Name: Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre ve PicoGreen Boya kullanarak dsDNA Niceleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Öğrenin, Hitachi F-7000 floresans spektrofotometre ve PicoGreen boya kullanarak dsDNA nicelendirmesi yapmayı. Bu yüksek verimli yöntem, biyolojik araştırmalarda hassas DNA ölçümleri için güvenilir bir kalibrasyon eğrisi sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Enstrüman Kurulum <ol><li> Spectrofluorometer açın ve 1 saat ısınmasını bekleyin. </li><li> Excel, Şekil 1'de gösterildiği gibi, Standartlar ve örnek veri ile bir dosya oluşturmak ve virgülle ayrılmış kaydetmek "csv" formatında değerleri. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig1.jpg" alt="Şekil 1"> Şekil 1. Standartlar ve örnekler veri. </li><li> Flüorometre aşağıdaki gibi ayarlayın: <ol><li> Tıklayın <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon1.jpg" alt="Icon 1"> düğmesi, Şekil 2'de gösterildiği Analiz Yöntemi penceresi açılacaktır. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig2.jpg" alt="Şekil 2"> Şekil 2. Analiz Metodu Pencere, Genel sekmesinde. Aşağıdaki seçimleri yapın: <ul><li> "Ölçüm" alanına, menüyü aşağı çekme Fotometri seçin. </li><li> "Operatör" alanına, uygun operatörün adını girin. </li><li> "Instrument" alanına bilgi girmek için gerek yoktur. Bu, yazılım tarafından otomatik olarak seçilir. </li><li> Mikroplak okuyucu kullanarak, "Örnekleme" alanında etkin değildir. </li><li> Raporu "Yorumlar" alanına dahil etmek istediğiniz herhangi bir yorum girin. </li><li> "Aksesuar" alanına, bu test için kullanılan aksesuarlar ile ilgili bilgiler girin. </li><li> Pencerenin sağ tarafındaki düğmeleri unutmayın. </li><li> "Load" düğmesine önceden kaydedilmiş Analiz Yöntemleri yüklenmesini sağlar. </li><li> "Kaydet" düğmesine aynı adı kullanarak, test parametreleri bir dizi ya da önceden kaydedilen ve yüklenen Analiz Metodu güncellemeye izin verir. </li><li> "Farklı Kaydet" düğmesine test parametreleri veya Çözümleme Yöntemi, istenilen bir isim altında yeni bir dizi tasarruf sağlar. </li></ul> Şimdi "kantitasyonu" sekmesine tıklayın bkz. Şekil 3 ve aşağıdaki seçimleri yapın. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig3.jpg" alt="Şekil 3"> Şekil 3. Analiz Metodu Pencere, kantitasyonu sekmesini. <ul><li> "Kantitasyonu tipi" alanında, Dalgaboyu seçin. Bu floresan okuma seçilen dalga boyu kullanılarak yapılacaktır gösterir. </li><li> "Kalibrasyon" alanına, 1. sırasını seçin. </li><li> "Dalga boyu Numarası" alanında, 1 seçin. </li><li> "Konsantrasyon birim" alanında, ng / ml girin. </li><li> "Manuel Kalibrasyon" ve "sıfır yoluyla Kuvvetleri eğrisi" kutuları seçilmemiş bırakın. </li><li> "Rakam ondalık noktadan sonra" alanında, 2 seçeneğini seçin. </li><li> "Alt konsantrasyon sınırı" alanına, 0 girin. </li><li> "Üst konsantrasyon limiti alanında, 10000 girin. </li></ul> Şimdi "Instrument" sekmesine tıklayın ve aşağıdaki seçimleri yapın. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig4.jpg" alt="Şekil 4"> Şekil 4. Analiz Metodu pencere, Enstrüman sekmesi <ul><li> "Veri modu:" alanına, Floresans seçin. </li><li> "Doğrama hız" alanında bu zamanda, sadece fosforesans ölçümler için kullanılan etkin değildir. </li><li> "Dalga boyu modu" alanında, hem WL sabit seçin. </li><li> "EX / WL1" alanına 480nm girin. </li><li> "EM / WL1" alanına 520Nm girin. </li><li> EX altında diğer tüm alanlar ve EM, şu anda devre dışıdır. </li><li> "EX yarık" alanına menüyü aşağı çekme 5.0nm seçin. </li><li> "EM yarık" alanına menüyü aşağı çekme 5.0nm seçin. </li><li> "PMT Voltaj 1-1000V" alanında önünde kutusu seçilmemiş bırakın. </li><li> "PMT Voltage" alanında, menüyü aşağı çekme 700V seçin. </li><li> "Otomatik istatistik calc. Numarası" alanında 2'yi seçin. </li><li> 1 "çoğaltır" alanını seçin. </li><li> "Entegrasyon" alanına 0.1s seçin./ P&gt; </li><li> "Gecikme" alanına girmek veya 0s seçin. </li></ul> "Monitör" sekmesini tıklayın. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig5.jpg" alt="Şekil 5"> Şekil 5. Analiz Metodu pencere, Monitör sekmesini. <ul><li> "Y ekseni", "Max:" alanına, 10000 seçin </li><li> "Y ekseni", "Min:" alanına, 0 seçin. </li><li> "Açık veri işleme veri toplama sonra" sol kutusunu işaretleyin. </li><li> Okumalar tamamlandıktan sonra otomatik olarak basılacak bir rapor istediğiniz sürece, "veri toplama sonra Baskı raporu" sol kutusu seçilmemiş bırakın. </li></ul> "Rapor" sekmesine tıklayın, Şekil 6 bakın. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig6.jpg" alt="Şekil 6"> Şekil 6. Analiz Metodu penceresi, Rapor Tab. <ul><li> "Çıkış" alanına, menü aşağı çekme Rapor Yazdır seçeneğini seçin. Ayrıca ısmarlama raporlar üretmek izin Report Generator programı isteğe bağlı eklemek kullanarak eğer Excel'e veri veya "Kullanım Baskı Jeneratör Formu" istiyorsanız, "Microsoft Excel kullan" seçeneğini seçin. </li><li> Rapora dahil olmasını istediğiniz öğeleri için kutuları tıklayın. </li><li> "Analiz Yöntemi" penceresinde farklı sekmelerde seçilen tüm parametreleri kaydetmek için, "tekrar" Genel "sekmesini tıklayın ve bir dosya adı altında ve ileride kullanmak için onları bulmak bir yere kaydedin ve tıklayın. OK "Bu pencereyi kapatmak için düğmesine basın. </li><li> Bu cihaz test parametreleri kurma tamamlar. </li><li> Şimdi mikroplak okuyucu kurar. </li><li> Tıklayın <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon2.jpg" alt="Simge 2"> düğmesi, üstüne MPR Kur Penceresi getirecektir. </li></ul> MPR Kur Pencere / Plaka sekmesinde Standartlar ve Örnekler için kuyu, Şekil 7'de gösterildiği gibi seçin. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig7.jpg" alt="Şekil 7"> Şekil 7. MPR Kurulumu penceresinde, Levha sekmesini. <ul><li> A1 pozisyonuna E1 tıklayın ve fareyi sürükleyin, sonra üzerine tıklayın <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon3.jpg" alt="Icon 3"> düğmesine basın. Bu standartlar için kullanılacak pozisyonlar seçecektir. Bu pozisyonları yeşil renkte vurgulanır. </li><li> Şimdi örnekleri için H3 pozisyonları F1 seçmeniz gerekir. Sonra tıklayın tıklayın ve fareyi sürükleyin pozisyon F1 başlayarak, H3 konumuna ve <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon4.jpg" alt="Icon 4"> düğmesi, bu sarı renkli bu pozisyonları vurgulayacaktır. </li><li> Sonra örnek ölçümler için bu pozisyonları seçmek için, E3 A2 pozisyonlar için aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Şimdi, Standartlar ve örnek bilgileri önceden hazırlanmış dosya Virgülle Ayrılmış Değişken (csv) dosyası yüklemek. </li></ul> Şekil 8'de gösterildiği gibi "MPR Kurulum Pencere", "İyi bir bilgi" sekmesine tıklayın . <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig8.jpg" alt="Şekil 8"> Şekil 8. MPR Kurulumu penceresinde, Kuyu Bilgi sekmesi. <ul><li> Sonra üzerine tıklayın <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon5.jpg" alt="Simge 5"> düğmesine basın. "Peki information.csv" dosya bulma ve yükleme sağlayacaktır Şekil 9 gösterilen bir Windows Explorer penceresinde açılacaktır. