Name: Enjeksiyon ve Elektroporasyon Zebra balığı Otocyst içine MIF Morpholinos Stoktan teslim İç Kulak Geliştirme etkiler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Öğrenin, mikroenjeksiyon ve elektroporasyon kullanarak Danio rerio otosistine MIF morfolino teslimatı yapmayı. Bu yöntem, iç kulak gelişimini incelemek ve istenmeyen beyin etkilerini en aza indirmek için geliştirilmiştir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma KFB için hibe Sağırlık Araştırma Vakfı Yc S ve NSF (IOS 0.930.096) tarafından desteklenmiştir. KFB: NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184, <a href="https://commons.era.nih.gov/commons/genericStatus.do?actionRole=nonPI&amp;applID=7854446&amp;uhf-token=Ugf7JvudZTCbTUW9jSAR1snMUgg%3D">3R01DC004184 08W1</a> , NSF DBI 0.832.862, NSF IOS 0.930.096

1. Elektroporasyon için Elektrotlar yapma <ol><li> Kes uygun uzunluğu 75 mikron çaplı tungsten tel (AM Systems, Inc Carlsborg, WA) (yaklaşık 3-5 cm) </li><li> Molex kablo konektörü (pin damgalı pirinç) ile tungsten tel koyun </li><li> Sarın tungsten teller ve shrink boru (SPC Technology, Chicago, IL) ve Bunsen beki veya ısı tabancası ile daralan boru tel mühür ısı uygulamayın molex kablo konektörü </li><li> Tungsten tel ucu keskinleştirmek için, 1.0 N Sodyum hidroksit içine tel daldırma (Conrad ve ark 1993) ve diğer elektrot olarak bir ataş kullanarak, Kare Dalga Elektroporatör tel elektrolizi. Kullandığımız koşulları bakliyat arasında her biri 50 ms ile 100 ms 5 50 Volt bakliyat. Elektrotlar 15-20 mm çapa kadar bilenmiş olmalıdır </li><li> Elektroporasyon kullanmak için önce kil modelleme halinde preslenmiş oluklar içinde bir tepsi tel tutun </li></ol> 2. Elektroporasyon İstasyonu Kurma <ol><li> Teyp mikromanipülatörler (Dünya Hassas aletler) 75μm tungsten elektrot bilenmiş. </li><li> Diseksiyon mikroskobu aşamasında (Leica) her iki tarafında yerleştirin mikromanipülatörler. </li><li> Koru CUY-21 Düzenle Kare Dalga Elektroporatör (Şekil 1) elektrotlar bağlayın. </li><li> Elektroporatör açın ve elektroporasyon Parametreler, gerilim, darbe süresi ve bakliyat sayısı da dahil olmak üzere ayarlayabilirsiniz. Bu deneme için en etkili parametrelerin her biri Her darbe arasında 100ms ile, 5.0ms süren üç adet 13-volt bakliyat bulundu. Elektroporasyon embriyo hava kabarcıkları oluşturur, darbe süresini azaltır. </li></ol> 3. Zebra balığı Kulakla veziküllü içine Morpholinos Mikroenjeksiyon <ol><li> Hasat zebrafish embriyoların üreme tankından. Embriyolar embriyo-yükselterek ° C gecede 28.5 0.3 PPM metilen mavisi (Westerfield 2005) orta inkübe. </li><li> Sutter P-97 elektrot çektirmesi ile cam iğneler çekin </li><li> Bir agaroz jel tabanı (10 mm Petri kabında balık su içinde% 1 agaroz) - 37 ° C su banyosunda Isınma </li><li> Balık suda ısı% 1 düşük erime noktası agaroz (LMPA) kadar erimiş ve 37 ° C su banyosunda sıcak tutmak. </li><li> Bir morfolino çözüm (GeneTools, Corvallis, OR) ile doldurun ve bir bardak iğne ucu uygun çap kesmek. Bir iğne bir micromanipulator (Kuhn) üzerine monte edin. </li><li> Yaklaşık 10 mm iğne ucu kesin ve ucu morfolino çözüm yeterli teslim imkân vermesini sağlamak için madeni yağ içine enjekte edilir. </li><li> 24 saat postfertilization (hpf) embriyolar Dechorinate ve 0.3 PPM metilen mavisi balık su MS222 (tricaine Sigma) ile onları uyutmak. </li><li> Uygun üniforma analizi için sağ tarafında agaroz jel tabanı üzerine 3 ila 5 anestezi embriyolar hizalayın </li><li> Her embriyo üzerinde% 1 LMPA 1 ile 2 damla koyun ve izin yer embriyo