3D Nöral Kök Hücre Kültürü yerelleştirme Protein: Hybrid Görselleştirme Metodolojisi

Süspansiyonda büyütüldüklerinde, beynin nörojenik nişlerinden izole edilen nöral progenitör hücreler, nörosferleri oluşturmak üzere prolifere olurlar. Burada, protein ekspresyonunun üç boyutlu nörosfer içindeki yerini belirlemek amacıyla, postnatal hipokampus türevli serbest yüzen nörosferlerin izolasyonunu ve seri kesitlerini gösteriyoruz. Bu çalışmada, hedef protein olan Conexion 29 için immün boyama gerçekleştireceğiz; ardından iki boyutlu mikroskopi görüntülerini, nörosferin üç boyutlu bir yeniden yapılandırmasına dönüştürmek için birleştireceğiz ve tercüme edeceğiz.

Proteinlerin, serbest yüzen bir nörosfer veya bir doku gibi doğal üç boyutlu yapıları bağlamında görselleştirilmesi, bu yapılar içindeki konumlarına dayalı olarak protein fonksiyonunun daha iyi anlaşılmasını sağlar ve ayrıca lokalizasyonu bilinen ancak fonksiyonları bilinmeyen proteinler için olası kuralların çıkarılmasına olanak tanır. Merhaba, ben Ottawa Üniversitesi Nöral Rejenerasyon Laboratuvarı'ndan Sophia Ambo. Ben de Ottawa'daki Carleton Üniversitesi Carlton Immersive Media Studio'dan Nicholas Valenzuela.

Bugün, hipokampus kaynaklı postnatal nöral progenitör hücrelerin nörosferler olarak nasıl izole edileceğini, genişletileceğini ve seri olarak kesileceğini göstereceğiz. İmmün boyama yoluyla protein ekspresyonunu lokalize etmek için, ardından immün boyama sonrası toplanan seri nörosfer kesitlerinin iki boyutlu görüntülerini kullanarak, üç boyutlu yapıdaki hücresel ve protein konumlarını yeniden yapılandırma yöntemini örneklendireceğiz ve böylece nörosferler boyunca protein ekspresyonunun uzaysal organizasyonunu değerlendireceğiz. Haydi başlayalım.

Beyinler toplandıktan sonra, beyinlerin düzgünce yerleşebilmesi için düz bir yüzey oluşturarak onları çaka yerleştirmeye hazırlayın. Bu işleme bloklama denir. Bir jilet ve penset kullanarak serebellumu bloklayın.

Ardından, mandrenin üzerine bir damla hızlı yapıştırıcı sürün ve ilk beyni, anterior tarafı yukarıya ve dorsal tarafı size bakacak şekilde üzerine sabitleyin. Diğer beyinler için de aynı şekilde ilerleyin; son beyin için, kesim işlemi bu yönde bazen tamamlanmadığından dorsal tarafı sizden uzağa konumlandırmak daha yerinde olacaktır. Kesimin tamamlanmaması durumunda, bir skalpel kullanarak kesin ve kesiti toplayın.

Beyinler çok uzun süre havaya maruz kalamayacağı için yapıştırma aşamasında hız çok önemlidir. Tüm beyinler yapıştırıldıktan sonra, mandren vibratoya yerleştirilir ve tutucu buz gibi soğuk bir BOS ile doldurulur.

Vibratörü 8,5 frekansına ve 3,5 ile 4,5 arası bir hıza ayarlayın. Bıçağı A CSF ile temas ettirin ve otomatik kesimi ayarlayın. Şimdi 500 mikron kalınlığında dilimler keseceğiz.

Hipokampusu içeren dilimleri saklayın. Bunları buz gibi soğuk A CSF ile doldurulmuş bir kaba yerleştirin ve geri kalan dilimleri atın. Tüm dilimler toplandığında, hipokampus diseksiyonuna geçin.

Stereo mikroskop kullanarak, dorsal hipokampusun sadece bgma'nın yaklaşık -1,65 milimetresi ile -2,10 milimetresi arasını alıyoruz. Hipokampusları boş, buz gibi soğuk bir kaba yerleştirin. Tüm hipokampuslar kesitlerden toplandığında, mekanik disosiasyon için onları laminar akışlı kabine taşıma vakti gelmiştir.

