hipokampusun diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise hipokampusun dilimlenmesidir.Prosedürün üçüncü adımı, hipokampal dilimlerin ayrılması ve sınıflandırılmasıdır. Prosedürün son adımı ise hipokampal dilimlerin kültürüdür. Sonuç olarak, bir diseksiyon skobu veya mikroskop ile görüntüleme yapılarak sağlıklı organik hipokampal dilimler elde edilebilir.Merhaba, benim adım Jimena Opitz ve Washington Üniversitesi'ndeki Dr. Andres bar'ın laboratuvarında araştırmacı bilim insanıyım. Seattle'da, organotipik hipokampus, LICs kültürü prosedürünü uygulamalı olarak göstereceğim. Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler, hipokampusları hızlıca diske etmek ve dilimlemek gerekmesi ile kontaminasyonu önlemek için steril diseksiyon çözeltisi ve dilim kültürüne ihtiyaç duyulması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.Yazılı protokolde açıklandığı üzere, besiyeri üç hafta öncesinden hazırlanabilir ve dört derece Celsius'ta saklanabilir. Hipokampal dilimlemeden önce kültürler hazırlanabilir. Hem doku kültürü kabininin hem de diseksiyon sırasında kullanılacak ekipmanların uygun şekilde sterilize edilmesi gereklidir.Öncelikle, doku kültürü kabininin iç yüzeyini %70 ethanol ile silin. Ardından, diseksiyon mikroskobunu ve tüm diseksiyon aletlerini kabinin içine yerleştirin. Sahneye temiz bir Teflon levha parçası yerleştirip yeni bir bıçak takarak doku dilimleyiciyi hazırlayın.Doku dilimleyiciyi doku kültürü kabinine yerleştirin ve UV ışığı kullanarak tüm yüzeyleri ve ekipmanları 15 dakika boyunca sterilize edin. UV sterilizasyon işlemi tamamlandıktan sonra ışığı kapatın. Doku kültürü kabini içerisinde çalışmaya başlayın.İlk olarak, hipokampal dilimleri kültüre etmek için kullanılacak altı kuyucuklu doku kültürü plakalarını hazırlayın. Altı kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 750 µL SEM pipetleyin. Ardından, steril pensler kullanarak doku kültürü plakasının her bir kuyucuğuna bir hücre kültürü inserti yerleştirin.İnsertin altında hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Her bir hücre kültürü insertinin membranının dilim kültürü ortamı ile ıslatılmış olması önemlidir. Eğer membran kuruysa, hava kabarcığı olup olmadığını kontrol edin.Eğer membran, SCM menisküsünün üzerinde kalıyorsa, kuyucuğa daha fazla besiyeri eklenebilir. Hazırlanan kültür plakalarını bir doku kültürü inkübasyonuna yerleştirin. Gerektiği zamana kadar 35 °C ve %5 karbondioksit değerlerinde ayarlayın.Son olarak, bir buz kovasını buz-tuz karışımıyla doldurun ve çeker ocak içinde çalışırken kovayı baş kesme alanının yanına yerleştirin. 100 mililitrelik bir beherin içine diseksiyon solüsyonu doldurun. Beheri buz-tuz karışımının içine itin ve solüsyonun rengi pembeden turuncuya dönene kadar 10 ila 20 dakika boyunca %5 karbon dioksit ve %95 oksijen ile kabarcıklandırın.Ve diseksiyon solüsyonu, donmuş ve sıvı solüsyonun karışımından oluşan bir bulamaç meydana getirir. Artık diseksiyon ortamı ve doku kültürü plakaları diseksiyon için hazırdır. P3-P7 sargısı.Bu prosedür için yavrular kullanılır. Dilim kültürleri, tek seferde üç yavruya kadar hazırlanabilir. Bu prosedür, tek bir yavru kullanılarak örneklenecektir.Kafası kesilmiş wrap pupasından beyni hızla çıkarın ve bir dakika boyunca Slurry Chill diseksiyon solüsyonu içeren 100 mililitrelik behere yerleştirin. Bu süre zarfında, 60 milimetrelik bir doku kültürü kabının tabanına yaklaşık 10 mililitre buz gibi soğuk diseksiyon solüsyonu ekleyerek bir diseksiyon kabı hazırlayın. Yuvarlak uçlu bir kaşık veya mikro spatula kullanarak beyni 100 mililitrelik beherden soğuk diseksiyon ortamı ile doldurulmuş 60 milimetrelik kaba aktarın. Beynin diseksiyon solüsyonu ile tamamen kaplandığından emin olun.Beyni içeren kabı diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Diseksiyon