düzeltmek için kuvvetlendirmek </li><li> Otik vezikül sağ tarafta böylece Petri çanağı </li><li> Otik vezikül lümen içine iğne yerleştirin ve bağlı bir nitrojen tankı (Şekil 2) ile morfolino çözüm PV820 Pnömatik PicoPump (Dünya Hassas Aletler) enjekte. </li></ol> 4. Elektroporasyon Prosedürü <ol><li> Hemen enjeksiyondan sonra elektroporasyon istasyona monte embriyolar Taşı </li><li> Otik vezikül sadece arka doku üzerine pozitif elektrot yerleştirin, fakat sadece otik vezikül ön beyin içine nüfuz etmez; negatif elektrot eklemek </li><li> Bir ayak pedalı veya bir anahtar basarak kullanarak uygulayın. </li><li> Agaroz balık su dökün ve dönen ve bir cam pipet ile agaroz embriyolar kaldırmak. Embriyoların zarar vermemek için dikkatli kullanın. Kaldırmak için zor olan embriyo, embriyonun çevresindeki herhangi bir LMPA hafifçe kurtulmak için bir iğne kullanın. </li><li> Embriyolar, metilen mavisi balık su ve analiz için istenen aşamaları (in situ hibridizasyon, etc ve mikroskopik anlaysis, immünohistokimyasal, morfolojik) embriyolar yükseltmek ile bir tabak koyun . </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Elektroporasyon istasyonu. Elektrotlar bilenmiş 75μm Tungsten teller kullanılarak yapılan ve bir koruyun CUY-21 Kare Dalga Düzenle Elektroporatör yol açar bağlı idi. Bu elektrotlar mikromanipülatörler bantlanmış. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Enjeksiyon istasyonu. Tüm embriyolar standardizasyon amaçlar için sağ kulak içine enjekte edildi. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 3 dpf'e embriyolar aktin filamentler Phalloidin boyama. (A), 3 dpf'e embriyo injected kontrolü MO ile arka makula (pm) Phalloidin güçlü boyama vardır. (B) kontrolü MO ile enjekte edilir ve sonra electroporated oldu embriyo enjeksiyon sadece embriyolarda am Phalloidin boyama benzer seviyelerde vardı. Elektroporasyon birlikte mif katille enjeksiyon pm (D) Phalloidin boyama dramatik bir azalmaya neden olmuştur (C) yalnız otik vezikül mif katille Enjeksiyon, Phalloidin boyama azaltılması neden yoktu. am anterior makula. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4, 5 dpf larvaları ile aktin filamentler Phalloidin boyama . Enjeksiyon arasında hiçbir fark sadece (A) ve standart kontrolü morfolino (B) elektroporasyon enjeksiyon. Ancak, mif morpholinos ve electroporated enjekte edilen 5 dpf larvaları sadece mif morpholinos (C enjekte edildi embriyo ile karşılaştırıldığında arka makula (pm) (D) 3 dpf'e daha olsa daha az dramatik Phalloidin boyama, azaltılmış gösterdi .) am anterior makula. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 embriyoların 3 dpf'e Asetillendirilmiş tubulin boyama. (A) embriyo herhangi bir enjeksiyon veya elektroporasyon almadı. (B) embriyo electroporated ama hiçbir enjeksiyon aldı. Embriyolar mif morpholinos enjeksiyon ve elektroporasyon (C, D) Her iki alan kontrol grubu ile karşılaştırıldığında gözle görülür bir şekilde azaldı tubulin boyama vardı. (Pm, arka makula). <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6 kontrolü morfolino 3 dpf'e embriyoların Asetillendirilmiş tubulin boyama. (A) herhangi bir tedavi olmadan Embriyo arka makula (pm) ve geniş innervasyon güçlü asetillenmiş tubulin boyama gösterdi. (B) Embriyo kontrolü morfolino ile enjekte edilir. (C) sadece elektroporasyon ile tedavi Embriyo. (D) enjekte edilir ve electroporated kontrolü morfolino Kontrol embriyo hiçbir tedavi kontrolü ile karşılaştırıldığında arka makula ve innervasyon asetillenmiş tubulin benzer seviyesi vardır.

