Name: İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Öğrenin, fare iskelet kasından miyojenik ve adipojenik progenitör hücreleri izole etme yöntemini. Akış sitometrisi ile saflaştırma, doku rejenerasyonu çalışmalarında hücre canlılığı ve farklılaşma analizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Doku Toplama: <ol><li> 7 ile 12 hafta arasında farelerin kullanın. Genellikle, en az iki hayvan kullanılır: Biri, tazminat ve floresan-eksi izotip kontrol örnekleri için gerekli FACS tek renkli kontrolleri kurmaktır. Diğer sıralama için gerçek bir örnek. </li><li> CO 2 inhalasyon fareler Euthanize ya da tercih edilen bir etik protokole göre. Fare kürk, bir kağıt havlu, yukarı bakacak, ve% 70 etanol ile sprey üzerine koyun fareler iyice bulaşmasını önlemek için. </li><li> Forseps ile karın bölgesindeki cilt kaldırın, sonra keskin bir makas ile küçük bir uzunlamasına kesilmiş. </li><li> Peel deri zıt yönlerde iki flep (yukarı ve aşağı) altında arka bacak kaslarını tamamen açığa çıkarmak için. </li><li> Tibia her iki tarafın birlikte makas ekleme ve uzatarak Vergi kas dokusu. </li><li> Kas dokusu ayıklamak için femur için de aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Her fare doku için bir çanak kullanarak, 60mm Petri-yemekler tüm eksize kas dokusu yerleştirin. </li><li> Tüm fareler için yukarıdaki işlemi tekrarlayın. </li></ol> 2. Into Enzimatik Sindirim Tek Hücreler Doku ayrıştırmaları: Protokol bu bölümü boyunca, steril reaktifler ve araçları kullanmak ve steril koşullar altında çalışmak. <ol start="9"><li> Her Petri-çanak, 2 kollajenaz II mL (Sigma, kedi # 6885, 500u / ml) ve 250mm CaCl 2 stokunun 20 mcL ekleyin . </li><li> Kadar kirlenmiş çıkarmak ve atmak için dikkat iki forseps (tek dişli, 2 diş Güzel Bilim Araçlar, kedi # 11.051-10, 11.154-10) ile küçük parçalar (yaklaşık 1 mm 3), kas dokusu içine Gözyaşı mümkün olduğunca olmayan kas dokusu. </li><li> Petri-yemekleri Kapak ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Petri-yemekleri Al ve tam olarak mash doku parçaları 3 ml'lik bir şırınga pistonu kullanabilirsiniz. Bulaşmayı önlemek için her bir örnek için bir piston kullanın. </li><li> Her Petri yemek (~ 5 ml) steril soğuk PBS (gerekli tüm doku kurtarmak için Petri-bulaşık durulama) ekleyin ve 50 ml Falcon tüp içine doku çamur transferi </li><li> Falcon tüp şiddetle Sarsıntı, PBS ile tüp doldurmak, santrifüj @ 800rpm x 5 dakika (Eppendorf tezgah üstü Model: 5810R), ve supernatant aspire (tekrar 3 defa) </li><li> 37 derece sıcaklıkta inkübe edin, her tüp ve CaCl 2 10μL (250mm): 1 ml kollajenaz D karışımı (Roche, Kedi # 11088882001, 1.5u / ml) / Dispase II (04942078001, 2.4u / ml Roche, Kedi #) ekleyin bir saat boyunca dönme ile Santigrat. </li><li> Soğuk, steril PBS, vortex ve doku homojenize iyice pipet 5-10 ml ekleyin. </li><li> PBS ile tüpler kadar doldurun ve iyice karıştırın. </li><li> Sıvı, doku kalan büyük parça süzmek için 50 ml Falcon tüp üstüne yerleştirilir 40μm hücre süzgecinden aktarın. Eşit üç 50ml Falcon tüpleri içine her bir örnek bölün. PBS, 5 dakika sonra 8 santigrat derece @ 1600rpm santrifüj tüpleri her doldurun. </li><li> Süpernatantı atın ve boyama hücreleri toplamak. </li></ol> 3. Antikor Boyama ve sıralama: Protokol bu bölümü boyunca, steril FACS ve toplama tamponlar ve steril koşullar altında çalışmak. Ticari antikorlar, eğer uygun bir biçimde ve genellikle steril olarak kabul edilir. <ol start="20"><li> Tek renk ve izotip kontrol numuneleri için, 1 ml FACS tampon örnek tekrar süspansiyon ve dokuz 1.5mL ön etiketli Eppendorf tüpleri (100 mcL her tüp) askıya hücreleri bölmek. <ol><li> Aşağıdaki tabloya göre ayarlayın tek renk boyama karışımları: DİKKAT: leke izotip kontrol antikorların nihai konsantrasyonu, onlar için kontrol birincil antikor