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig9.jpg" alt="Şekil 9"> Şekil 9. Iyi örnek bilgileri yükleniyor. "Eh bilgi" dosyasını yükledikten sonra, "İyi bilgi" Şekil 10'da gösterildiği gibi görünecektir <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig10.jpg" alt="Şekil 10"> Şekil 10. Örnek kuyusu bilgi yüklendi. </li></ul></li></ol></li></ol> 2. Picogreen Testi Numune Hazırlama <ol><li> 20 X TE Tampon 1 ml ekleyerek 1X TE Tamponu (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) hazırlayın19 ml di H 2 O. </li><li> 9.95 ml 1 X TE Tamponu 50 mcL 200 X PicoGreen Reaktif ekleyerek PicoGreen Reaktif Çözüm hazırlayın. </li><li> Stok dsDNA (100 mg / ml) seri dilüsyonları yaparak standartları (Lambda dsDNA) hazırlayın. İlk olarak 50 mikrogram / ml dsDNA stok dsDNA (100 mg / ml) ve 25 mcL 1 x TE Tamponu 25 mcL ekleyerek bir çözüm hazırlayın. Sonra, aşağıdaki tabloda listelenen belirtilen dsDNA hacimleri ve tampon ekleyerek standart çözümler hazırlamak: <table border="1"><tbody><tr><td> DsDNA Yoğunlaşma </td><td> Ses dsDNA </td><td> Buffer Hacmi </td></tr><tr><td> 1 mcg / mL </td><td> 50 mcg / ml dsDNA 20 mcL </td><td> 980 mcL 1 X TE Tampon </td></tr><tr><td> 0.1 mg / ml </td><td> 1 mcg / ml dsDNA 100 mcL </td><td> 900 mcL 1 X TE Tampon </td></tr><tr><td> 0.01 mcg / mL </td><td> 0.1 mg / ml dsDNA 100 mcL </td><td> 900 mcL 1 X TE Tampon </td></tr><tr><td> 0.001 mg / ml </td><td> 0.01 mcg / ml dsDNA 100 mcL </td><td> 900 mcL 1 X TE Tampon </td></tr></tbody></table></li></ol> 3. Standartlar ve örnek Floresans ölçümü <ol><li> Pipet Şekil 7 başına 150 96 plaka kuyuları A1-E1 içine her bir standart mcL, aşağıdaki tabloya göre: <table border="1"><tbody><tr><td> Iyi </td><td> Standart </td></tr><tr><td> A1 </td><td> 1 mcg / mL </td></tr><tr><td> B1 </td><td> 0.1 mg / ml </td></tr><tr><td> C1 </td><td> 0.01 mcg / mL </td></tr><tr><td> D1 </td><td> 0.001 mg / ml </td></tr><tr><td> E1 </td><td> 1 X TE Tampon </td></tr></tbody></table></li><li> Şekil 7 de gösterilmiştir H3, kuyular F1 pipetlenir 150 mcL bilinmeyen örnekleri </li><li> Çok kanallı pipet kullanmak için tasarlanmış bir çukur içine adım 1.2 'de hazırlanan PicoGreen çözüm dökün. Kuyuları A1-H3 150 mcL PicoGreen çözümü sunmak için çok kanallı pipet kullanın. Hafifçe karıştırın çözüm pipet ile ve standartlara. </li><li> Plaka ve karanlık bir alanda geliştirmek için reaksiyon için 2-5 dakika bekleyin. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Iyi bir kalibrasyon eğrisi yazılım tarafından kalibrasyon eğrisi ve hesaplama standartları ölçümü üzerine F-7000 yazılımı tarafından sağlanan farklı parametreler kullanılarak değerlendirilir. Belirleme katsayısı, ölçülen standartlara uyum iyiliği ve hesaplanan kalibrasyon eğrisi gösterir. Yakın bu değer "1", ölçülen değer ve kalibrasyon eğrisi daha iyi uyum. Değerini "1" uzak ise, standartlar, yeniden ölçülür tekrar hazırlanır veya kalibrasyon eğrisi fitness değişti olmalıdır. Şekil 11 PicoGreen boya kullanarak dsDNA ölçümü için elde edilen hesaplanmış bir belirleme katsayısı = 0,99993, bir kalibrasyon eğrisi bir örnek gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig11.jpg" alt="Şekil 11"> Şekil 11. DsDNA kalibrasyon eğrisi örneği.