<ol><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).</li>
<li>Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+essential+for+axis+formation+and+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development.</a> J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).</li>
<li>Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+placode+to+polarization%3A+new+tunes+in+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">From placode to polarization: new tunes in inner ear development.</a> Development. 131, 4119-4135 (2004).</li>
</ol>

Maddenin üretim, video ve metin belirtilen reaktifler üreten Gen Araçlar, LLC tarafından sponsor oldu.

Biz başarıyla 24 hpf zebrafish embriyonun kulak içine antisens oligonükleotid katille girmiştik. Enjeksiyon ve elektroporasyon sonra toplandı Embriyolar yaşayabilir. Embriyoların elektroporasyon kurtuldu, onlar hiçbir tedavi yanı sıra, sadece enjekte edilen ve sadece electroporated olmuştu embriyolar olmuştu embriyolarda almıştı embriyolar göre normal fiyatla büyüdü. Biz Phalloidin ve asetillenmiş tubulin ile etiketleme yoluyla kulak enjeksiyon ve elektroporasyon sonra mif ve mif gibi katille bir etki gözlenmemiştir. Posterior makula duyusal saç hücreleri aktin filamentler Phalloidin boyama saç hücresi ve / veya stereocilia numaraları sadece katille enjekte edildi embriyolar ile kıyaslandığında değişikliğe neden mif ve 24-hpf aşamada mif gibi MO bu elektroporasyon gösterir (Şekil 3). Bu azalma saç hücre sayıları Shen ve arkadaşlarının bulguları ile tutarlıdır. Katille mif ve mif gibi sakküler makula saç hücrelerinin sayısında bir azalmaya neden olduğu (gönderildi). Pratisyenler ve electroporated enjekte edildi embriyolar, bu elektroporasyon göstermek saç hücre sayıları azalmaya ve böylece otik vezikül sadece enjekte edildiği embriyoların karşılaştırıldığında morfolojik etkileri ölçüde artırarak, hücre zarından katille hareketli yardımcı olabilir. Asetillenmiş tubulin boyama yoluyla statoacoustic ganglion morfolojisi değişiklikler gözlenmiştir. Enjekte gösterisi neurites (Şekil 5) dallanma azalma electroporated embriyolar olarak statoacoustic ganglion innervasyon ölçüde etkilendi. Asetillenmiş tubulin boyama embriyolarda enjekte ve electroporated her ikisi de önemli ölçüde azalmış olması nedeniyle de, ganglion hücreleri ve / veya ganglion hücrelerinin sayısı azalmış yoğuşma vardır azalma olabilir. Mif, sinir sistemi gelişimi (Suzuki ve ark, 2004) için kritik olduğu gösterilmiştir Çünkü, mif ve mif gibi neuroblast hücrelerin içine MO çözüm. Artış transfeksiyon elektroporasyon sonra görülen değişiklikler sonucu olabilir Doğrudan gelişmekte olan bir doku içine antisens oligo morpholinos Elektroporasyon embriyo doku gelişimi sırasında, hem de mekansal ve zamansal bir gen ifadesini kontrol etmek için yararlı bir araçtır. Mif ve benzeri iç kulak dokularına katille mif Elektroporasyon arka makula ve statoacoustic ganglion anormal morfoloji sonuçlandı. Embriyolar ile karşılaştırıldığında, ya sadece enjekte edilmiş ya da sadece electroporated embriyolarda ya da hiç tedavi almıştı enjekte electroporated olmuştu embriyolar arka makula duyusal saç hücrelerinin sayısında bir azalma vardı. Statoacoustic ganglion ve SAG boyutunu arka duyusal yama innervasyon derecesi bir azalma vardı. Elektroporasyon istenen dokuya, özellikle DNA, RNA, yada MO birincil etkilerinin gözlenmesi ve diğer dokular üzerindeki ikincil etkileri bu ayrımcı, beyin, nöral krest ve yararı, belirli dokulara makromoleküllerin transfecting için değerli bir yöntem iç kulak geliştirme periotic mezenşimin (Barald ve Kelley, 2004).

