Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

Bu prosedürün genel amacı organotipik hipokampal kesitler kültüre etmektir. Bu işlem, öncelikle hipokampusun diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise hipokampusun dilimlenmesidir.

Prosedürün üçüncü adımı, hipokampal dilimlerin ayrılması ve sınıflandırılmasıdır. Prosedürün son adımı ise hipokampal dilimlerin kültürüdür. Sonuç olarak, bir diseksiyon skobu veya mikroskop ile görüntüleme yapılarak sağlıklı organik hipokampal dilimler elde edilebilir.

Merhaba, benim adım Jimena Opitz ve Washington Üniversitesi'ndeki Dr. Andres bar'ın laboratuvarında araştırmacı bilim insanıyım. Seattle'da, organotipik hipokampus, LICs kültürü prosedürünü uygulamalı olarak göstereceğim. Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler, hipokampusları hızlıca diske etmek ve dilimlemek gerekmesi ile kontaminasyonu önlemek için steril diseksiyon çözeltisi ve dilim kültürüne ihtiyaç duyulması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.

Yazılı protokolde açıklandığı üzere, besiyeri üç hafta öncesinden hazırlanabilir ve dört derece Celsius'ta saklanabilir. Hipokampal dilimlemeden önce kültürler hazırlanabilir. Hem doku kültürü kabininin hem de diseksiyon sırasında kullanılacak ekipmanların uygun şekilde sterilize edilmesi gereklidir.

Öncelikle, doku kültürü kabininin iç yüzeyini %70 ethanol ile silin. Ardından, diseksiyon mikroskobunu ve tüm diseksiyon aletlerini kabinin içine yerleştirin. Sahneye temiz bir Teflon levha parçası yerleştirip yeni bir bıçak takarak doku dilimleyiciyi hazırlayın.

Doku dilimleyiciyi doku kültürü kabinine yerleştirin ve UV ışığı kullanarak tüm yüzeyleri ve ekipmanları 15 dakika boyunca sterilize edin. UV sterilizasyon işlemi tamamlandıktan sonra ışığı kapatın. Doku kültürü kabini içerisinde çalışmaya başlayın.

İlk olarak, hipokampal dilimleri kültüre etmek için kullanılacak altı kuyucuklu doku kültürü plakalarını hazırlayın. Altı kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 750 µL SEM pipetleyin. Ardından, steril pensler kullanarak doku kültürü plakasının her bir kuyucuğuna bir hücre kültürü inserti yerleştirin.

İnsertin altında hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Her bir hücre kültürü insertinin membranının dilim kültürü ortamı ile ıslatılmış olması önemlidir. Eğer membran kuruysa, hava kabarcığı olup olmadığını kontrol edin.

Eğer membran, SCM menisküsünün üzerinde kalıyorsa, kuyucuğa daha fazla besiyeri eklenebilir. Hazırlanan kültür plakalarını bir doku kültürü inkübasyonuna yerleştirin. Gerektiği zamana kadar 35 °C ve %5 karbondioksit değerlerinde ayarlayın.

Son olarak, bir buz kovasını buz-tuz karışımıyla doldurun ve çeker ocak içinde çalışırken kovayı baş kesme alanının yanına yerleştirin. 100 mililitrelik bir beherin içine diseksiyon solüsyonu doldurun. Beheri buz-tuz karışımının içine itin ve solüsyonun rengi pembeden turuncuya dönene kadar 10 ila 20 dakika boyunca %5 karbon dioksit ve %95 oksijen ile kabarcıklandırın.

Ve diseksiyon solüsyonu, donmuş ve sıvı solüsyonun karışımından oluşan bir bulamaç meydana getirir. Artık diseksiyon ortamı ve doku kültürü plakaları diseksiyon için hazırdır. P3-P7 sargısı.

Bu prosedür için yavrular kullanılır. Dilim kültürleri, tek seferde üç yavruya kadar hazırlanabilir. Bu prosedür, tek bir yavru kullanılarak örneklenecektir.

Kafası kesilmiş wrap pupasından beyni hızla çıkarın ve bir dakika boyunca Slurry Chill diseksiyon solüsyonu içeren 100 mililitrelik behere yerleştirin. Bu süre zarfında, 60 milimetrelik bir doku kültürü kabının tabanına yaklaşık 10 mililitre buz gibi soğuk diseksiyon solüsyonu ekleyerek bir diseksiyon kabı hazırlayın. Yuvarlak uçlu bir kaşık veya mikro spatula kullanarak beyni 100 mililitrelik beherden soğuk diseksiyon ortamı ile doldurulmuş 60 milimetrelik kaba aktarın. Beynin diseksiyon solüsyonu ile tamamen kaplandığından emin olun.