Bir bistüri kullanarak, bistüri bıçağını %70 etanol ile püskürtün ve sterilize etmek için yakarak sterilizasyon yapın. Dokuyu, sıvı kıvama gelene kadar bistüri ile kesin. Şimdi, halihazırda papain DNAs ve nöral proteaz içeren disosiyasyon ortamını kullanarak, dokuyu pipetleme yoluyla toplayın ve 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.

Enzimatik diseksiyon için tüpü 37 dereceye ayarlanmış döner bir fırına yerleştirin ve sindirimin 45 dakika ile bir saat arasında gerçekleşmesini sağlayın. Sindirim tamamlandığında, enzimatik reaksiyonu durdurmak için 10 mililitre steril doku kültürü PBS ekleyin ve hücreleri 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve peleti yeniden süspande edin.

Beş mililitre PBS içerisinde, bir pastör pipeti kullanarak dokuyu daha fazla ayrıştırmak için örnekle tritürasyon yapın. Doku parçaları daha fazla küçülmeyene kadar tritürasyona devam edin. Bu aşamada, hücreleri tekrar peletleyin.

PBS'yi uzaklaştırın ve pelletini üç mililitre bakım ortamında yeniden süspande edin. Bunu yaptıktan sonra, örneği iyice tritüre edin. 15 mikrolitre miktarında bir alikot alın ve bunu eşit hacimdeki tripan mavisi ile karıştırın.

Hücre sayımı için iki adet 10 µL örnek alın ve bir hemositometreye yükleyin. Her bölümdeki üç alandan, toplamda altı alan olacak şekilde hücreleri sayın. Hücre yoğunluğunu hesaplamak için sayıların ortalamasını alın.

Numunenin seyreltildiği göz önünde bulundurulmalıdır. Trypan blue plakasında, hücreleri düşük yapışmalı kaplara, 5 ml'lik final hacmindeki bakım ortamı içerisinde, kap başına 2,5 x 10⁵ hücre yoğunluğunda ekleyin. Düşük yapışmalı kaplar mevcut değilse, petri kapları kullanabilirsiniz.

Bu durumda, nörosferlerin kabın tabanına yapışmaması için ilk altı gün boyunca her gün sabah ve öğleden sonra nörosferlere hafifçe vurmanız (tap) gerekecektir. Kapları inkübatöre yerleştirmeden önce EG, F ve FGF ekleyin. Bu büyüme faktörlerinin, kültür süresinin tamamı boyunca her iki günde bir yenilenmesi gerekecektir. In vitro 14. günde, kültüre doğrudan ekleyip oda sıcaklığında 20 dakika inkübe ederek, nörosferleri yaklaşık %4 nihai konsantrasyona sahip formaldehit ile fikse edin.

Hücreleri 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün. Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve 10 mM fosfat tamponunda hazırlanmış %15 ila %20'lik sükroz çözeltisi içinde yeniden süspande edin. Kriyostat üzerinde kesit alma işleminden önce, en az 24 saat boyunca 4 °C'de kriyoproteksiyona bırakın.

Kriyokorunmuş nörosferleri buzdolabından çıkarın ve 60 milimetrelik bir kaba yerleştirin. Her bir kesitin toplanmasının kritik olduğu seri kesit alma işlemleri için, stereo mikroskop kullanarak uygun boyut ve şekildeki nörosferleri seçmenin en iyi yöntem olduğunu gördüm; bir pipet yardımıyla bir nörosferi OCT bileşiği ile doldurulmuş bir kriyo kalıba yerleştirin. Nörosferlerin bulunduğu noktayı kriyo kalıbı üzerinde işaretleyin.

Bu adım, kesit alma işlemi sırasında nörosferlerin bulunmasına yardımcı olacaktır. Beş ila 10 adet sfer kalıba hızla yerleştirildikten sonra, CO2 kullanarak bunları dondurun. Kriyokalıp üzerindeki göstergeleri kullanarak, nörosferlerin bulunduğu yerleri dondurulmuş OTC bloğuna doğrudan işaretleyin.

OCT bloğunu kalıptan çıkarın ve kriyostat aparatına yerleştirin. Kalıbı CO2 kullanarak aparata sabitleyin ve kriyostata yerleştirin. Numunelerin en az 30 dakika boyunca dengeye gelmesini bekleyin.

Bu işlem tamamlandığında, kalıp üzerine konulan işaretlere kadar hızlıca kesin, ardından bu noktadan itibaren her kesiti toplamaya başlayın. Nörosfer dilimlerinin nerede başladığını görmek için ışık mikroskobuyla kontrol edin. Kesitleme işlemi tamamlandığında, immünokimya işlemini gerçekleştirmeye hazır olana kadar lamları dondurucuda saklayın. Bu adım için, seri olarak kesilmiş nörosferlerden birini içeren lamları ve bu lamın önceki beş ve sonraki beş kesitini içeren lamları çıkarın.

