DsRNA Enjeksiyon RNAi Girişim içine Drosophila Embriyolar

Bu prosedürün genel amacı, organ gelişimi için gerekli olan genleri belirlemek amacıyla drosophila embriyolarına çift zincirli RNA enjekte ederek endojen gen ekspresyonunu baskılamaktır. Bu işlem, öncelikle embriyoların toplanıp düz bir hat boyunca dizilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, iğneler hazırlanır ve embriyolara çift zincirli RNA enjekte etmek için kullanılır.

Son olarak, embriyolar gelişmeleri için nemli bir hazneye yerleştirilir. Nihayetinde, geç evre embriyoların antikor boyamasıyla veya larvaların parlak alan mikroskobu altında gözlemlenmesi yoluyla drosophila trakeal dal füzyonundaki defektleri gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin, organ gelişimi için gerekli genleri belirlemeye yönelik ileri genetik tarama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bir gen için mutant mevcut olmadan önce gen fonksiyonlarını analiz etmeye yönelik nispeten basit ve hızlı bir ters genetik yaklaşım olmasıdır.

Bu yöntem, D trake sisteminin gelişimi için gerekli olan kritik genlerin tanımlanması gibi gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu, omurgalı hava yolları, dolaşım sistemi, böbrek kanalları ve keşifsel epitel gibi memeli organlarının morfojenezini incelemek için mükemmel bir modeldir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler; embriyoları hizalama, iğneleri kırma ve embriyolara stranded RNA enjekte etme gibi yöntemleri öğrenmek zaman aldığı için zorluk yaşayacaklardır.

Çift sarmallı RNA'nın enjekte edildiği miktar embriyolar arasında farklılık gösterdiğinden ve sinsityal blastoderm embriyoların nasıl göründüğüne dair yazılı anlatımlar zor olabildiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Sinsityal blastoderm embriyolara uygun miktarlarda çift sarmallı RNA enjekte etmek, endojen genlerin ekspresyonunu etkili bir şekilde susturmak için çok kritik bir adım olduğundan, bu aşamaları öğrenmek güçtür.

Başlamak için, iki ila dört günlük W 1 1 1 8 sineklerini kullanarak kafesleri 25 °C'ye ayarlayın; yumurta toplama işlemini bir ila iki günlük bir süre boyunca senkronize etmek için gün boyunca üzüm suyu plakalarını her saat başı değiştirin. Toplama işleminden önce, syn city veya blaster derm embriyolarını 25 °C'de bir saat boyunca dikdörtgen bir üzüm suyu agar parçası üzerine toplayın, ardından jiletle agarın ortasına hafifçe bir çizgi çizin.

Embriyoları üzüm suyu plağından üzüm suyu agar parçasına aktarmak için metal bir prob kullanın. Yaklaşık 50 embriyoyu, uzun eksenleri agarın ortasındaki hatta 45 derecelik bir açı yapacak şekilde düz bir hat boyunca dizin. Tüm embriyoların aynı yönü gösterdiğinden ve posterior uçlarının hattan dışarıya doğru baktığından emin olun.

Çift taraflı banttan dikdörtgen bir parça kesin ve bunu 18 x 18 milimetrelik bir lamelle yapıştırın. Lamel üzerindeki bandı kullanarak embriyoları alın. Lameli bir lam üzerine yerleştirin.

Embriyoları çift taraflı bant üzerine hafifçe bastırın ve yaklaşık 10 dakika boyunca havada kurumaya bırakın. Embriyoların üzerini ince bir tabaka 700 halo karbon yağı ile kaplayın. Embriyolar mikroskop altında netleşene kadar yaklaşık 10 dakika bekleyin.

Mikroenjeksiyon iğneleri, cam kapiler tüpler çekilerek hazırlanır. World Precision Instruments marka bir iğne çekiciyi şu program ayarlarıyla kullanıyoruz: Isıtma (Heat) bir, gecikme (delay) dört, geri çekme (back).

Einor P 20 pipet ve einor mikro yükleyici uçlar kullanarak iğneye iki µL çift zincirli RNA yükleyin. Üzerinde temiz bir lamel bulunan bir lam hazırlayın ve bunları birlikte bantlayın. Dolu iğneyi, keskin bir uç oluşturacak şekilde lamelin kenarına getirin.