<ol><li> Pratisyenler: 0.3 mM, mif, mif gibi MO1 için bir kombinasyonu ve mif gibi MO2 kullanılmıştır. 5&#39;-acatcggcatgactgcgacagagat 3 &#39;mif MO zebrafish mif mRNA&#39;nın başlangıç ​​kodon ücretsiz. Iki katille mif gibi gibi MO1 mif translasyonel başlangıç ​​sitesine ücretsiz: gibi-MO2 mif intron1/exon 2 sınırında ise sırası AS türetilmiş, 5&#39;-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3 &#39;: 5&#39;-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC &#39;-3. 5&#39;-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 &#39;Gen Kontrol MO Araçlar şifreli nükleotid dizisi oldu. </li><li> balık suyu metilen mavisi (0.3 ppm) </li><li> MS222 (tricaine, Sigma, balık su içinde 0.64 mM) </li><li> Düşük erime noktası agaroz (LMPA; Roche) </li><li> fenol kırmızısı (Sigma) </li><li> Anti-asetillenmiş tubulin (Sigma) </li><li> Alexa Fluor ® 488 keçi anti-fare ikinci antikor (Moleküler probları) </li><li> Texas kırmızı Phalloidin (Moleküler probları) </li></ol>

enjeksiyon ve elektroporasyon zebra balığı otocyst içine mif morpholinos stoktan teslim İç kulak geliştirme etkiler

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

Son yıllarda, elektroporasyon, göz, beyin, ve zebrafish, hücre grubu da dahil olmak üzere çeşitli dokular, içine, DNA, RNA ve morpholinos in vivo transfeksiyon için popüler bir yöntem haline gelmiştir . Elektroporasyon genetik manipülasyon diğer yöntemlere göre avantajı belirli dokuları, elektrik akımı uygulanması makromoleküllerin tanıtımı için, hem mekansal ve zamansal olarak, hedefli olabilir ki. Burada mif zebrafish gelişmekte olan iç kulağın dokularına ve mif gibi morpholinos transfecting elektroporasyon kullanımı açıklanmaktadır. Geçmiş çalışmalarda, mif morfolino 1 embriyolar içine enjekte - 8-hücreli aşamaya yaygın morfolojik değişikliklerin yanı sıra, sinir sistemi ve göz kulak sonuçlandı. Geliştirme sonraki aşamada iç kulak dokuları belirleyerek, diğer dokulara etkisi sonucu ikincil etkileri aksine, gelişmekte olan iç kulak MIF birincil etkileri belirleyebilirsiniz. Nöronlar, nöronal süreçleri ve arka makula ile ilişkili saç hücrelerinin morfolojisini incelemek için boyama Phalloidin ve asetillenmiş tubulin kullanarak, zebrafish iç kulak hedeflenen transfeksiyon için bir yöntem olarak elektroporasyon etkinliğini değerlendirmek mümkün. 24hpf embriyoların otik vezikül morpholinos ve electroporated enjekte edildi ve daha sonra hiçbir tedavi almış veya sadece enjekte veya electroporated olmuştu embriyoların karşılaştırıldı. Enjekte ve electroporated Embriyolar, saç hücre sayıları bir azalma olduğunu gösterdi statoacoustic ganglion (SAG) ve kontrol grupları ile karşılaştırıldığında daha az SAG nöronlar tarafından innervasyon azaldı. Sonuçları, daha sonraki aşamada otocysts içine morpholinos doğrudan teslim non-spesifik bir sinir sistemi ve nöral krest etkileri 1-8 hücre aşamasında teslim morpholinos önler olduğunu gösterdi. Ayrıca, iç kulak ve beyin, nöral krest veya periotic mezenşimin birincil etkileri kulak değil ikincil etkileri yönlendirilir etkilerinin incelenmesi.