Bu işlem, tüm nörosferin görüntülendiğinden emin olmanızı sağlayacaktır. Nörosferinizin tüm kesitlerini bulabilmek için bir nükleer karşı boyama kullanmanız gerekecektir. Bu nedenle, immünoboya planınızı yaparken bunu göz önünde bulundurun; slaytlara PBS uygulayıp en az beş dakika boyunca oda sıcaklığına gelmesini beklerken, permeabilizasyon için %0,3 Triton X 100 ve bloklama için %3 sığır serum albümini içeren antikor tamponu kullanıyoruz.

Primer antikorunuzu bu tampon çözeltide uygun şekilde seyreltin ve insan odacığında dört derecede gece boyunca inkübe edin. Paraformu nörosferlerin üzerinden yüzdürmek için PBS kullanın ve pens yardımıyla dikkatlice çıkarın. Bu, beşer dakikalık dört PBS yıkamasının ilkidir.

Sekonder antikoru lamlara uygulayın ve bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Daha önce yapıldığı gibi, paraformu PBS kullanarak lam üzerinden yüzdürün ve penset yardımıyla uzaklaştırın. Bu işlem, beşer dakikalık dört adet PBS yıkamasının ilkidir.

Üçüncü yıkamada, 0,5 µg/mL konsantrasyonuna seyreltilmiş bir nükleer karşıt boyama olarak HOS 3 3 2, 5 8 ekliyoruz. HOS yıkamasını takiben, PBS ile beş dakikalık bir yıkama daha yapılır. Tüm yıkamalar tamamlandığında, lamın altına bol miktarda kapatma medyumu uygulayın ve cam bir kapatma lamı ile örtün.

Köşeleri oje ile sabitleyin. Tüm lamlar kapatma camı ile kapatıldıktan sonra, kapatma camının kenarlarının geri kalanını sabitleyin. Lamın görüntüsünü hemen alın veya görüntüleme aşamasına gelene kadar -20 °C'de saklayın.

Görüntüleme sırasında, lam üzerindeki hücreleri bulmak en zor kısımdır; nükleer karşıt boyama kullanarak arama yaparsanız, küreye ait hücreleri tespit etmek kolay olacaktır. Sadece birkaç hücreden oluşabilecek nörosferin başlangıcını bulduğunuzda, o noktadan itibaren her kesitin görüntüsünü alın. Nükleer boyamanın, ilgilendiğiniz proteinin veya proteinlerin ve bir faz kontrast görüntüsünün çekimlerini gerçekleştirin.

Bu faz kontrast görüntüsü, modelleme aşamalarında çok önemli olacaktır. Open Lab 3.56 yazılımında belirlenen 10 µm ve 50 µm'lik yerleşik ölçek çubuklarına sahip görüntüler, 3.300 x 2.550 piksellik standart bir tuval boyutu kullanılarak Photoshop CS4'e aktarılır.

Tüm seri kesit görüntüleri, standart tuval boyutu korunarak TIFF dosyaları olarak kaydedilir. Nörosfer seri kesitlerinin birinci ve ikinci faz kontrast görüntülerini açın. Görüntü sekmesi altında ikinci kesitin şeffaflığını artırın, görüntü döndürmeyi açın ve rastgele seçeneğini belirleyin.

Görüntüler arasındaki geometrik ve yapısal süreklilik noktalarını tanımlayabilene kadar ikinci kesiti döndürün. Tüm seri kesitler için işlemi tekrarlayın ve her kesiti ayrı bir katman olarak kaydedin. Faz ve protein ekspresyonuna karşılık gelen her görüntü katmanının, her kanal için tüm döndürme işlemlerinin aynı anda gerçekleştirilmesini sağlamak amacıyla bağlantılı olduğundan emin olun.

Maya'da, durum satırındaki Photoshop dosyasıyla aynı oranlara sahip bir düzlem oluşturun. Menü çubuğunu varsayılan animasyon ayarından yüzeyler (surfaces) seçeneğine getirin. Küreyi seçili hale getirerek, hücre gövdesini oluşturmak için primitif bir alt bölümlendirme küresi (subdivision sphere) kullanın.