mikroskobundan bakarak beyni bulun. Beyni görüş alanının merkezine taşımak için steril diseksiyon penseti kullanın.Diseksiyon pensini kabın tabanına bastırarak beyni orta hattan tutun. Hipokampus diseksiyon aracını kullanarak, orta beyni yerinde bırakacak şekilde kortikal hemisferleri orta beyinden nazikçe ayırın; ideal olarak kortikal hemisferleri beynin geri kalanından koparmadan hipokampusu açığa çıkarın. Hipokampus diseksiyon aracını kullanarak hipokampusu bir hemisferden çıkarın.Ardından, hipokampus dışındaki dokuları mümkün olduğunca temizlemek için diseksiyon iğnesini kullanın. İlk hipokampus izole edilip temizlendiğinde, bu işlemi diğer hemisferdeki ikinci hipokampus için tekrarlayın. Sonrasında, bir P 1000 filtreli pipet ucunun ucunu kesmek için steril makas kullanın.Steril bir P 1000 pipete pipet ucu takın. Bir hipokampüsü nazikçe aspire edin ve doku dilimleyicideki Teflon tabaka üzerine yerleştirin. Ardından, benzer şekilde ikinci hipokampüsü dilimleyici üzerine yerleştirin.Hipokampus yarılarını konveks yüzeyleri aşağı gelecek şekilde yerleştirin ve bıçağa dik olarak hizalayıp Teflon tabaka üzerindeki fazla sıvıyı aspire edin. Vibratomu veya mikrometreyi sıfır konumuna getirin. Hipokampusları 400 µm kalınlığında kesitler halinde dilimleyin.Ucu kesilmiş başka bir P 1000 filtreli uç hazırlayın ve bunu steril bir P 1000 pipete takın. 60 milimetrelik steril bir doku kültürü kabına yaklaşık 10 mililitre soğuk SCM dökün. Pipet kullanarak bir miktar ortam ekleyin ve hipokampal dilimleri dilimleyiciden kaba aktarın.Tüm kesitler için transfer işlemini tekrarladıktan sonra kabarcık oluşmasını önleyerek, petri kabını disseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Son olarak, bir iris spatula ve düz bir spatula kullanarak kesitleri nazikçe birbirinden ayırın.Belirgin ve hasarsız dilimleri, hasarlı olanlardan ayırın. Belirgin hipokampal dilimler artık kültüre edilmeye hazırdır. SCM ve hücre kültürü insertleri içeren, önceden hazırlanmış altı kuyucuklu doku kültürü plakalarını inkübatörden çıkarın; ucu genişletilmiş bir P 1000 pipet kullanarak her membrana dört ila beş adet münferit dilim aktarın.Gerektiğinde, dilimleri ayırmak için iris spatulası kullanın. Dilimleri insert duvarına çok yakın veya birbirine bitişik şekilde yerleştirmemeye dikkat edin. Dilimlere dokunmamaya özen göstererek, hücre kültürünün üst yüzeyindeki fazla medyumu aspire edin.Membranı yerleştirin. Son olarak, artık hipokampal kesit kültürlerini içeren plakayı doku kültürü inkübatörüne geri koyun. 35 °C ve %5 karbon dioksit değerlerine ayarlayın.48 saat sonra, doku kültürü kabininde çalışarak plakayı inkübatörden çıkarın. Besiyerini bir pastör pipeti ile aspire edin. Her birine 750 µL önceden ısıtılmış taze SCM ekleyin.Tekrar, hücre kültürü insert membranının altında hava kabarcığı oluşmadığından emin olun. Bu, kültüre edilmeye hazır sağlıklı bir hipokampal kesit örneğidir. Hipokampusun CA1, CA3 ve dentat girus bölgeleri net bir şekilde görülmektedir ve hasarsızdır.Burada, kültür için kullanılmayan hasarlı bir hipokampal kesit gösterilmektedir. Son olarak, bu, dört günlük kültür sonrası sağlıklı bir hipokampal kesit örneğidir. Kesitin diseksiyon mikroskobu altında beyaz göründüğüne ve kesit yüzeyinin temiz olduğuna dikkat edin.Hipokampusun CA1, CA3 ve dentate gyrus bölgeleri net bir şekilde görünür ve hasarsızdır. Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık bir saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, uygun steril tekniklerin kullanıldığını hatırlamak ve dokuya nazik davranmak çok önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, organotipik kültürleme ve hipokampal lizis işlemleri hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Organoptypic hipokampal kesit kültürü...