24hpf zebrafish otocyst doğrudan morpholinos sunmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Otik vezikül ve penetrasyon etkisi elektroporasyon lümenine morpholinos, mikroenjeksiyon, morpholinos beyin üzerinde etkisi atlayacak ve iç kulak özgü efektler elde etmek mümkün.

Enjeksiyon ve Elektroporasyon Zebra balığı Otocyst içine MIF Morpholinos Stoktan teslim İç Kulak Geliştirme etkiler

Son yıllarda elektroporasyon; DNA, RNA ve morfolinoların ... dahil olmak üzere çeşitli dokulara in vivo transfeksiyonu için popüler bir teknik haline gelmiştir.

Aşağıdaki deneyin genel amacı; antisense, oligonükleotid, morpholino veya diğer gelişim bozucu molekülleri, döllemeden sonraki birinci gün veya 24. saat aşamasındaki zebra balığı otik bölgelerine doğrudan iletmektir. Bu örnekte, statik akustik ganglion gelişiminden sorumlu olan en erken nörotrofin olan ve makrofaj migrasyon inhibitör faktörü (MIF) olarak adlandırılan bir immün sistem sitokinine karşı morpholino'lar kullanarak, bu moleküle yönelik morpholino'ların iç kulak gelişimini veya nörogenezi etkileyip etkilemediğini belirliyoruz. Bu işlem, öncelikle mikroenjeksiyon yoluyla otik vezikül lümenine Morpholino'ların verilmesiyle gerçekleştirilir, ardından Morpholino'ların lümenden otik hücrelere nüfuz etmesini kolaylaştıran elektroporasyon uygulanır.Ardından, morphoların iç kulak gelişimi ve nörojenez üzerindeki etkilerini gözlemlemek için embriyolar 28.5 °C'de büyütülür. Takip eden birkaç gün içinde, sırasıyla kinosilyalarda asetillenmiş tübülini ve tüy hücresi yüzeyindeki stereosilyalarda aktini işaretleyen immünohistokimya ve boyama yöntemlerine dayanarak, iç kulak duyu tüy hücrelerinde azalmanın yanı sıra stato akustik ganglion tarafından yapılan innervasyonda da bir azalma olduğu sonuçlarına ulaşılır. Morphoların pili embriyosuna enjeksiyon ve elektroporasyon yöntemini başlangıçta laboratuvarda çok yetenekli bir lisans öğrencisiyle birlikte geliştirdik.Katie Holmes, bu yöntemi başarıyla zebra balığı boyutlarına indirgedi. Aralarında doktora sonrası araştırmacı Yuchi, lisansüstü öğrencisi Matt Wyatt ve laboratuvarın eski doktora sonrası araştırmacısı Deb Thompson'ın bulunduğu mevcut araştırma ekibi, bu tekniği zebra balıkları için geliştirdi. Bu yöntemin, kulak gibi bir organ sistemi üzerindeki spesifik morfolojik etkilerin, birçok organ sistemini etkileyen ve kulak üzerinde ikincil etki yaratan genel gelişimsel etkilerden (örneğin, kulağı ikincil olarak etkileyen beyin üzerindeki etkiler) ayırt edilip edilemeyeceği de dahil olmak üzere, gelişimsel biyoloji ve işitme araştırmaları alanlarındaki temel sorulara yanıt verebileceği umulmaktadır.Bu tekniğin bir ila dört hücreli evrelerdeki mikroenjeksiyonlar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, morfoları daha sonraki evrelerde doğrudan kulağa iletmesidir. Böylece, morfoların beyin üzerindeki doğrudan etkilerinde görülebilecek ikincil iç kulak etkilerinden kaçınılabilir. Elektrotları hazırlamak için yaklaşık üç ila beş santimetre uzunluğunda, 75 µm çapında tungsten tel keserek başlayın. Tungsten teli bir Molex kablo konnektörünün içinden geçirin.Ardından, tungsten telleri ve Molex kablo konnektörünü daralan makaronla sarın ve makaronun tele sabitlenmesi için bunsen beki veya ısı tabancasıyla ısı