Nesne üzerinde farenin sağ tuşuna tıklayıp işaretleme menüsünden vertex'i seçerek köşeleri üzerinde işlem yapmaya başlayın. Ardından, ana menünün subdivision surfaces sekmesindeki işaretleme menüsünden görüntüleme seviyesini değiştirerek kürenin yüzeyini detaylandırın. Collapse hierarchy seçenekler kutusunu açın ve seviye sayısını iki olarak ayarlayın.

Küreyle seçim yapılmış durumdayken, menü çubuğunu yüzeylerden poligonlara getirin. Ana menünün mesh sekmesinden sculpt geometry aracını açın.

Hücre yüzeyini nihai formuna getirin. Bunun için araç ayarları sekmesindeki sculpt geometry araç setini kullanın. Neurosphere'lerde bulunan progenitör hücre çeşitliliğini simüle etmek için bu işlemi tipolojinizdeki her bir hücre için tekrarlayın.

Bu gösterimde, 10 farklı progenitör hücre nörosferin temelini oluşturacaktır. Hücre tipolojisini seçin ve tipolojinizin hücreleri ile dondurma dönüşümlerini gerçekleştirin. Protein connectin 29 eksprese eden hücreleri ve proteinin bulunmadığı hücreleri temsil etmek üzere iki yüzey gölgelendiricisi tasarlanacaktır.

Ana menünün pencereler oluşturma düzenleyici sekmesinden hyper shade penceresini açın. Yüzey malzemeleri sekmesinden bir ramp shader seçin. Öznitelik düzenleyiciyi açın ve shader rengi, akkor ortam rengi, bump, map ve speküler renk özniteliklerini ayarlayın.

Ortam rengi düğümüne Brownian 3D dokusu, kabartma eşleme (bump mapping) düğümüne ise 2D fraktal doku atayın. Oluşan gölgelendirici giriş ve çıkış bağlantılarını seçin ve seçili ağı dışa aktarın. Hücre tipolojisini seçin ve dışa aktarma seçim seçenekleri kutusunu açın.

Dosya türü olarak Maya A-S-C-I-I seçeneğini belirleyin ve export selection (seçimi dışa aktar) altındaki include these inputs (bu girdileri dahil et) kutucuğunun işaretini kaldırın. Hizalanmış seri kesitler dosyasını Adobe Photoshop'ta açın. Seri kesitlerdeki her bir progenitör hücrenin konumunu işaretlemek için kurşun kalem darbelerinden oluşan bir anahtar oluşturun.

Bu gösterimde; bir hücrenin bir, iki veya üç bölümde yer alıp almadığını belirtmek için üç vuruştan oluşan bir anahtar kullanılacaktır: Dolu bir kare, kesikli çizgili bir kare ve çarpı işaretli bir kare.

Bu işaret anahtarı, kırmızı rengin conexion 29 eksprese eden hücreleri ve beyaz rengin Conexion 29 eksprese etmeyen hücreleri temsil etmesiyle daha detaylı tanımlanmıştır. Faz katmanını açın ve her bir progenitör hücrenin merkezini beyaz kalemle işaretlemeye başlayın. Haritalarınızı oluşturmak için bölüm klasörü içinde ayrı bir katman kullanın.

Hücrenin konumunu belirlemek için kesitler arasında geçiş yapın ve birden fazla kesitte yer alan hücrelerin uygun şekilde işaretlendiğinden emin olun. CX 29 katmanı açıkken, CX 29'un pozitif olarak ifade edildiği bölgelerde kalan hücreleri seçin.

Photoshop ana menü çubuğundaki düzenle sekmesinden doldur komutunu seçin ve haritalar tamamlandığında beyaz çizgileri kırmızıya çevirin. Her bölümü Maya projesinin kaynak görüntüler klasörüne ayrı bir JPEG görüntüsü olarak kaydedin. Bunu yapmak için, öncelikle Maya kullanıcı arayüzündeki durum satırından yeni bir Maya projesi oluşturulmalıdır.

Menü çubuğunu varsayılan animasyon ayarından polygonlar import the planes seçeneğine değiştirin. ma ve ölçek çubuğu yapın. Plain seçiliyken projects seen klasöründeki ma dosyalarını açın.

Nesne üzerinde farenin sağ düğmesine tıklayıp öznitelik düzenleyicideki (attribute editor) yeni materyal ata (assign new material) sekmesini açarak bir Lambert shader atayın. Açılır menüden materyalin renk özniteliğinin sağındaki damalı kutucuğa tıklayın. Öznitelik düzenleyicideki dosya (file) özniteliği bölümünün altındaki 2D doku (2D texture) kısmından dosya (file) seçeneğini belirleyin.