<ol><li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).</li>
</ol>

Luis A. Moreno ve Kendra L. Cox bu yazıda kullanılan alet üreten Hitachi High Technologies Amerika tarafından istihdam edilmektedir.

Dikkatli numune hazırlama sırasında pipetleme yanı sıra, kararlı ve hassas bir floresan spektrofotometre kullanılarak iyi ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için esastır. Bu test için kullanılan floresan spektrofotometre durumda, mikroplaka okuyucu 300 mcL son numune hacmi kullanarak önerilmektedir. Düşük ses duyarlılığı azalır ve daha büyük bir hacim kuyuları arasında çapraz kontaminasyona neden olabilir.

<table><tbody><tr><td>Distile H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Reaktif</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Quant-iT Picogreen dsDNA Analiz Kiti</td><td>Reaktif</td><td></td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Nalge Nunc Floresans Mikroplakalar p/n 237108</td><td>Sarf Malzeme</td><td></td><td>237108</td><td></td></tr><tr><td>12 Kanallı Eppendorf Mikropipet</td><td>Sarf Malzeme</td><td></td><td>3516677</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L Eppendorf Pipet</td><td>Sarf Malzeme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L Eppendorf Pipet</td><td>Sarf Malzeme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL serolojik pipet</td><td>Sarf Malzeme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum folyo</td><td>Sarf Malzeme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları</td><td>Sarf Malzeme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FL Solutions 2.1 yüklü Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre</td><td>Ekipman</td><td></td><td>5J1-0003</td><td></td></tr><tr><td>F-7000 için Mikroplaka Okuyucu Aksesuarı</td><td>Ekipman</td><td></td><td>5J0-0139</td><td></td></tr></tbody></table>

hitachi f-7000 floresans spektrofotometre ve picogreen boya kullanarak dsdna niceleme

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Niceleme özellikle küçük konsantrasyonlarda DNA, DNA sentezi ve saflaştırılması, DNA amplifikasyon ürünlerinin ölçümü gibi tanı uygulamaları ve ilaç DNA molekülleri algılama gibi standart moleküler biyoloji testleri de dahil olmak üzere biyolojik uygulamaların geniş bir yelpazede önemli bir görevdir preparatlar. Bu video sırasında dsDNA kantifikasyon Molecular Probes Quant-PicoGreen boya Reaktif kitini kullanarak gerçekleştirmek için Mikro Plaka Okuyucu aksesuar ile donatılmış F-7000 Hitachi Floresans Spektrofotometre yeteneğini gözler önüne serecektir. F-7000 Floresans Spektrofotometre, yüksek hassasiyette ve yüksek hızda ölçümler sunmaktadır. Bu ölçüm floresan, lüminesans ve fosforesans kapasitesine sahip son derece esnek bir sistem. Dalga boyu tarama, zamanlı tarama, fotometri ve 3-D tarama ölçümü de dahil olmak üzere, çeşitli ölçüm modları mevcuttur. Spektrofotometre mikroplak 300 mcL numune hacmi flöresein 50 picomoles aralığında hassasiyet vardır ve 60.000 nm / dakika tarama hızları ölçme yeteneğine sahiptir. Ayrıca konsantrasyonlarının geniş bir yelpazede üzerinde kalibrasyon eğrilerinin kullanımı için izin büyüklüğü 5 emir kadar geniş bir dinamik aralık vardır. Optik sistemi, maksimum enerji ve duyarlılık için tüm yansıtıcı optik kullanır. Standart dalga boyu aralığı 200-750 nm, ve isteğe bağlı yakın kızılötesi photomultipliers birini kullanarak 900 nm kadar uzatılabilir. Sistemi, isteğe bağlı bir dış ısı kontrollü sıvı sirkülatör kullanarak 5 ile 60 derece santigrat plaka okuyucu için isteğe bağlı sıcaklık kontrolü sağlar. Mikroplaka okuyucu kullanmak için 96 mikroplaka sağlar ve kinetik modunu kullanarak 96 kuyu için ölçüm hızı 60 saniyeden az. F-7000 ve Mikroplaka Okuyucu Yazılım kontrolleri de son derece esnektir. Örnekler sütun veya satır biçimlerinden birini ve örnek ölçümler için seçilen kuyu herhangi bir kombinasyonu olabilir. Bu optimal kullanımı için mikroplak izin verir. Ayrıca, yazılım Excel&#39;de oluşturulmuş ve virgülle ayrılmış değerler kaydedilir mikro plaka örnek konfigürasyonları, ya da &quot;csv&quot; formatında ithal sağlar. Mikroplaka ölçüm yapılandırmaları kaydedilir ve kolaylık sağlamak için yazılım ve verimlilik artışı ile geri çağrılabilir. Veri sonuçları standart bir rapor çıktı, Excel ya da isteğe bağlı Report Generator Programı olabilir.