Çift sarmallı RNA iğne ucundan dışarı sızar. Piko pompanın ayak pedalı basıldığında, ortasında bir damla yağ bulunan bir lam hazırlayın. İğneyi yağ damlasının içine yerleştirin.

Ayak pedalı basıldığında 100 ile 200 piko litre arasında çift zincirli RNA püskürtmek için piko pompanın ayarını düzenleyin. Çift zincirli RNA, konumlandırılmış küçük bir damlacık olarak görülebilir.

İğne ucu ilk embriyonun posterior kısmındayken piko pompa ayak pedalına basın. Çift zincirli RNA, enjeksiyon bölgesinde küçük bir damlacık şeklinde görünecektir.

Slayttaki embriyolara çift zincirli RNA enjeksiyonunu tamamlayın. Blastoderm aşamasına gelmemiş tüm embriyoları imha edin. Embriyolar istenen embriyonik veya larval evreye gelene kadar, lameli 18 °C'de plastik bir Petri kabı gibi kapalı ve nemli bir ortama yerleştirin.

İstenen embriyonik aşamaya gelmiş embriyolar için, embriyoları çift taraflı banttan çıkarmak amacıyla bir prob kullanın ve onları lamın kenarına doğru itin. Embriyoları heptan ile yıkayarak alt kısmında naylon ağ bulunan bir toplama tüpüne aktarın. Embriyoları üç kez PBT ile yıkayın, ardından beş dakika boyunca %50'lik çamaşır suyunda bekletin ve embriyoları tekrar üç kez PBT ile yıkayın.

Embriyoları bir pipet kullanarak toplama tüpünden naylon bir ağ parçasına aktarın ve naylon ağ parçasını fiksatif çözeltiye daldırın. Embriyoları 30 dakika boyunca fikse edin. Fiksatif çözeltinin alt katmanını uzaklaştırın.

Ardından, metanol ile fikse edilen embriyolar bir eppendorf tüpüne aktarılır ve istenilen larva evresine gelmiş embriyolar için standart antikor boyama protokolleri kullanılarak iki A 12 ve difüzyon antikorları ile immünboyama yapılır. Ortasında bir damla halokarbon 700 yağı ve yağ damlasının her iki yanında iki küçük lameli bulunan bir lam hazırlayın. Bir larvayı lama aktarın ve ardından yağ damlasının üzerine bir lamel yerleştirin.

Larvaları bir aydınlık alan mikroskobu altında gözlemleyin. Hem difüzyon çift zincirli RNA hem de GFP çift zincirli RNA enjeksiyonunun temsili sonuçları burada gösterilmiştir.

GFP çift zincirli RNA enjekte edilen embriyolar normal trakeal füzyon göstermektedir ve füzyon hücrelerinde difüzyon proteini mevcuttur. Oklar, lateral gövdede difüzyon pozitif füzyon hücrelerini göstermekte ve yıldız işareti normal füzyonun konumunu belirtmektedir.

Buna karşın, çift zincirli RNA enjekte edilen difüzyon embriyolarında trake dal füzyonunun başarısız olduğu görülmektedir ve füzyon hücrelerinde difüzyon proteinleri mevcut değildir. Üçgen, çift zincirli RNA enjekte edilen embriyolar larva aşamasına geldiğinde başarısız olan dal füzyon bölgesini göstermektedir. G-F-P-R-N AI larvaları, yıldızla belirtilen normal trake dal füzyonunu sergilemektedir.

Öte yandan, diffusion RN AI larvaları üçgenlerle belirtilen başarısız dal füzyonu göstermiştir. Bu sonuçlar, drosophila embriyolarına çift zincirli RNA enjeksiyonu yoluyla endojen diffusion gen ekspresyonunun susturulmasının etkisini göstermektedir. Bu prosedür uygulanırken, gelişiminden sonra tüm enseal blaster embriyolarının öldürülmesinin önemli olduğu unutulmamalıdır.

Bu teknik, gelişimsel biyoloji alanındaki araştırmacıların drosophila'da organ gelişimi için yeni genlerin fonksiyonlarını keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, drosophila embriyolarına çift zincirli RNA enjekte ederek endojen genlerin nasıl susturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.