uygulayın. Daha sonra tungsten telin ucunu sivriltmek için, teli normal sodyum hidroksit çözeltisine daldırın ve diğer elektrot olarak bir ataş kullanarak teli kare dalga elektrot ile elektroliz edin. Kullandığımız koşullar, her biri 100 milisaniye süren ve aralarında 50 milisaniyelik boşluklar bulunan beş adet 50 voltluk darbedir.Elektrot ucunu normal sodyum hidroksite daldırarak üç tekrar gerçekleştirin. Elektrodu sodyum hidroksit içerisine biraz daha ilerletin ve bir tekrar daha yapın. Elektrodu, her iki seferinde de yaklaşık olarak aynı mesafede ilerleterek daha da derine daldırın ve son bir tekrar gerçekleştirin.Bu kademeli bileme işlemi, elektrot üzerinde çok ince bir uç oluşturarak elektrotların gelişmekte olan zebra balığı embriyosuna daha doğru ve daha az hasar verici şekilde yerleştirilmesine olanak tanır. Zebra balığı otik veziküllerine morpholino mikroenjeksiyonu için elektroporasyon yapmadan önce telleri bir tepsi içindeki modelleme kiline bastırılmış halde tutun. İlk olarak, akşam saatlerinde erkekleri dişilerden ayırmak için plastik bir bölme içeren üretim tanklarını hazırlayın.Dört erkek ve dört dişiyi tanka yerleştirin ve tankı gece boyunca 14 saat ışık 10 saat karanlık döngüsünün olduğu bir inkübasyon odasında bırakın. Ertesi sabah ışıklar açıldıktan sonra, bölmeyi çekin ve balıkları yaklaşık 20 ila 30 dakika boyunca rahatsız etmeden bırakın. Erkekleri dişilerden ayırın ve damızlıkları üretim tankından çıkarın.Bunları taze balık suyu içeren tanklara yerleştirin. Yumurta içeren suyu bir süzgeçten geçirerek embriyoları üretim tankından toplayın. Yumurtaları bir Petri kabına boşaltmadan önce süzgeçte birkaç kez taze yumurta suyu ile durulayın.Döllenmemiş veya opak yumurtaları uzaklaştırın ve embriyolar kuluçka sürecindeyken, onları 0.3 PP m metilen mavisi içeren embriyo büyütme ortamında 28.5 °C'de gece boyunca inkübe edin. Enjeksiyondan hemen önce, bir Sutter P 97 elektrot çekici ile cam iğneler çekin. 10 mm'lik bir Petri kabı içinde balık suyunda %1 agros içeren bir AROS jel tabanını su banyosunda 37 °C'ye ısıtın; balık suyunda %1 düşük erime noktalı AGROS veya LMPA'yı eriyene kadar ısıtın ve 37 °C'lik su banyosunda sıcak tutun.Cam bir iğneyi morfo çözeltisiyle doldurun ve ucunu uygun çapta, yaklaşık 10 ila 15 mikron olacak şekilde kesin. Enjeksiyon iğnesini, nitrojen tankına bağlı bir PV eight 20 pnömatik piko pompaya eklemlenmiş bir mikro manipülatöre monte edin. Embriyoları döllenmeden 24 saat sonra dekore edin ve 0.3 PPM metilen mavisi içeren balık suyu içindeki trica ile anesteziye alın.Ardından, kolay ve standart bir analiz için üç ila beş anestezi uygulanmış embriyoyu sağ tarafları yukarı gelecek şekilde AROS jel tabanına hizalayın, her bir embriyonun üzerine bir ila iki damla %1 LMPA damlatın ve embriyoyu sabitlemek için katılaşmasını bekleyin. Otik vezikül sağ tarafa gelecek şekilde Petri kabını döndürün. Daha sonra iğneyi otik vezikül lümenine yerleştirin ve ayak pedalını kullanarak morfo solüsyonunu enjekte edin.Mikroenjeksiyondan hemen sonra, elektroporasyon istasyonunu kurmak için monte edilmiş embriyoları elektroporasyon istasyonuna taşıyın. İlk olarak, ucu sivriltilmiş 75 µm tungsten elektrotları mikro manipülatörlere bantla sabitleyin. Ardından, mikro manipülatörleri diseksiyon mikroskobu