Beyni içeren kabı diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Diseksiyon mikroskobundan bakarak beyni bulun. Beyni görüş alanının merkezine taşımak için steril diseksiyon penseti kullanın.

Diseksiyon pensini kabın tabanına bastırarak beyni orta hattan tutun. Hipokampus diseksiyon aracını kullanarak, orta beyni yerinde bırakacak şekilde kortikal hemisferleri orta beyinden nazikçe ayırın; ideal olarak kortikal hemisferleri beynin geri kalanından koparmadan hipokampusu açığa çıkarın. Hipokampus diseksiyon aracını kullanarak hipokampusu bir hemisferden çıkarın.

Ardından, hipokampus dışındaki dokuları mümkün olduğunca temizlemek için diseksiyon iğnesini kullanın. İlk hipokampus izole edilip temizlendiğinde, bu işlemi diğer hemisferdeki ikinci hipokampus için tekrarlayın. Sonrasında, bir P 1000 filtreli pipet ucunun ucunu kesmek için steril makas kullanın.

Steril bir P 1000 pipete pipet ucu takın. Bir hipokampüsü nazikçe aspire edin ve doku dilimleyicideki Teflon tabaka üzerine yerleştirin. Ardından, benzer şekilde ikinci hipokampüsü dilimleyici üzerine yerleştirin.

Hipokampus yarılarını konveks yüzeyleri aşağı gelecek şekilde yerleştirin ve bıçağa dik olarak hizalayıp Teflon tabaka üzerindeki fazla sıvıyı aspire edin. Vibratomu veya mikrometreyi sıfır konumuna getirin. Hipokampusları 400 µm kalınlığında kesitler halinde dilimleyin.

Ucu kesilmiş başka bir P 1000 filtreli uç hazırlayın ve bunu steril bir P 1000 pipete takın. 60 milimetrelik steril bir doku kültürü kabına yaklaşık 10 mililitre soğuk SCM dökün. Pipet kullanarak bir miktar ortam ekleyin ve hipokampal dilimleri dilimleyiciden kaba aktarın.

Tüm kesitler için transfer işlemini tekrarladıktan sonra kabarcık oluşmasını önleyerek, petri kabını disseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Son olarak, bir iris spatula ve düz bir spatula kullanarak kesitleri nazikçe birbirinden ayırın.

Belirgin ve hasarsız dilimleri, hasarlı olanlardan ayırın. Belirgin hipokampal dilimler artık kültüre edilmeye hazırdır. SCM ve hücre kültürü insertleri içeren, önceden hazırlanmış altı kuyucuklu doku kültürü plakalarını inkübatörden çıkarın; ucu genişletilmiş bir P 1000 pipet kullanarak her membrana dört ila beş adet münferit dilim aktarın.

Gerektiğinde, dilimleri ayırmak için iris spatulası kullanın. Dilimleri insert duvarına çok yakın veya birbirine bitişik şekilde yerleştirmemeye dikkat edin. Dilimlere dokunmamaya özen göstererek, hücre kültürünün üst yüzeyindeki fazla medyumu aspire edin.

Membranı yerleştirin. Son olarak, artık hipokampal kesit kültürlerini içeren plakayı doku kültürü inkübatörüne geri koyun. 35 °C ve %5 karbon dioksit değerlerine ayarlayın.

48 saat sonra, doku kültürü kabininde çalışarak plakayı inkübatörden çıkarın. Besiyerini bir pastör pipeti ile aspire edin. Her birine 750 µL önceden ısıtılmış taze SCM ekleyin.

Tekrar, hücre kültürü insert membranının altında hava kabarcığı oluşmadığından emin olun. Bu, kültüre edilmeye hazır sağlıklı bir hipokampal kesit örneğidir. Hipokampusun CA1, CA3 ve dentat girus bölgeleri net bir şekilde görülmektedir ve hasarsızdır.

Burada, kültür için kullanılmayan hasarlı bir hipokampal kesit gösterilmektedir. Son olarak, bu, dört günlük kültür sonrası sağlıklı bir hipokampal kesit örneğidir. Kesitin diseksiyon mikroskobu altında beyaz göründüğüne ve kesit yüzeyinin temiz olduğuna dikkat edin.

Hipokampusun CA1, CA3 ve dentate gyrus bölgeleri net bir şekilde görünür ve hasarsızdır. Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık bir saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, uygun steril tekniklerin kullanıldığını hatırlamak ve dokuya nazik davranmak çok önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, organotipik kültürleme ve hipokampal lizis işlemleri hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.