Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre ve PicoGreen Boya kullanarak dsDNA Niceleme
5 Kasım 2010
DsDNA ölçümü Moleküler Problar PicoGreen boya ve bir mikroplak okuyucu aksesuar ile donatılmış Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre kullanılarak gösterilmesi.
Bu prosedürün genel amacı, Mikroplaka okuyuculu F 7.000 floresan spektrofotometrenin Pico yeşil boya kullanarak çift sarmallı DNA miktar tayini gerçekleştirme yeteneğini göstermektir. Bu, önce numunelerin ve reaktiflerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, cihazı kurmaktır.
Prosedürün üçüncü adımı, numunelerin Mikroplaka okuyucusuna yüklenmesidir. Prosedürün son adımı, standartların ve numunelerin ölçümünün yapılmasıdır. Sonuç olarak, bilinmeyen örneklerin çift sarmallı DNA miktar tayini için kullanılabilecek doğrusal bir kalibrasyon eğrisi gösteren sonuçlar elde edilebilir.
Xenon lambasının Excel'de bir saat ısınmasını sağlamak için Hitachi F 7, 000 Spectra Florimetreyi açın. Standartlar ve örnek verilerle bir dosya oluşturun ve virgülle ayrılmış değerler veya CSV biçiminde kaydedin. Florimetreyi kurmak için önce analiz yöntemi penceresini açan yöntem düğmesine tıklayın.
Ölçüm alanında, açılır menüden fotometriyi seçin. Şimdi nicelik sekmesine tıklayın. Kantitasyon türü alanında, floresan okumasının belirli bir dalga boyu kullanılarak yapılacağını belirtmek için dalga boyunu seçin.
Kalibrasyon türü için birinci sırayı seçin ve dalga boyu sayısı için birini seçin. Konsantrasyon birimi için mililitre başına nanogram girin. Ondalık noktadan sonra rakam için manuel kalibrasyon ve sıfır kutularından geçen kuvvet eğrisinin işaretli olmadığından emin olun, iki seçin, alt konsantrasyon limiti için sıfır girin ve üst konsantrasyon limiti alanı için 10.000 girin.
Ardından, cihaz sekmesine tıklayın ve veri modu alanında floresansı seçin. Yalnızca fosforesans ölçümleri için kullanıldığından, doğrama hızı alanının etkin olmadığını doğrulayın. Dalga boyu modu alanında, eski WL bir alanına sabitlenmiş her iki WL'yi seçin, EM WL bir alanına 480 nanometre girin.
520 nanometre girin. EX ve EM altındaki diğer tüm alanları devre dışı bırakın. Hem eski yarığı hem de EM yarığını 5.0 nanometreye ayarlayın.
Açılır menüleri kullanarak, PMT voltajının önündeki kutuyu bir ila 1000 volt alanı arasında seçili bırakın. PMT voltajı için açılır menüden 700 volt seçin. Ayrıca, otomatik istatistik hesaplaması için iki, çoğaltmalar için bir, entegrasyon süresi için 0,1 saniye ve gecikme için sıfır seçin.
Şimdi monitör sekmesini açın ve neden eksen maksimum alanını 10, 000 olarak ve neden eksen min'i sıfıra ayarlayın. Ardından, veri alımından sonra açık veri işlemenin solundaki kutuyu seçin ve gerekirse, okumaların tamamlanmasının ardından otomatik olarak yazdırılacak bir rapor için veri alımından sonra yazdırma raporunun solundaki kutuyu seçin. Son olarak, seçilen tüm parametreleri analiz yöntemi penceresinin farklı sekmelerine kaydetmek için genel sekmesine tıklayın ve belirtilen bir konumda yeni bir dosya adı altında kaydedin.
Bu pencereyi kapatmak için tamam düğmesine tıklayın. Bu, cihaz test parametrelerinin ayarlanmasını tamamlar. Mikroplaka okuyucuyu kurmak için, MPR kurulum penceresini öne getirmek için MPR düğmesine tıklayın.
İlk önce standartlar için kuyuları seçin. Örneğin, A bir konumuna tıklayın ve fareyi E bir'e sürükleyin. Ardından standart ayar düğmesine tıklayın.
Bu, yeşil renkle vurgulanan standartlar için kullanılacak konumları seçecektir. Ardından numuneler için konumları seçin. Benzer şekilde, fareyi plaka üzerindeki ilgili konumların üzerine tıklayın ve sürükleyin ve ardından seçilen konumları otomatik olarak sarı renkle vurgulayacak olan örnek seti düğmesine tıklayın.