DsDNA ölçümü Moleküler Problar PicoGreen boya ve bir mikroplak okuyucu aksesuar ile donatılmış Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre kullanılarak gösterilmesi.

Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre ve PicoGreen Boya kullanarak dsDNA Niceleme

Özellikle düşük konsantrasyonlardaki DNA'nın kantifikasyonu, standart moleküler ... dahil olmak üzere geniş bir biyolojik uygulama yelpazesine sahip önemli bir işlemdir.

Bu prosedürün genel amacı, F 7, 000 floresan spektrofotometresinin Mikroplaka okuyucu ile Pico green boyası kullanarak çift sarmallı DNA kantifikasyonu yapma kapasitesini göstermektir. Bu işlem, öncelikle numunelerin ve reaktiflerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise cihazın kurulumudur.Prosedürün üçüncü adımı, örneklerin Mikroplaka okuyucuya yüklenmesidir. Prosedürün son adımı ise standartların ve örneklerin ölçümünün gerçekleştirilmesidir. Nihayetinde, bilinmeyen örneklerin çift sarmallı DNA miktar tayini için kullanılabilecek lineer bir kalibrasyon eğrisi gösteren sonuçlar elde edilebilir.Ksenon lambasının bir saat boyunca ısınmasını sağlamak için Hitachi F 7, 000 Spektra Florimetresini açın. Excel'de standartlar ve örnek verilerini içeren bir dosya oluşturun ve bunu virgülle ayrılmış değerler veya CSV formatında kaydedin. Florimetreyi kurmak için öncelikle analiz yöntemi penceresini açan yöntem butonuna tıklayın.Ölçüm alanında, açılır menüden fotometriyi seçin. Şimdi kantifikasyon sekmesine tıklayın. Kantifikasyon tipi alanında, floresan okumasının belirli bir dalga boyu kullanılarak yapılacağını belirtmek için dalga boyunu seçin.Kalibrasyon tipi için birinci dereceyi ve dalga boyu sayısı için biri seçin. Konsantrasyon birimi için nanogram/mililitre girin. Manuel kalibrasyon ve eğriyi sıfırdan geçmeye zorla kutucuklarının işaretli olmadığından emin olun. Ondalık basamak sayısı için ikiyi seçin, alt konsantrasyon sınırı için sıfır ve üst konsantrasyon sınırı alanı için 10,000 girin.Ardından, cihaz sekmesine tıklayın ve veri modu alanından floresans seçeneğini belirleyin. Kıymama (chopping) hızı alanı, yalnızca fosforesans ölçümleri için kullanıldığından aktif olmadığını doğrulayın. Dalga boyu modu alanında, ex WL alanında WL sabit seçeneğini belirleyin ve EM WL alanına 480 nanometre girin.520 nanometre girin. EX ve EM altındaki diğer tüm alanları inaktif bırakın. Hem ex yarık genişliğini hem de EM yarık genişliğini 5.0 nanometre olarak ayarlayın.Açılır menüleri kullanarak, PMT voltajı 1000 volt alanının önündeki kutucuğu seçilmemiş bırakın. PMT voltajı için açılır menüden 700 volt seçeneğini belirleyin. Ayrıca, otomatik istatistik hesaplama sayısı için iki, tekrarlar için bir, entegrasyon süresi için 0.1 saniye ve gecikme için sıfır seçeneğini belirleyin.Şimdi izleme sekmesini açın ve y ekseni maksimum alanını 10,000, y ekseni minimum alanını ise sıfır olarak ayarlayın. Ardından, veri toplama sonrası veri işlemeyi aç kutucuğunu ve eğer gerekiyorsa, okumalar tamamlandığında raporun otomatik olarak yazdırılması için veri toplama sonrası rapor yazdır kutucuğunu seçin. Son olarak, analiz yöntemi penceresinin farklı sekmelerindeki tüm seçili parametreleri kaydetmek için genel sekmesine tıklayın ve belirtilen bir konumda yeni bir dosya adı altında kaydedin.Bu pencereyi kapatmak için tamam düğmesine tıklayın. Bu işlemle cihaz test parametrelerinin kurulumu tamamlanmış olur. Mikroplaka okuyucuyu kurmak için, MPR kurulum penceresini ön plana getirmek amacıyla MPR düğmesine tıklayın.