Görüntü adı özniteliğinin sağındaki dosya simgesine tıklayın. Kaynak görüntüler klasöründen ilk bölümü seçin. İlgili panel sekmesini açarak çalışma alanı penceresinin kamerasını perspektif görünümden varsayılan ortografik üst görünüme getirin.

Ana menünün mesh sekmesinden poligon oluşturma aracını seçin ve kesitin ana hattını çizin. Kaynak görüntüler klasöründen ilk haritayı seçin ve bunu yeni oluşturulan poligon düzlemine atayın. Nesne seçiliyken poligon düzlemi oluşturmak için belirlenen adımları takip ederek, düzlem üzerinde fareye sağ tıklayıp işaretleme menüsünden UV'yi seçin.

Tüm düzlem UV noktalarını seçin ve ana menünün pencereler sekmesinden UV doku düzenleyiciyi açın; UV'leri kesit düzlemine uyacak şekilde orantılı olarak ölçeklendirin. Bu işlemi, her bir kesit arasındaki boşlukların Maya kullanıcı arayüzünün durum satırındaki ölçek çubuğunun yüksekliğine karşılık geldiğinden emin olarak neuros küresinin her bir kesiti için tekrarlayın. Menü çubuğunu varsayılan animasyon ayarından dinamiklere değiştirin ve neuros küresinin yalnızca ilk kesitini görünür bırakın.

Ana menünün görüntüleme sekmesinden görüntüleme ayarlarını değiştirerek diğer tüm bölümleri gizleyin; CV eğrisi araçları seçenekleri kutusu açıkken CV eğrisi ayarlarından "one linear" seçeneğini seçin. Sahneyi üst görünüm kamerasından izleyerek, CX 29 negatif hücreler ve CX 29 pozitif hücreler için birer eğri oluşturacak şekilde hücre haritalarına noktalar atamaya başlayın. Ortaya çıkan eğriler, yan görünüm kamerasından bakıldığında düzdür.

Ölçek çubuğunu kılavuz olarak kullanarak, eğrinin noktalarını Y ekseninde kaydırarak kesitlerin kalınlığını yaklaşık olarak belirleyin. Bu işlemi nörosferin her bir kesiti için tekrarlayın.

Projenin scenes klasöründen cell typology.ma dosyasını içe aktarın ve hücre tipolojisini hem CX 29 negatif hem de CX 29 pozitif Progenitors için çoğaltın. Ana menünün windows rendering editors sekmesinden hyper shade penceresini açın.

Daha önce oluşturulmuş shader'ları, outliner penceresinden tipolojinin hücrelerine atayarak içe aktarın. İçe aktarılan nesnelerin başındaki dosya adını kaldırın. Bu işlem, modelleme sürecinin sonraki aşamalarında önem kazanacaktır.

Ana menüden partiküller sekmesini seçin ve ilk CV eğrisi için bir partikül yayıcı oluşturun. Partikül şekli sekmesini açın ve yayın nitelikleri altında, maksimum sayıyı eksi birden ilk eğrinizdeki nokta sayısına getirin. İşleme nitelikleri sekmesinde, partikül işleme türünü blobby surface olarak değiştirin.

Aşağıdaki mevcut render tipi kutusuna tıklayın ve partiküllerin yarıçapını 0.01 olarak değiştirin. Önce partikülleri, ardından shift tuşuna basılı tutarak eğriyi seçerek partikülleri eğrinin köşelerine bağlayın.

Ana menünün parçacıklar sekmesinden hedef seçeneklerini açın ve hedef ağırlığını bir olarak ayarlayın. Oluştur'ya tıklayın. Outliner penceresinde bir numaradan 10 numaraya kadar olan hücreleri sırayla seçin ve ana menünün parçacıklar sekmesinden anlık değiştirme seçenekleri kutusunu açın.

Örnek nesneler kutusunda, 10 hücrenin tamamı sırasıyla listelenmiş olmalıdır. Örneklenecek parçacık nesnesi sekmesindeki açılır listeden doğru parçacık şekli adını seçin. Create'e tıklayın. Varsayılan olarak, eğri boyunca yalnızca seçilen ilk hücre parçacıkların yerini alacaktır; tüm 10 hücrenin görünmesini sağlamak ve parçacıklar arasında rastgele döngü oluşturmak için bir ifadeye ihtiyaç vardır.