uymalıdır . Örneğin, anti-Sca-1 1 μg/10 6 hücreleri için kullanılan, ilgili izotip aynı konsantrasyonda olması gerekir. <table border="1"><tbody><tr><td> Tüp # </td><td> Tüp Adı </td><td> Şirket </td><td> Kedi # </td><td> klon </td><td> izotip </td><td> seyreltme </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Sigara-boya </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Hoechst33342 </td><td> sigma </td><td> B2261 </td><td></td><td></td><td> 2-5ug/ml </td></tr><tr><td> 3 </td><td> PI </td><td> sigma </td><td> P4864 </td><td></td><td></td><td> 1ug/ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> 4 </td><td rowspan="2"> CD31-FITC CD45-FITC </td><td> ebioscience </td><td> 11-0311-85 </td><td> 390 </td><td> Rat IgG2a </td><td> 500 </td></tr><tr><td> House yapımı </td><td></td><td> I3 / 2 </td><td> Rat IgG2b </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> SCA1-PECY7 </td><td> ebioscience </td><td> 25-5981-82 </td><td> D7 </td><td> Rat IgG2a </td><td> 5000 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> α-7 APC </td><td> House yapımı </td><td></td><td> R2F2 </td><td> Rat IgG2b </td><td> 1000 </td></tr></tbody></table></li><li> Izotip kontrol boyama aşağıdaki tabloyu kullanarak karışımları ayarlayın: <table border="1"><tbody><tr><td> Tüp # </td><td> Isim tüp </td><td> Hoechst </td><td> PI </td><td> CD31- FITC </td><td> CD45- FITC </td><td> Scal- PE-CY7 </td><td> a-7- APC </td><td> Rat- IgG2b- APC </td><td> Rat- IgG2a- pecy7 </td><td> Rat- IgG2a- FITC </td><td> Rat- IgG2b- FITC </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Izo CD31 / CD45 </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> 8 </td><td> Izo Scal- pecy7 </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 9 </td><td> Izo α-7 APC </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table></li><li> Adım 20 uygun Eppendorf tüpe pipetleyin, tek renk ve izotop kontrol boyama karışımları (genellikle 5 ila 10 mcL karışımı boyama her numune eklenir böylece antikor konsantrasyonunu ayarlamak). İyice karıştırın ve 1 saat süreyle buz üzerinde kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol></li><li> FACS hücre sıralama için antikor kokteyli 800μL (aşağıda) ile örnek fare hücreleri Leke. İyice karıştırın ve 1 saat süreyle buz üzerinde kuluçkaya yatmaktadır. Antikor kokteyli: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, SCA-1-PECY7, α-7 APC DİKKAT: partiler arasında önemli farklılıklar var, bireysel olarak her bir antikor titre hücrelerine antikor optimal oranı tespit edilmelidir . Kullanılmak üzere antikor optimal miktarı 10 6 başına hedef hücreleri antikor μgs ifade ve aynı parti antikor kullanarak sabit tutulmalıdır. Açıkçası, hedef hücrelerin sayısı deneyler arasında önemli bir değişiklik yoksa, ya da boyama hacmi hücre sayısı ile ölçekli ise, her antikor sabit bir seyreltme de kullanılabilir. </li><li> Yıkama: 9 kontrol tüpleri her FACS tampon yaklaşık 1 ml ekleyin; örnek tüp FACS tampon yaklaşık 20ml ekleyin. </li><li> 5 dakika Eppendorf tüpleri @ 3000rpm (: 5417C Eppendorf masa üstü santrifüj, Model) santrifüjleyin. Örnek tüp @ 1600rpm (: 5810R Eppendorf masa üstü santrifüj, Model) 5 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Aspire ve tüm tüpleri süpernatant atın. </li><li> FACS tampon (kontrollerin her biri için 1 ml, sıralama örnek 4ml) yeniden süspanse hücreleri, FACS tüpler "hücre süzgeç kapağı ile (BD Falcon kedi 352.235, gözenek boyutu 40μm) pipetlenir hücreleri olabilir kalan kümeleri kaldırmak için sitometresinin etkileyebilir. </li><li> Tek renk denetimleri ve izotipi kontrolleri ile FACS Sıralayıcısı ayarlayın. </li><li> 3.5 mL toplama tampon (% 95,% 5 DMEM FBS) ayrı ayrı aşağıdaki tabloda göre sıralanmış hücreleri toplayın. Normalde, her iki arka bacaklarda