İstenilen numune ölçümlerinin konumları için aynı işlemi tekrarlamaya devam edin. Standartları ve örnek bilgilerini daha önce hazırlanmış olan virgülle ayrılmış değişken dosyasına yüklemek. MPR kurulum penceresinin kuyu bilgileri sekmesine tıklayın.
Kuyu bilgilerini yükle düğmesini seçin ve kuyu bilgisi nokta csv dosyasını tanımlamak için bir Windows Gezgini penceresi açılacaktır. Bilgileri yükledikten sonra, pencere bir tablo olarak görüntülenmelidir. Çalışan bir Pico yeşil reaktif çözeltisi hazırlamak için, 9.95 mililitre TE tamponuna 50 mikrolitre 200 X pico yeşil reaktif ekleyin.
Standart eğri için, Lambda çift sarmallı DNA'nın TE tamponunda, her standarttan 150 mikrolitre pipet mililitre başına bir ila 100 nanogram arasında değişen nihai konsantrasyonlar için seri dilüsyonlarını 96 oyuklu bir plaka plakasının belirlenmiş kuyucuklarına hazırlayın. Daha sonra, her bir test örneğinden 150 mikrolitreyi plakanın karşılık gelen belirlenmiş kuyucuklarına pipetleyin. Şimdi çoklu pipet kullanarak, her bir oyuğa 150 mikrolitre Pico green solüsyonu ekleyin ve solüsyon ile DNA örneklerini karıştırın.
Reaksiyonun gelişmesi için plakayı karanlık bir alanda iki ila beş dakika nazikçe inkübe edin. MPR kurulum penceresini ekranın üst kısmına getirmek için MPR ekran düğmesine tıklayın ve konum değiştirme düğmesine tıklayın. Mikroplaka tutma platformu, cihazın önüne doğru hareket edecek, mikroplaka okuyucunun kapısını açacak ve 96 oyuklu plakayı, A bir kuyu öne bakacak şekilde tutma platformuna yerleştirecek ve Mikroplaka okuyucunun kapısını kapatacaktır.
Mikroplakanın A konumunu ölçüm konumuna yerleştirmek için başlangıç konum düğmesine tıklayın. Ölçüm penceresini ekranın üzerine getirmek için monitör ekran düğmesine tıklayın. Standartları ve bilinmeyen numuneleri ölçmeye başlamak için ölçüm düğmesine tıklayın.
İyi bir kalibrasyon eğrisi, F 7.000 yazılımı tarafından sağlanan farklı parametreler kullanılarak değerlendirilir. Örneğin, Pico yeşil boya kullanılarak çift sarmallı DNA'nın miktar tayini için elde edilen bu ideal kalibrasyon eğrisi, 0.99993 hesaplanmış belirleme katsayısına sahiptir. Açıklanan yüksek verimli sistem, Mikroplaka okuyucu ve veri toplama, depolama analizleri ve sunumunu otomatikleştirmek için bir yazılım programı ile donatılmış bir Hitachi F 7.000 floresan spektrofotometre olan Pico Green Dye dahil olmak üzere teknolojilerin seri bir şekilde bir araya getirilmesidir.
Güçlü teknolojilerin kombinasyonu, küçük miktarlarda çift sarmallı ürünleri doğru bir şekilde analiz etmek için artan ihtiyacı karşılayabilir. DNA.
Genel Bakış
Bu makale, PicoGreen boyası ve mikroplate okuyucu ile Hitachi F-7000 Floresan Spektrofotometre kullanılarak çift sarmallı DNA'nın (dsDNA) kantitasyonunu göstermektedir. Prosedür, dsDNA kantitasyonu için lineer kalibasyon eğrisi elde etmek üzere numunelerin hazırlanması, cihaz kurulumu ve ölçüm süreçlerini ana hatlarıyla belirtir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Floresan spektroskopisi
- DNA kantitasyonu
- Mikroplate okuyucu teknolojisi
Arka Plan
- PicoGreen boyası, dsDNA'yı kantitatif analiz için kullanılan hassas bir floresan boyadır.
- Hitachi F-7000, çok yönlü bir floresan spektrofotometredir.
- Çeşitli biyolojik deneyler için doğru DNA kantitasyonu esastır.
- Yüksek verimli sistemler, birden fazla örneğin aynı anda analizini kolaylaştırır.