tablasının her iki yanına yerleştirin.Elektroporasyon cihazını açın ve elektroporasyon parametrelerini ayarlayın. Bu deney için en etkili parametrelerin, her biri arasında 100 ms olan, iki ms süreli üç adet 13 V puls olduğu belirlenmiştir.Elektrotları, otik vezikül eşit şekilde iki yanda kalacak şekilde, bir elektrot otik vezikülün yüzeyselinde, diğeri ise derininde olacak şekilde yerleştirin. Ardından, bir ayak pedalı kullanarak veya bir şaltere basarak akım uygulayın ve elektroporasyon tamamlandığında işlemi sonlandırın. Agarosların üzerine balık suyu dökün ve cam bir pipet yardımıyla plakayı nazikçe çevirerek embriyoları alın.Çıkarılması zor olan embriyolar için, embriyolara zarar vermemeye dikkat edin. Çevresini saran LMPA'yı nazikçe ayırmak için bir iğne kullanın. Embriyoları metilen mavili balık suyuna sahip bir plakaya aktarın ve morfolojik immünohistokimyasal analizler için embriyoları istenen evrelere kadar büyütün.C iki hibridizasyon ve mikroskobik analizinde, kulak enjeksiyonu ve morpho'ların elektroporasyonuna ait temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. Phin red ile işaretlendiğinde, posterior veya işitsel makula (PM), balıktaki işitme organlarından biridir. Bu fotoğrafta, duyusal tüy hücreleri üzerindeki stereosilyalardaki aktin demetleri, ping pong üzerinde kırmızı noktalar şeklinde görünmektedir.Döllenmeden üç gün sonraki, yalnızca MIF morfları enjekte edilmiş bir embriyoda Phin ile floresan işaretleme ile görülen kürek şeklindeki makula, hem elektroporasyon uygulanmış hem de enjekte edilmiş aynı yaştaki embriyolarla karşılaştırıldığında, tüy hücrelerindeki stereosilyalar içinde daha fazla aktin filamenti göstermektedir. Bununla birlikte, standart kontrol morfo ile enjeksiyon ve elektroporasyon, yalnızca morfo enjeksiyonuna kıyasla azalmış F ve boyanmaya neden olmamıştır. Sonuçlar posterior makulada da benzerdir, ancak yalnızca MIF morfoları enjekte edilen embriyo ile karşılaştırıldığında, enjekte edilen ve elektroporasyon uygulanan beş günlük larvalarda bu durum daha az belirgindir.Standart kontrol morph kullanıldığında, sadece enjeksiyon ile elektroporasyonlu enjeksiyon arasında fark görülmemiştir. Asetillenmiş tübülin karşıtı bir antikorla boyanan bu embriyo, herhangi bir MIF Morph enjeksiyonu veya elektroporasyonu almamıştır. Bu embriyo ise elektropore edilmiş ancak herhangi bir enjeksiyon almamıştır.Her iki embriyo da normal asetillenmiş tübülin boyanması göstermektedir. Bu embriyoların her ikisine de enjeksiyon ve elektroporasyon uygulanmıştır. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, tübülin boyanmaları gözle görülür şekilde azalmış olup, kulakla ilişkili nöronal çıkımlar ile çevre gangliyonlarda çok daha az çıkım izlenmiştir.Kontrol morpho enjeksiyon ve elektroporasyon için kullanıldığında, sadece morpho enjekte edilenlerle karşılaştırıldığında, asetil tubulin boyamasının yaygınlığında bir azalma veya akustik ganglion tarafından yapılan innervasyonda bir düşüş gözlemlenmemiştir. Bir kez ustalaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık iki saatte tamamlanabilir. Tekniğin ustalaşılması en zor kısmı elektroporasyondur; beyne zarar vermemek için özel bir dikkat gösterilmelidir, bu sorunu hafifletmek için sivriltilmiş elektrotlar yardımcı olacaktır.