hasat, bir tek yabani tip fare prosedürün sonunda FACS lisansüstü sıralanmış hücreleri tarafından değerlendirilecek% 95 üstünde canlılığı ile 150.000 miyojenik progenitör hücreleri veya 100.000 adipogenic progenitör hücreler, (Şekil 1 hakkında getirebilimektedir ) Yüzey boyama dayalı miyojenik ve adipogenic atalarıdır tanımı <table border="1"><tbody><tr><td> Antikor / leke </td><td> Miyojenik progenitör (MP) </td><td> Adipogenic progenitör (AP) </td></tr><tr><td> Hoechst </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> PI </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td>- </td><td> - </td></tr><tr><td> SCA1-PECY7 </td><td> - </td><td> + </td></tr><tr><td> α-7 APC </td><td> + </td><td> - </td></tr></tbody></table></li></ol> 4. Nakli: <ol start="28"><li> @ 1500rpm 5 dakika otoklava Eppendorf tüpleri (1,5 ml), süpernatant ve transfer hücreleri çıkarmak sıralanmış hücreler santrifüj, @ 3000rpm santrifüj 5 dakika sonra, steril PBS (serum serbest!) 500 mcL hücreleri durulayın. Steril koşullar tüm reaktifler bakımı ve doku kültürü kaputu çalışan, yaklaşık 10 6 hücre / ml PBS içinde miyojenik progenitörlerle veya Matrigel adipogenic progenitör (BD kedi # 354.234) tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Miyojenik atalarıdır veya alıcı farelere adipogenic progenitör nakli. <ol><li> Isoflouran kurumunuzun politikasına göre fare uyuşturan. </li><li> Enjeksiyon bölgesi etrafında saç Tıraş, daha sonra% 70 etanol ile ovularak cilt sterilize </li><li> 3 / 10 CC insülin enjektörü ile miyojenik atalarıdır veya adipogenic atalarıdır (= 20k hücreleri) 20μL (BD kedi # 309.300) enjekte edilir. </li></ol></li><li> Uygun bir süre sonra (üç hafta iyi çalışır, ancak donör elde edilen transgenik belirteçlerinin ifade myofibers sonra bir hafta içinde nakli genellikle belirgindir), (Sigma Kedi # T04840-2, 400 mcL Avertin intraperitoneal adım 29 alıcı fareler uyuşturan 25 mg / ml), daha sonra 15 mL% 4 PFA tarafından takip 50ml PBS (10 mcM EDTA içeren), transcardially serpmek. Gerekirse bir gecede% 20 sakaroz transfer, sonra bir gecede% 4 PFA ile hedef doku, post-fix toplayın. OCT, dondurma ve cryosection Embed. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: MP fare iskelet kas içine nakledilen zaman, onlar hemen öncesi mevcut myofibers ile kaynaşıyor. Bu nedenle donör hücreleri genetik etiket varsa onları alınan lifler kolayca tanınabilir olacaktır. Şekil 2 nakledilen hücreler, insan alkalin phostphatase ifade histokimyasal ortaya bir örnek gösterir. AP nakledilen sonucu nakli sitenin çevreye son derece bağlıdır: subkutan bu hücreler (bkz. Şekil 2) adipositlerde ve miyofibroblastlar kökenleri vermek nakledilen zaman. Yağlı dejenerasyon 3 olusup sürece kas dahil pek çok diğer siteler, hayatta yok. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Iskelet kası progenitör popülasyonlarının izolasyonu için strateji Sıralama (A) Sıralama strateji: Canlı hücreler, forward scatter ve yan dağılım dayalı tespit edildi . Hoechst boyama ölü hücreleri hariç anuclear enkaz ve propidium iyodür (PI) boyama dışlamak için kullanıldı. Hematopoetik (CD45) ve endotelyal (CD31) hücreleri sıralama kapıları çıkarıldı. Α7 + Hoechst + PI-CD45 - CD31 - scal - alt kümesi tüm miyojenik atalarıdır (MP) içerir. Scal + Hoechst + PI-CD45 - CD31 - α7 - Nüfus adipogenic atalarıdır (AP) içerir. (B) Floresan-eksi-one (FMO) izotip kontrolleri leke özgüllüğü onaylayın. (C) Saflık sıralama sonra MP ve AP altkümelerini denetler. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. MP ve AP nakli AP Temsilcisi sonuçları subkutan nakledilen (üst panel) ve MP intramüsküler (alt panel). Her iki durumda da, donör hücreleri kahverengi lekelere tarafından tespit edilen transgenik insan alkalen fosfataz ifade eden bir fare, kaynaklanmıştır.