Öncelikle standartlar için kuyucukları seçin. Örneğin, A1 konumuna tıklayın ve fareyi E1'e kadar sürükleyin. Ardından standart seti düğmesine tıklayın.Bu işlem, yeşil renkle vurgulandığı üzere standartlar için kullanılacak pozisyonları seçecektir. Ardından numuneler için pozisyonları seçin. Benzer şekilde, fareyi plaka üzerindeki karşılık gelen pozisyonların üzerinde tıklayıp sürükleyin ve ardından seçilen pozisyonları otomatik olarak sarı renkle vurgulayacak olan numune seti butonuna tıklayın.İstenilen örnek ölçüm konumları için aynı işlemi tekrarlamaya devam edin. Standartları ve örnek bilgilerini daha önce hazırlanan virgülle ayrılmış değişken dosyasına yüklemek için MPR kurulum penceresinin kuyu bilgileri sekmesine tıklayın.Yükleme kuyusu bilgileri butonunu seçin; kuyuk bilgileri dot csv dosyasını belirlemek için bir Windows Gezgini penceresi açılacaktır. Bilgiler yüklendikten sonra, pencere bir tablo şeklinde görüntülenmelidir. Pico green reaktifinin çalışma çözeltisini hazırlamak için, 9.95 milliliters TE tamponuna 50 microliters 200 X pico green reaktifi ekleyin.Standart eğri için, TE tamponunda final konsantrasyonları 1 ile 100 nanogram/mililitre arasında değişen Lambda çift sarmallı DNA seri dilüsyonları hazırlayın; her bir standarttan 150 mikrolitre miktarını 96 kuyucuklu bir plakanın belirlenmiş kuyucuklarına pipetleyin. Ardından, her bir test örneğinden 150 mikrolitre miktarını plakanın karşılık gelen belirlenmiş kuyucuklarına pipetleyin. Şimdi, çok kanallı pipet kullanarak her kuyucuğa 150 mikrolitre PicoGreen çözeltisi ekleyin ve çözeltiyi DNA örnekleriyle karıştırın.Reaksiyonun gelişmesi için plakayı karanlık bir alanda iki ila beş dakika boyunca nazikçe inkübe edin. MPR kurulum penceresini ekranın üst kısmına getirmek için MPR ekran düğmesine tıklayın ve ardından değişim konumu düğmesine tıklayın. Mikroplaka tutma platformu cihazın önüne doğru hareket edecektir; mikroplaka okuyucunun kapağını açın ve 96 kuyucuklu plakayı, A1 kuyucuğu öne gelecek şekilde tutma platformuna yerleştirip mikroplaka okuyucunun kapağını kapatın.Mikroplakadaki A konumunu ölçüm konumuna yerleştirmek için başlangıç konumu düğmesine tıklayın. Ölçüm penceresini ekranın üst kısmına getirmek için monitör ekranı düğmesine tıklayın. Standartların ve bilinmeyen numunelerin ölçümünü başlatmak için ölç düğmesine tıklayın.İyi bir kalibrasyon eğrisi, F 7, 000 yazılımı tarafından sağlanan farklı parametreler kullanılarak değerlendirilir. Örneğin, Pico green boyası kullanılarak çift zincirli DNA'nın kantifikasyonu için elde edilen bu ideal kalibrasyon eğrisinin hesaplanan belirleme katsayısı 0.99993'tür. Tanımlanan yüksek kapasiteli sistem; Pico Green Boyası, Mikroplaka okuyucu ile donatılmış bir Hitachi F 7, 000 floresan spektrofotometre ve veri toplama, depolama, analiz ve sunumu otomatikleştirmek için bir yazılım programını içeren teknolojilerin seri bir kurulumudur.Güçlü teknolojilerin kombinasyonu, küçük miktarlardaki çift zincirli DNA'nın doğru bir şekilde analiz edilmesine yönelik artan ihtiyacı karşılayabilir.