Nöronal Sakatlık incelenmesi için Organotipik Hipokampal Dilim Kültür Modeli

Bu video, bir sıçan yavrusunun beyninden organotipik hipokampal dilim kültürleri hazırlamak için bir yöntem göstermektedir. Hipokampal dilimlerde hücre canlılığını ve büyümesini teşvik etmek için gerekli olan hipokampusun diseksiyonu, dilimleme ve kültür koşullarında yer alan adımları ana hatlarıyla belirtir ve sonuçta organotipik dilim kültürleri oluşturur.

Bir Sıçan Yavrusunun Hipokampusundan Organotipik Dilim Kültürlerinin Hazırlanması

Ön beyin ve beyincik dilim kültür sistemini kullanarak NG2 hücrelerini ve oligodendrositleri incelemek için bir teknik açıklanmıştır.  Bu yöntem, doku sitomimarisini korurken hücre dışı ortamın kolayca manipüle edilebildiği oligodendrosit soyu içindeki hücrelerin çoğalma ve farklılaşma dinamiklerinin incelenmesine izin verir.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

Çift kayıtlar, tek tek nöronlar arasındaki sinapsların hassas elektrofizyolojik ve farmakolojik karakterizasyonunu sağlayan, sinaptik olarak bağlı iki nörondan eşzamanlı tam hücre yama kelepçe kayıtlarıdır. Burada, elektrofizyoloji için donatılmış herhangi bir laboratuvarda organotipik hipokampal dilim kültürlerinde bu tekniği oluşturmak için ayrıntılı metodolojiyi ve gereksinimleri açıklıyoruz.

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Iskemik beyin hasarı birçok açıdan üreyen veriyor entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri için bir protokol, sunulmuştur. Nöronlarda değişikliklere ek olarak neurovasculature değişiklikleri inceleyerek, bu protokol yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araçtır.

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Bu yöntem, yetişkin nöron in vitro müdahale edilebilmesini sağlar ve kültürlenmiş hipokampus farmakolojik maddelerin doğrudan uygulama için izin verir.

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Organotypic Hipokampal dilim kültürler (OHSC) vivo durumu çok iyi taklit bir vitro modeli temsil. Burada biz vibratome tabanlı açıklar yüksek kaliteli dilimleri tümör hücreleri biyolojik davranışını veya yeni maddeler nöroprotektif potansiyelini değerlendirmek amacıyla elde etmek için iletişim kuralı Dilimleme geliştirilmiş.

Organotypic Hipokampal dilim kültürler çalışma Neuroprotection ve tümör hücrelerinin Invasiveness Model olarak

Fare ön beyninin organotipik dilim kültürlerinde genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı sensör ATeam1.03YEMK'ın hücre tipi spesifik ekspresyonu için bir protokol tanımladık. Ayrıca, nöronlar ve astrositlerde hücresel ATP düzeylerinin dinamik görüntülemeiçin bu sensörünasıl kullanılacağını gösteriyoruz.

FRET tabanlı Sensör ATeam1.03YEMK kullanılarak Fare Beyninin Organotipik Doku Dilimlerinde Hücre İçi ATP'nin Görüntülenmesi

Burada, renal korteks-hipokampus organotipik dilimlerin hazırlanmasını anlatıyoruz. Serumun kademeli ve kontrollü yoksunluğu altında, bu dilimler gelişen epileptik benzeri olayları tasvir eder ve epileptogenezin ex vivo modeli olarak kabul edilebilir. Bu sistem, spontan aktivitenin dinamiklerini izlemek ve epileptogenez boyunca nöroinflamatuar özelliklerin ilerlemesini değerlendirmek için mükemmel bir aracı temsil eder.

Renal Korteks-Hipokampus Organotipik Dilim Kültürlerinde Epileptogenez Modeli

Bu protokol, spontan keskin dalga dalgalanma aktivitesi sergileyen farelerden yatay hipokampal-entorhinal korteks (HEC) dilimlerinin hazırlanmasını açıklar. Dilimler basitleştirilmiş bir arayüz tutma odasında inkübe edilir ve kayıtlar, doku oksijenlenmesini ve ağ düzeyinde aktivitenin kendiliğinden ortaya çıkmasını teşvik etmek için hızlı akan yapay beyin omurilik sıvısı ile su altında koşullar altında gerçekleştirilir.

Spontan Hipokampal Ağ Aktivitesini Araştırmak için Akut Fare Beyin Dilimlemeyi

Bu makale, farelerde yatay hipokampal beyin dilimleri elde etmek için sistematik bir protokolü tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodolojinin amacı, dentat girus ile ilgili nörolojik süreçleri değerlendirmek için perforant yol ve yosunlu lif yolu gibi hipokampal lif yollarının bütünlüğünü korumaktır.

Fare Beyninin Yatay Hipokampal Dilimleri

Öğrenin, organotipik hipokampal dilim kültürü yöntemini; beyin dokusının diseksiyonu, dilimleme ve membran üzerinde kültürleme adımlarını kullanarak. Bu teknik, hipokampus mimarisini iki hafta boyunca korur ve sinirbilim araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

Daha fazla video keşfet