<ol><li>Buckingham, M., Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle stem cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 330-336 (2008).</li>
<li>Relaix, F., Marcelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 21, 748-753 (2009).</li>
<li>Joe, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).</li>
<li>Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro%2Fadipogenic+progenitors%3A+A+double-edged+sword+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Cycle. 9, (2010).</li>
<li>Sherwood, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119, 543-554 (2004).</li>
<li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. , (2008).</li>
<li>Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309, 2064-2067 (2005).</li>
</ol>

Bu protokolün amacı, yüksek verim ve yüksek saflaştırılmış hücrelerinin canlılığı arasında makul bir denge. Sağlıklı hücreleri kurtarıldı olduğunu sağlanmasında en önemli adım, tahmin edilebileceği gibi, başlangıç ​​doku enzimatik ayrılma. Doku taşıma göstermek ya da görsel-işitsel bir formatta bile takdir etmek zordur, özellikle nazik olmalıdır. Bir diğer önemli faktör, prosedürün uzunluğu. Uzun bu nedenle düşük canlılığı ve engraftman verimliliği donörden alıcı hayvan gitmek için alır. PI sıralama sonra saflaştırılmış hücre örneklerinde pozitif olay sıklığı bakarak hemen cevap değildir canlılığı ile ilgili herhangi bir soru olmalı mıdır, biz clonogenicity ölçmek için bir sınırlayıcı seyreltme tahlil 3 yapılır öneririz. Hasarsız kas tipik bir türlü rutin in vitro miyojenik veya fibrotik / adipogenic koloniler başlatma yeteneğine sahip 15-20 hücreleri yaklaşık 1 verim. Milletvekilleri başlatılan kolonilerin aslında% 100 farklılaştırılmış myotubes içerirken, FAPS elde edilen koloniler, sadece yaklaşık üçte biri, düz kas aktini pozitif miyofibroblastlar ek adipositler içerir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Kollajenaz II. </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-6885, </td><td> 500 u / ml </td></tr><tr><td> Kollajenaz D </td><td> Roche </td><td> 11088882001 </td><td> 1.5 u / ml </td></tr><tr><td> II çekilin </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 2.4 u / ml </td></tr><tr><td> hücre süzgecinden </td><td> BD </td><td> 352340 </td><td> 40 mikron </td></tr><tr><td> Tüp hücre süzgecinden </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> 40 mikron </td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2261 </td><td> 2-5 ug / ml </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> Ebiosciences </td><td> 11-0311-85 </td><td> Klon 390 </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td> Ev yapımı </td><td></td><td> Klon I3 / 2 </td></tr><tr><td> SCA1-PECY7 </td><td> Ebiosciences </td><td> 25-5981-82 </td><td> Klon D7 </td></tr><tr><td> α-7 integrin APC </td><td> Ev yapımı </td><td> Rossi laboratuar ile Inquire </td><td> R2F2 </td></tr></tbody></table>