İkinci bir ifade, hücrelerin her seferinde aynı şekilde rastgele emisyon yapmasını sağlayacaktır. Yayıcı seçiliyken aralık sürgüsü yeniden konumlandırılır. "add dynamic attribute" altındaki parçacık şekilli sekmeden öznitelik düzenleyiciyi açın.

Uzun isim (long name) altındaki genel kutuya tıklayın. Öznitelik türü (attribute type) kısmına rastgele bir alt çizgili indeks yazın, ölçekli (scaler) seçeneğini parçacık başına dizi (per particle array) olarak değiştirin ve parçacık başına dizi öznitelikleri sekmesindeki ekle (add) düğmesine basın. Bir rastgele alt çizgili indeks kutusu eklenmiş olacaktır.

Boş alana sağ tıklayarak açılan açılır menüden ifade oluştur'u (create expression) seçin. İfadeyi tamamlamak için ifade kutusuna aşağıdaki metni yazın. Öznitelik düzenleyicideki anlık arama geometri değiştirme sekmesini ve genel seçeneklerdeki nesne indeksini açın.

Açılır listeden rastgele bir alt çizgi indeksi seçin. Zaman kaydırıcısını ilk kareye getirin ve oynat düğmesine basın. Hücre tipleri artık partiküller arasında rastgele dağılmış durumdadır.

Bu işlemi neuros küresinin her bölümü için tekrarlayın. Her yeni emitter örneğinin ve rastgele indeksin isimle ayırt edildiğinden ve render'daki outliner penceresinde uygun şekilde düzenlendiğinden emin olun. Render ayarları penceresindeki section kısmını kullanarak, render'ı Maya software'den mental ray'e değiştirin.

Kalite sekmesini açın ve ışın izleme (ray tracing) başlığı altındaki yansıma ayarını sıfıra getirin. Kare tamponu (frame buffer) sekmesini açın, renk kırpma (color clip) ayarını ham (raw) değerinden alfa (alpha) değerine değiştirin ve Ön çarpımı (Pre multiply) kapatın.

Kanal kutusu katman düzenleyiciyi açın ve katman düzenleyici ayarlarını görüntüleme'den (display) işlemenize (render) getirin. Tipolojinin içe aktarılan hücrelerini seçin, yeni katman oluştur ve seçili nesneleri ata simgesine tıklayın. Katmanı ambient occlusion olarak yeniden adlandırın.

Yeni oluşturulan katman üzerinde sağ fare düğmesine tıklayarak, render katmanı kutusunun sağındaki menüden nitelikleri (attributes) seçin. Hazır ayarlar (presets) düğmesine tıklayın ve açılır listeden occlusion seçeneğini belirleyin. MIB_AMB_occlusion 1 sekmesini seçin ve örnekleme (samples) değerini 16'dan 256'ya değiştirin.

Kanal kutusu katman düzenleyiciyi yeniden açın ve seçenekler sekmesi altında, tüm katmanları işle seçenekleri kutusunu açın, kompozit seçeneğini belirleyin ve ortamklama (ambient occlusion) katmanı seçili kalacak şekilde katmanları tutun. Katman listesinin hemen üzerindeki açılır kutudan bunu normalden çarpma (multiply) olarak değiştirin; nöro kürenin iki geçişini, bir kez ortamklama katmanı açıkken ve bir kez ana katman açıkken işlemin. Görüntüleri projeler görüntüleri klasörüne IFF dosyaları olarak kaydedin.

Her iki görüntüyü de Adobe Photoshop'ta açın. Ortam tıkanıklığı (ambient occlusion) katmanını ana katmanın üzerine yerleştirin ve karıştırma modunu çarpma (multiply) olarak ayarlayın. Bir arka plan oluşturun ve görüntüyü düzleştirin.

Hücre kültürleme yöntemini, hipokampus türevli nörogenik hücrelerin nörosferler şeklinde nasıl kültüre edileceğini, nörosfer kültürünün kriyostat kullanılarak nasıl seri kesitlere ayrılacağını ve ilgilenilen bir protein için immün boyamanın nasıl gerçekleştirileceğini gösterdik. Ayrıca, hücre kültürü hizalaması ve üç boyutlu modelleme yazılımı kombinasyonunu kullanarak, söz konusu protein ekspresyonunun mekansal konumunun üç boyutlu olarak nasıl modelleneceğini gösterdik.

Bunun size yardımcı olacağını umuyor, deneylerinizde başarılar diliyoruz.