direct-delivery-mif-morpholinos-into-zebrafish-otocyst-injection

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mikroenjeksiyon döllenmiş zebrafish embriyolar içine yabancı maddeler tanıtmak için bir köklü ve etkili bir yöntemdir. Burada, mRNA aşırı ekspresyonu gerçekleştirmek için sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği ve morfolino oligonükleotid gen devirme çalışmaları zebrafish göstermektedir.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

Bu video morfolino veya mRNA sonraki gelişimi sırasında spesifik gen ürünlerinin seviyesini azaltmak veya artırmak için tek hücreli aşamada zebrafish embriyoların nasıl enjekte edilebilir gösterir.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

Intravitreal antisens morpholinos enjekte ve retina içine electroporating koşullu yetişkin zebrafish retinanın bir hedef protein ifade demonte bir yöntem açıklanmıştır. Ortaya çıkan protein yenileyici veya sağlam retina proteinin rolünü test edilmesine imkan sağlayan birkaç gün, nakavt edilir.

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Biz, koşullu yetişkin zebrabalıkları fin rejenerasyon sırasında bir hedef protein ifadesini demonte için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, mikro-enjeksiyon ve yara iyileşmesi, blastem oluşumu ve rejeneratif akıbet de dahil olmak üzere yüzgeç yenilenmesi çeşitli aşamalarında, proteinin rolünü test verir fin dokuya antisens oligonükleotid morpholinos electroporating içerir.

Yenileyici Yetişkin Zebra balığı Tail Fin içine Morpholinos in vivo olarak Elektroporasyon

Fare iç kulak olan gelişim programı gebelikte özenli bir taslakları kaynaklı duyu organıdır. Biz bir...

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporasyon

Protokol, zebra balığında gen ekspresyonunun kuyrukta morfolino enjeksiyonu ile hedefli olarak yok edilmesini açıklar.

Morfolino Enjeksiyonu: Zebra Balıklarında İşlevi İncelemek İçin Hedef Gen Ekspresyonunu Yıkmak İçin Bir Yöntem

Bu yazıda, morfolino antisens oligonükleotidler kullanılarak yetişkin zebrabalıkları telencephalon ventriküler hücrelerde gen ifadesinin manipülasyonu için bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz, yetişkin omurgalı beynin fonksiyonel çalışmalar için kullanılan bir hızlı ve verimli protokolü olarak bu yöntem sunuyoruz.

Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon

Bu tür gen-spesifik morpholinos intraventriküler enjeksiyonları kullanarak doku rejenerasyonu gibi gelişme ve fizyolojik homeostasis sonraki aşamalarında gen fonksiyonunu değerlendirmek için zebrabalıkları için uyarlanabilir ters genetik bir yöntem.

Zebra balığı Larva Çoklu Zor-hedef dokular geçiştirilmesi için Kardiyak Ventriküler Injection kullanarak Genetik Morfolino Yaklaşım ters

Ovo elektroporasyonunu kullanarak, devre montajının ayrı dönemlerinde kırılgan X mental retardasyon proteininin hücre grubuna özgü bir nakavtını sağlamak için tavuk embriyolarındaki işitsel iç kulağı ve koklear çekirdeği seçici olarak transfekte etmek için bir yöntem geliştirdik.

In Ovo Electroporation tarafından İşitsel Bir Devrede Kırılgan X Mental Retardasyon Proteininin Hücre Otonom Fonksiyonunun Diseksiyonu

E16 Rat Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

Öğrenin, mikroenjeksiyon ve elektroporasyon kullanarak Danio rerio otosistine MIF morfolino teslimatı yapmayı. Bu yöntem, iç kulak gelişimini incelemek ve istenmeyen beyin etkilerini en aza indirmek için geliştirilmiştir.

Enjeksiyon ve Elektroporasyon Zebra balığı Otocyst içine MIF Morpholinos Stoktan teslim İç Kulak Geliştirme etkiler

Daha fazla video keşfet