İskelet kası progenitörlerin saflaştırılması

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

İskelet kası, birden fazla farklı embriyonik kökenleri ve gelişim potansiyeli progenitör popülasyonlar içerir. Genellikle myofiber plazma membran ve ensheaths bu laminin zengin bazal membran arasında bir &quot;uydu hücre pozisyonu&quot; ikamet miyojenik progenitörlerle sadece miyojenik soy 1,2 kararlıyız kendini yenileyen hücreler vardır. Biz, son zamanlarda, miyofibroblastlar ve verimli bir şekilde çoğalması girerek zarar yanıt ve doku rejenerasyonu 3,4 sırasında miyojenik hücrelere trofik destek sağlar beyaz adipositler üretebilir gemi ilişkili atalarıdır ikinci sınıf bir tarif var. Belirli bir hücre popülasyonu gelişimsel ve rejeneratif potansiyelini belirlemek için en güvenilir testlerin biri izolasyon ve 5-7 nakli dayanmaktadır. Bu amaçla biz Biz bu makalede anahat enzimatik ayrışmış kas flow sitometri, protokolleri kendi temizlemesi için optimize var. Bu yöntemi kullanarak elde edilen popülasyonları miyojenik veya fibrotik / adipogenic koloni oluşturan hücreler de içerecektir: başka bir hücre tipleri, in vitro genişleyen veya in vivo teslim kalan yeteneğine sahiptir. Ancak, bu popülasyonların bir taze sıralaması altkümelerini, koloniler kurma veya alıcıların engrafting yeteneğinden yoksun diğer kirletici hücreleri içerebilir akılda tutmak gerekir moleküler analizi (örneğin QRT-PCR) için sıralama hemen sonra kullanılır.

Enzimatik disosiasyon, fibro / adipogenic ve fare iskelet kası miyojenik atalarıdır flow sitometri ile yüzey etiketleme ve arıtma yöntemi.

İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

İskelet kası, farklı embriyonik kökenlere ve gelişim potansiyellerine sahip çok sayıda progenitör popülasyonu içerir. Genellikle ...'da bulunan miyojenik progenitörler...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ayna iskelet kasından canlı miyojenik ve adipojenik progenitör hücreleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle ötanize edilen farelerden kas dokusunun hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, örneğe enzimatik sindirim uygulanarak doku tekil hücrelere ayrıştırılır.Ardından, progenitör hücreleri izole etmek için floresanla aktive edilmiş hücre ayıklama veya FACS kullanılır. İzole edilen hücreler resipiyent farelere nakledildiğinde, bu örnekte insan alkali fosfataz olan genetik belirteç için yapılan histokimyasal boyama ile hücrelerin canlılığını ve farklılaşmasını gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin prepl gibi önceden mevcut tekniklere göre temel avantajı, hücrelerin farklı zaman noktalarında doğrudan hayvandan izole edilebilmesidir.Örneğin, doku hasarı indükledikten sonra hücre popülasyonu üzerinde herhangi bir seçim yapılmadığı için, hücre popülasyonu moleküler düzeyde analiz edilerek hücrelerin in vivo rejenerasyon sürecinde geçtikleri farklı aşamalar incelenebilir. Dolayısıyla bu teknik, doku rejenerasyonu alanındaki kritik bir sorunun, özellikle de in vivo rejenerasyon sırasında her bir hücre tipinin nasıl bir rol oynadığının ve sağlıklı bir dokuyu yeniden inşa etmek için bu hücre tiplerinin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğinin yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin uygulamaları, kas distrofisi gibi hastalıkların tedavisine kadar uzanmaktadır.Bu öncül hücrelerin incelenmesi, nihayetinde bu tür hastalıklar için rejeneratif stratejilerin geliştirilmesine olanak sağlayabilir. Ayrıca, bu tekniğin etkileri, kalpten adipoz dokuya kadar birçok farklı dokuyu kapsamaktadır; çünkü fibro-adipojenik öncül hücrelerin, şimdiye kadar test ettiğimiz her bir dokuda bulunduğu saptanmıştır. Genel olarak, bu tekniği yeni kullanmaya başlayanlar zorluk yaşayacaktır; çünkü sert disosyasyon teknikleri hücre canlılığını azaltacak ve daha sonra hücrelerin temiz bir şekilde ayrılmasını engelleyecek çok fazla döküntüye yol açacaktır.Bu yöntem için ilk fikir, genellikle APOE hücreleri için kullanılan akış sitometrisini katı dokulardaki kök hücrelerin incelenmesine uygulama kararı aldığımızda ortaya çıktı. Doku ayrıştırma adımlarının düzgün bir şekilde tarif edilmesi çok zor olduğundan ve öğrenilmesi güç olduğundan, bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi önem taşımaktadır. Bu tekniği, laboratuvarımda yöntemi ilk geliştiren ve optimize eden araştırma asistanım Linky bugün uygulamalı olarak gösterecektir. Bu prosedür için en az iki fare gereklidir.Hücreler için gerekli tek renk ve antikor izotip kontrollerini sağlamak amacıyla bir fare, sıralanacak örneği sağlamak amacıyla ise bir diğer fare kullanılır. Başlamak için, daha önce steril bir laboratuvar davlumbazında ötanazisi yapılmış, yedi ila 12 haftalık fareler temin edin. Ötanazi uygulanmış fareyi, bir elinizde penset ve diğer elinizde keskin bir makas varken, kontaminasyonu önlemek için tüylerini %70 ethanol ile iyice püskürterek steril bir kağıt havlu üzerine sırtüstü yerleştirin.Karın bölgesindeki deriyi kaldırın ve küçük bir boylamsal insizyon yapın. İnsizyonun her iki yanındaki deriyi kavrayın ve arka bacak kaslarını tamamen açığa çıkarmak için deriyi geriye doğru soyun. Ardından, kapalı makası kasın altına ve tibia kemiğinin üzerine yerleştirip makası açarak kas dokusunu eksize edin.Bıçağın arka kenarı, kasın tibia'dan nazikçe ayrılmasını sağlayacaktır. Tibianın her iki tarafı için işlemi tekrarlayın ve dokuyu 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Şimdi aynı yöntemle femur üzerindeki kas dokusunu çıkarın ve dokuyu petri kabına ekleyin.Her bir fare için, fare başına bir petri kabı kullanarak işlemi tekrarlayın. Ardından, dokuyu tekil hücrelere ayrıştırın. Her bir kas dokusu içeren Petri kabına iki mililitre veya 1000 ünite kollajenaz ve 250 milimolar kalsiyum klorür stok çözeltisinden 20 mikrolitre ekleyin.Ardından hızlı ve dikkatli bir şekilde çalışın. Dokuyu bir kübik milimetrelik parçalara ayırmak için biri tırtıklı, diğeri ise iki dişli iki adet gri pens kullanın. Mümkün olduğunca çok kas dışı dokuyu çıkarın ve atın.Petri kaplarını kapatın ve 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin. İnkübasyonun ardından kapları geri alın ve steril laboratuvar kabinine yerleştirin. Üç mililitrelik bir şırınganın pistonunu çıkarın ve dokuyu ezmek için kullanın.Çapraz kontaminasyonu önlemek için plaka başına bir piston kullanın. Her Petri kabına yaklaşık beş mililitre soğuk steril PBS ekleyin ve kabın içeriğini 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Tüm dokuyu geri kazanmak için beş mililitre PBS ile daha durulama yapın ve bunu konik tüpe ekleyin.Numuneleri protokole uygun olarak üç kez yıkayın ve santrifüjleyin. Ardından, her tüpe kollajenaz D dys space iki ve kalsiyum klorür içeren bir mililitre çözelti ekleyin ve 37 °C'de rotasyonla bir saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüplere beş mililitre soğuk steril PBS ekleyin, tüpleri kısa süre vorteksleyin ve topakları dağıtmak için birkaç kez trite edin.Tüpleri PBS ile doldurun, iyice karıştırın ve buza yerleştirin. Kalan büyük doku parçalarını uzaklaştırmak için, buza yerleştirilmiş 50 mililitrelik konik bir tüpün üzerine 40 mikronluk bir hücre süzgeci yerleştirin ve hücre süspansiyonunu süzün. Süzülen sıvıyı, soğuk ve steril PBS ile doldurulmuş üç adet 50 mililitrelik konik tüpe eşit olarak paylaştırın ve sekiz derece santigrat sıcaklıkta beş dakika boyunca 1600 RPM'de santrifüj edin. Santrifüj işleminin ardından, süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve miyojenik ve adipojenik progenitör hücrelerin boyanması ve sort edilmesi için hücreleri buza yerleştirin.