quantification-dsdna-using-hitachi-f-7000-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Pratik ve verimli bir alternatif olarak geleneksel nükleik asit kantitatif metodolojiye NanoDrop microvolume sistemlerinin kullanımı iki microvolume nükleik asit kantitatif protokolleri gösteri ile tarif edilir.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Basitleştirilmiş (analog) bir okuma ile nükleik asitleri ölçmek için bir uç nokta dijital testi tanımlıyoruz. Damlacık bazlı dijital tahlillerin toplu floresansını özel enstrümantasyon yerine standart bir qPCR makinesi kullanarak ölçüyoruz ve sonuçlarımızı mikroskopi ile doğruluyoruz.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Bu yazıda, aynı anda Enterococcus spp ölçmek için kullanılabilecek bir çift yönlü dijital PCR deneyi. Ve eğlence sularda genel olarak insan ilişkili dışkı kirlenme göstergeleri olarak HF183 genetik işaretleyiciler açıklanmaktadır.

Eşzamanlı Niceleme için Dubleks Dijital PCR Testi<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ve Waters İnsan Fekal ilişkili HF183 Marker

Bu yöntem bir SYBR yeşil jel ıslatarak seçici boyama ve jelleri içinde DNA'ın miktar sağlar ben / Nitro mavi Tetrazolium çözüm ve sonra güneş ışığı ya da mavi bir ışık kaynağına maruz. Bu işlem görünür bir çökelti oluşturur ve alan kullanımı için ideal hale neredeyse hiçbir ekipman.

DNA Formazan yağış mavi ışığa maruz tarafından indüklenen esas alarak yöntemini boyama

Burada, DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA substrat ve protein etiketli bir kuantum nokta kullanarak toplam iç yansıma floresans mikroskobu tarafından (TIRFM) eğitim için bir iletişim kuralı mevcut.

Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

Burada floresan korelasyon spektroskopisi kullanarak hücre lisat ve canlı hücrelerde protein oligomerlerini ve toplamayı ölçmek için bir prosedür sunuyoruz.

Floresan Korelasyon Spektroskopisi Kullanılarak Protein Toplamanın Tespiti

Bu protokol, bileşikler ve protein molekülleri arasındaki bağlanmayı tespit etmek için benzersiz bir yöntemi tanımlar ve minimum protein numune kaybı ve yüksek veri doğruluğu avantajları sunar.

Diferansiyel Taramalı Floresan ile CD40 Protein-Umbelliferon Etkileşiminin Tespiti

Bu çalışma, DNaz aktivitesinin tespiti ve kantitatif değerlendirmesi için basit, kullanıcı dostu bir oransal FRET testi sunar ve zayıf bir nükleazın analizinde uygulamasını gösterir.

DNaz Aktivitesinin Oransal Floresan Rezonans Enerji Transferi ile Değerlendirilmesi

Bu protokol, bir sinyal raportörü olarak floresan ışıklı aptamer DAP-10-42 kullanan bölünmüş hibridizasyon problarının tasarımını ve bunların nükleik asit tespiti ve tek nükleotid ikameleri ile hedefler arasında farklılaşma için uygulamalarını ana hatlarıyla belirtir.

Diziye Özgü Nükleik Asit Analizi için Sinyal Raportörü Olarak DNA Floresan Işıklı Aptamer Kullanan Bölünmüş Hibridizasyon Probu

Bu protokol, DNA içsel floresan spektrumlarının örnek hazırlanması, veri toplama ve analizi üzerine ayrıntılı işlemler sağlar.

İçsel Kontrast kullanarak DNA moleküllerinin spektroskopik süper çözünürlüklü görüntülemesi

Öğrenin, Hitachi F-7000 floresans spektrofotometre ve PicoGreen boya kullanarak dsDNA nicelendirmesi yapmayı. Bu yüksek verimli yöntem, biyolojik araştırmalarda hassas DNA ölçümleri için güvenilir bir kalibrasyon eğrisi sunar.

Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre ve PicoGreen Boya kullanarak dsDNA Niceleme

Daha fazla video keşfet