Çalışmanın Amacı
- F-7000 spektrofotometresinin dsDNA kantitasyonu için kabiliyetini göstermek.
- Bilinmeyen DNA örneklerini ölçmek için güvenilir bir yöntem kurmak.
- Doğru kantitasyon için lineer bir kalibasyon eğrisi oluşturmak.
Kullanılan Yöntemler
- PicoGreen reaktifinin ve DNA standartlarının hazırlanması.
- Hitachi F-7000 spektrofotometresinin parametrelerinin kurulması.
- Numunelerin mikroplate okuyucuya yüklenmesi.
- Kalibasyon eğrisi oluşturmak için floresan ölçümü.
Ana Sonuçlar
- dsDNA kantitasyonu için lineer bir kalibasyon eğrisi oluşturuldu.
- Yöntem yüksek hassasiyet ve doğruluk gösterdi.
- Sonuçlar 0.99993 belirleme katsayısı gösterdi.
- Sistem küçük miktarlardaki dsDNA'yı etkili bir şekilde analiz etti.
Sonuçlar
- PicoGreen boyası ve F-7000 spektrofotometresinin kombinasyonu, DNA kantitasyonu için güçlü bir yöntem sağlar.
- Bu yüksek verimli yaklaşım, biyolojik araştırmalarda doğru analiz taleplerini karşılar.
- Yöntem, hassas DNA ölçümleri gerektiren çeşitli çalışmalara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of double-stranded DNA is a foundational requirement for target validation, assay development, and preclinical model generation in biopharma R&D. The Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with PicoGreen dye enables high-sensitivity, high-throughput measurement of dsDNA, supporting reliable standard curve generation for downstream applications. This method provides predictive confidence in nucleic acid quantification, reducing variability in early discovery workflows and enabling scalable, reproducible data generation across compound screening and biomarker studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise measurement of dsDNA concentrations for cloning, transfection, and PCR-based target validation assays.
- Operational Value: Supports reproducible sample preparation and quantification, reducing technical variability in hypothesis-driven experiments.
- Predictive Value: Generates linear calibration curves with high determination coefficients (R² > 0.999), ensuring accurate quantification of unknown samples in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative fluorescence readouts compatible with 96-well formats for assay standardization and reagent titration.
- Operational Value: Enables rapid measurement of 96 wells in under 60 seconds using kinetics mode, supporting high-throughput screening readiness.
- Scalability: Software allows saving and recalling microplate configurations, facilitating consistent assay setup across teams and projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Delivers reliable dsDNA quantification for biomarker analysis, PCR validation, and vector production in preclinical models.
- Risk Mitigation: High sensitivity (50 picomoles fluorescein equivalent) and wide dynamic range (5 orders of magnitude) allow accurate quantification across dilution series, reducing false negatives in low-abundance targets.
- Workflow Integration: Outputs data to Excel or report formats, enabling seamless transfer to bioinformatics and analytical pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical development, where accurate nucleic acid quantification is essential for experimental reproducibility and data integrity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling precise dsDNA measurement for cloning efficiency, gene expression analysis, and mutagenesis studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs that support assay robustness and compound library normalization.
- Analytics: Generates linear calibration curves and determination coefficients (R²) that allow inter-experiment comparison and quality control.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through reliable quantification of DNA in drug formulations, viral vectors, and biomarker assays.
- Enterprise Reuse: Configurable software and standardized protocols allow reuse across departments, reducing method redevelopment and increasing operational efficiency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High sensitivity and specificity for dsDNA reduce false signals and improve data confidence in molecular assays.
- Operational Value: Automated data collection, storage, and presentation via software minimize manual handling and transcription errors.
- Strategic Value: Reliable quantification supports go/no-go decisions in lead optimization by ensuring accurate dosing and normalization in functional assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by providing trustworthy nucleic acid data for candidate selection and formulation studies.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence spectroscopy and microplate reader operation.
- Necessitates access to Hitachi F-7000 spectrophotometer with microplate reader accessory and compatible software.
- Demands standardized reagent preparation (PicoGreen dilution in TE buffer) and sample handling to avoid fluorescence quenching.
- Involves optimization of incubation time (2–5 minutes in dark) and wavelength settings (Ex 480 nm, Em 520 nm) for signal consistency.
- Includes practical limitations such as the need for dark incubation and potential interference from contaminants or organic solvents.