İlk olarak, beraberindeki yazılı protokole uygun olarak altı tek renk boyama karma kontrolünü hazırlayın. Bu kontroller; boyasız kontrol, hulk boyama, propidyum iyodür, CD 31 ve CD 45 FSE işaretli antikorlar, SC one P size seven işaretli antikor ve alpha seven A PC işaretli antikoru içerir. Ardından, yazılı protokole uygun olarak üç antikor izotip kontrol boyama karışımını hazırlayın.Boyama karışımları hazırlandıktan sonra, tek renk ve izotip kontrol örnekleri için dokuz adet 1,5 mililitrelik eppendorf tüpünü etiketleyin. Üç konik tüpteki hücreleri, toplam bir mililitre FACS tamponu hacminde yeniden süspandere edin ve birleştirin. Ardından, her bir etiketli eppendorf kontrol tüpüne 100 mikrolitre hücre paylaştırın ve antikorların konsantrasyonuna bağlı olarak, ilgili kontrol tüplerine beş ile 10 mikrolitre arasında boyama karışımı pipetleyin.Örnek fareden alınan hücreleri 200 µL fax tamponu içinde yeniden süspande edin ve 50 mL'lik konik tüplerden birinde birleştirin. Ardından 800 µL antikor kokteyli ekleyin. Kontrol tüplerinin ve örnek tüplerinin her birini karıştırın.Bunları bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyonun ardından, dokuz kontrol tüpünün her birine 1 mL FACS tamponu ve örnek tüpüne yaklaşık 20 mL FACS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın. Kontrol tüplerini 3000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj edin.Numune konik tüpünü 1600 RPM hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, santrifüj sonrası üst fazı aspire ederek atın. Kontrol hücrelerini her bir eend orph tüpünde 1 mL fax tamponu ile, numune hücrelerini ise 4 mL fax tamponu ile yeniden süspande edin.Propidium iyodürü örnek hücrelere, izotip kontrollere ve pi tek renk kontrol tüpüne ekleyin. Sitometreyi etkileyebilecek kalıntı kümeleri gidermek için hücreleri hücre süzgeçli kapak aracılığıyla fax tüplerine pipetleyin.Faks cihazını tek renk ve izotip kontrolleri ile kurun. Örnek hücreleri beraberindeki yazılı protokole göre ayırın ve her bir popülasyonu ayrı ayrı toplayın. Ve 3,5 mililitrelik bir toplama tüpüne alın. Canlı miyojenik progenitörler; hulked, alfa yedi a PC pozitif ve PI CD 31 FE CD 45 FE ve ska olan popülasyondur.Bir adet PE boyut 7 negatif canlı adipojenik progenitörler, ska 1 PE boyut 7 pozitif ve pi CD 31 FE CD 45 FE ve alfa yedi a PC negatiftir. Tek bir vahşi tip fare, %95'ten yüksek canlılıkta yaklaşık 1x10⁵ adipojenik progenitör ve 1,5 ila 2x10⁵ miyojenik progenitör sağlayabilir.Hücreleri konakçı farelere transplantasyon için hazırlamak amacıyla hücreler yıkanır. İlk olarak, deforme olmuş hücreleri 1500 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın, hücreleri 500 microliters PBS içinde yeniden süspande edin ve einor tüplerine aktarın.Tüpleri 3000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı uzaklaştırın. Ardından, miyojenik progenitörleri PBS içinde veya adipojenik progenitörleri matrigel içinde mililitre başına yaklaşık 10⁶ hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin. Yazılı protokole uygun olarak, her bir donör hücre tipi için anestezize edilmiş konak fareleri hazırladıktan sonra, 20 µL (yaklaşık 20.000 hücre) miyojenik veya adipojenik progenitör enjekte etmek için 0,3 cm³'lük bir insülin şırıngası kullanın.Nakledilen hücrelerin farklılaşması için genellikle yaklaşık üç hafta kadar uygun bir süre bekleyin. Ardından hedef dokuyu izole edin ve bu şekildeki protokolde açıklandığı üzere kriyoseksiyon için hazırlayın; adipojenik ve miyojenik progenitörleri izole etmek için kullanılan ayıklama stratejisi gösterilmiştir; canlı hücreler ileri saçılım (forward scatter) ve yan saçılım (side scatter) temel alınarak tanımlanmıştır; nükleer debrisleri dışlamak için Hoechst boyaması, ölü hücreleri dışlamak için ise propidyum iyodür veya PI boyaması kullanılmıştır; hematopoetik ve endotelyal hücreler, sırasıyla CD 45 ve CD 31 hücreleri ayıklama kapılarından (sorting gates) çıkarılmıştır. Son olarak, alfa yedi pozitif olan alt küme belirlenmiştir.SKA one negatif hücreler tüm miyojenik progenitörleri ve alfa yedi negatif popülasyonu içerir. SKA one pozitif hücreler tüm adipojenik progenitörleri içerir; floresan eksi bir izotip kontrolleri boyamanın özgüllüğünü doğrulamaktadır. Ek olarak, adipojenik ve miyojenik alt kümelerin saflık kontrolleri gerçekleştirilmiştir.Bu temsili örnekte gerçekleştirilen ayıklamanın ardından, deri altına enjekte edilen ve transgenik insan alkali fosfataz eksprese eden adipojenik progenitör donör hücreler, histokimya ile kahverengi boyama şeklinde konak dokuda tanımlanabilir. Kas içine enjekte edilen ve transgenik insan alkali fosfataz eksprese eden miyojenik progenitör donör hücreler, bu doku kesitinde kahverengi olarak gösterildiği şekilde tanımlanmıştır.Histokimya kullanımı: Bu teknikten uzmanlaşıldığında, prosedür düzgün şekilde yürütülürse beş saat içinde tamamlanabilir. İşlem gören örnek sayısı arttıkça süre uzayacaktır. Bu prosedürü uygularken, hızlı ve nazik çalışmaya özen göstermek önemlidir.Bu nedenle, aynı anda çok fazla örneğin işlenmesinden kaçının. İşleme süresinin uzaması, bu prosedür sonrası hücre değişkenliğini büyük ölçüde azaltacaktır. Bu pro hücrelerin gelişimi sonrası in vivo hasara nasıl tepki verdiği gibi ek soruları yanıtlamak için kantitatif R-T-P-C-R ile kolono SC OG ekspresyon analizi gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.Bu teknik, doku rejenerasyonu alanındaki diğer araştırmacıların hasarlı dokudaki progenitör hücreler arasındaki etkileşimi keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bu dokuların hasar görmeden nasıl disosiye edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Progenitör hücreler, yüzey markerlarına göre tanımlanır ve in vivo gelişimsel potansiyelleri analiz edilir.İzlediğiniz için teşekkür ederiz. Deneyinizde başarılar dileriz.

purification-of-progenitors-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfusun izolasyonu ve kültürü, kas kök hücre topluluğu, kas kök hücre biyolojisi ve rejenerasyon, hem de kas distrofisi ve diğer dejeneratif hastalıklarda tedavileri için kök hücre nakli anlaşılması için gereklidir.

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Rejeneratif uygulamalar için idealdir insan iskelet kası liman birkaç çok-soy öncü nüfus içindeki kan damarları. Intima gelen Miyojenik endotel hücreleri, medya perisitler ve adventisyanın gelen adventisyal hücreler: Bu izolasyon yöntemi, kan damarlarının üç yapısal katmanları sırasıyla üç multipotent öncü hücre popülasyonlarının eşzamanlı arınma sağlar.

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Burada, biz insana biyolojik özelliklerini özetlemek permisif kültür koşulları altında kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeler oluştururlar iskelet kası atalarıdır, homojen bir nüfusa üreten doğru insan embriyonik kök hücreleri (hESC) epigenetik yeniden programlama dayalı bir protokol açıklar iskelet kasları.

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Vitro kültürü sistemleri omurgalı Miyogenesis anlayışımıza vazgeçilmez kanıtlanmıştır. Ancak, çok özellikle bazal taksa içinde, memeli olmayana iskelet kas gelişimi ve büyüme öğrendi gerekmektedir. Bu doku, kas kaynaklı öncü hücreleri (MPCs) yetişkin kök hücrelerin izole edilmesi ve bir birincil kültür ortamda kendi kendini yenileme, proliferasyon ve farklılaşma korumak için etkili ve güçlü bir protokol boyunca korunmuş ve farklı düzenleyici mekanizmaların tanımlanması için sağlar: omurgalı...

Bazal Omurgalı soylarından İlköğretim andMyogenic Öncü Hücre / Miyoblast Kültürlerinin Hazırlanması

İnsan kasından türetilen ana yapışık hücre tipleri miyojenik hücreler ve fibroblastlardır. Burada, hücre popülasyonları, CD56 antijenine dayalı olarak manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak zenginleştirilir. Spesifik antikorlarla müteakip immüno-etiketleme ve görüntü analiz tekniklerinin kullanılması, tek tek hücrelerde sitoplazmik ve nükleer özelliklerin miktar tayinine izin verir.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

Bu protokol, yetişkin ve yaşlı insanların iskelet kasından izole edilmesi ve miyoblast progenitör hücrelerin kültür sağlam tekrarlanabilir ve basit bir yöntem tarif eder. Burada kullanılan kaslar ayak ve bacak kaslarını içerir. Bu yaklaşım, fonksiyonel çalışmalar için birincil miyoblastların zenginleştirilmiş popülasyonun izolasyon sağlar.

Yetişkin ve Yaşlı İnsanların İskelet Kası miyojenik Öncü Hücreler / İlköğretim miyoblastların hazırlanması ve Kültür

Burada, insan miyoblastlarının saf bir popülasyonunu yetişkin kas dokusundan elde etmek için bir metodoloji tarif ederiz. Bu hücreler, in vitro iskelet kası diferansiasyonunu incelemek ve özellikle Ca 2+ sinyallemeyle ilgili proteinleri incelemek için kullanılırlar.

İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

İskelet kas biyopsi sözünde nizolating, culturing, karakterizasyonu ve insan primer kas atası hücreleri (hMPCs) ayırt etme teknikleri salıyoruz.  bu yöntemlerle elde edilen ve karakterize edilen hMPC'ler daha sonra insan miyogenezi ve iskelet kası rejenerasyonu ile ilgili araştırma sorularını ele almak için kullanılabilir.

İskelet Kas Biyopsisi Prosedüründen İnsan Kas Atası Hücrelerinin İzolasyon, Kültür, Karakterizasyonu ve Farklılaşması

Fibro-adipojenik progenitör hücrelerin (FAP'lar) ve kas kök hücrelerinin (MuSC'ler) kesin olarak tanımlanması, fizyolojik ve patolojik koşullarda biyolojik işlevlerini incelemek için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, FAP'ların ve MuSC'lerin yetişkin fare kaslarından izolasyonu, saflaştırılması ve kültürü için kılavuzlar sağlar.

FACS-İzolasyon ve Fibro-Adipojenik Progenitörlerin ve Kas Kök Hücrelerinin Bozulmamış ve Yaralı Fare İskelet Kasından Kültürü

Bu protokol, kas kök hücrelerinin ve fibro-adipojenik progenitörlerin farelerde bireysel iskelet kaslarından izolasyonunu tanımlar. Protokol, tek kas diseksiyonu, floresan aktive hücre sıralama ile kök hücre izolasyonu, immünofloresan boyama ile saflık değerlendirmesi ve 5-etinil-2'-deoksiüridin dahil etme testi ile S-faz girişinin kantitatif ölçümünü içerir.

Sessiz Kök Hücre Popülasyonlarının Bireysel İskelet Kaslarından İzolasyonu

Bu protokol, yetişkin ve yenidoğan fare iskelet kaslarından birincil miyoblastların doku ayrışması, ardışık filtrasyon, ön kaplama ve tanımlanmış kültür koşulları yoluyla izole edilmesi ve zenginleştirilmesi için standartlaştırılmış bir yöntem sunar; böylece uydu hücresinden türetilen miyoblast kültürlerinin sonraki deneysel uygulamalar için oluşturulması ve bakımı mümkün olur.

In vitro miyogenez çalışmaları için iskelet kası uydu hücrelerinin izolasyonu

Öğrenin, fare iskelet kasından miyojenik ve adipojenik progenitör hücreleri izole etme yöntemini. Akış sitometrisi ile saflaştırma, doku rejenerasyonu çalışmalarında hücre canlılığı ve farklılaşma analizi sağlar.

İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

Daha fazla video keşfet