Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Ben Troy Gasai. Son birkaç yıldır laboratuvarımda mükemmelleştirilen organotipik kesit deneyi hakkında konuşacağız. Laboratuvarımdan Ben jacket, bu deneyin nasıl gerçekleştirildiğini size gösterecek.

Postnatal beynin organotipik kesit deneyi, çeşitli faktörlerin ve bunların postnatal beyindeki nöronal migrasyon ile TRO migrasyon akımı üzerindeki rolünün test edilmesi için güçlü bir yöntemdir. Merhaba, ben Ben Jakay. North Carolina State University Veteriner Fakültesi'nde Dr. Troy Gge laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım ve bugün sizlere, postnatal beyinde migre olan nöroblastları görselleştirmek amacıyla organotipik fare beyin kesitleri arasında doku çapraz transplantasyonunu nasıl gerçekleştirdiğimizi göstermek için buradayım.

Bu videoda açıklanan tüm teknikler steril bir ortamda, tercihen sterilize edilmiş araçlar kullanılarak laminer akışlı kabin içerisinde gerçekleştirilmelidir. 23 gauge iğne takılmış tek kullanımlık bir şırınga ile, tabağın cam taban kısmının merkezine 150 µL dilim ortamı damlatılır. Sıvı değişimi için bir kenarı yapışmadan bırakılacak şekilde, dairesel cam taban lamelinin dış kısmına birkaç nokta şeklinde yapıştırıcı sürülür A. Membran altına hava kabarcığı sıkışmadığından emin olunarak, mikro pens yardımıyla nükleer por membranı nazikçe ortamın üzerine yerleştirilir.

Ardından kavisli pensler, yapıştırıcı noktalarını düzleştirmek ve membranı yerine sabitlemek için kullanılır. Membran üzerine bir mililitre dilim besiyeri eklenir ve son olarak kaplar, kullanıma hazır olana kadar bir inkübatöre yerleştirilir. En iyi sonuçlar, dilimler P1 ile P10 arasındaki genç postnatal farelerden hazırlandığında elde edilir; öncelikle kafa, burun mikro penslerle tutularak sabitlenir.

Deri, boyundan burun ucuna kadar boylamsal olarak çıkarılır. Kemikleri açığa çıkarmak için kafa derisi soyulur ve kafatası, sternum magna'dan başlayarak bir medial ve her iki yanda birer tane olmak üzere iki lateral kesi yapılarak boylamsal ve anterior yönde kesilir. Alttaki kortikal dokuyla teması en aza indirmeye özen gösterilmelidir.

Dokunun stabilitesini artırmak için kranial flepler beyinden uzaklaştırılır. Vibratom kesit alma işlemi sırasında, beynin en lateral ve kaudal kısımları bir jiletle çıkarılır. İki hemisfer kafatası içerisinden dikkatlice kaşıkla alınır ve medial yüzeyleri aşağıya bakacak şekilde bir gömme kalıbına yerleştirilir.

Bunlar, 37 °C'de tutulan doku hazırlama tamponunda çözünmüş, eritilmiş %3 DNA kalitesinde agaroz jel ile hemen kaplanır. Düz yatay bir yüzeyde iki dakikalık stabilizasyonun ardından, agarozun eşit şekilde sertleşmesini sağlamak için kalıplar, donma işlemini tamamlamak üzere buz üzerine yerleştirilir.

Hemisferleri içeren jel donduktan sonra kalıptan çıkarılır ve beyin dokusunun etrafından budanır. Jele gömülmüş doku, medial yüzeyi yukarı bakacak şekilde vibratomun numune diskine yerleştirilir ve siyanoakrilat yapıştırıcı ile sabitlenir. Ardından disk, buz gibi soğuk doku hazırlama ortamı ile doldurulmuş vibrasyon numune tepsisine yerleştirilir ve beyin 150 micrometer kalınlığında dilimlenir.

RMS içeren kesitler bıçaktan ayrıldıktan sonra, küçük düz uçlu bir spatula yardımıyla dikkatlice alınır ve kültür kaplarının merkezine düz bir şekilde yerleştirilir. Doku çok kırılgan olduğu için kesitlerle yapılan işlemlerin minimum düzeyde tutulması kritik önem taşır. Kültür kaplarındaki besiyeri miktarı, beyin kesitlerinin hareket etmesini önleyecek ve onları örtecek yeterli seviyeye ayarlanır.

Kaplar etiketlenir ve bir inkübatöre aktarılır. Donör beyinler, kesitlerin 250 µm kalınlığında kesilmesi ve dilimlerin buz üzerinde toplanması dışında, resipiyent beyinlere benzer bir şekilde hazırlanır.

Soğuk doku hazırlama. Tampon içindeki kesitler, hemen epi-floresan özelliğe sahip bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirilir. RMS, subependimal bölgeden olfaktör bulba doğru uzanan gri, U şeklinde bir yapı olarak görülür.

RMS, mikro pensler kullanılarak nazikçe mikrodiseke edilir. Bir pens dilimi sabitlemek için kullanılırken, diğeri RMS dilimden ayrılana kadar etrafında küçük kesikler yapmak için kullanılır. Eksize edilen RMS daha sonra yaklaşık 200 ila 500 mikrometre çapında küçük parçalara bölünür.

Bu örnekte, kırmızı floresan protein TD tomato glass eksprese eden farelerden greftler hazırlanır. Konak dilimlerini içeren alt kaplar inkübatörden çıkarılır ve görünür ışık kullanılarak diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirilir. RMS'nin başlangıç segmentinde küçük bir insizyon yapılır ve 20 µL uç takılmış bir pipet yardımıyla, tek bir donör RMS eksplantı konak RMS'deki insizyon bölgesine transfer edilir.

İki doku arasında temas kurmak için eksplant, insizyonun içine nazikçe itilir. Bu temasın stabil olduğundan emin olmak için eksplantlar, kesit ile nükleer gözenekli membran arasına hafifçe itilir. Kesitlerin membran üzerine yerleşmesine izin vermek için kaplar ardından en az bir saat boyunca inkübatöre geri konur.

Nöroblastların, yaklaşık bir ila iki saat sonra eksplanttan konakçı RMS'ye göç etmeye başlaması gerekir. Hücre göçü, ekstra uzun çalışma mesafeli 20x objektifler kullanılarak en iyi şekilde gözlemlenir. Doku kültürü örnekleri, inkübatörden mikroskop üzerindeki bir inkübasyon odasına aktarılır.

Floresan nöroblastlar, istenen analiz türüne bağlı olarak sıfır ile 10 dakika arasında değişen aralıklarla görüntülenebilir. Organik tipik kesit kültür protokolümüz, RMS'deki migrasyon paterni ve oryantasyonun tutarlılığı açısından son birkaç yıldır kapsamlı bir şekilde test edilmiş ve optimize edilmiştir. Bu örnekte, TD tomato'nun nestin promotörü altında eksprese edildiği farelerden elde edilen eksplanttan göç eden hücrelerin analizi, konak RMS'ye doğru yüksek derecede yönlenmiş ve hızlı bir migrasyon olduğunu ortaya koymaktadır.

Yüksek büyütme. Zaman ayarlı analiz, 20 dakikalık bir görüntüleme oturumu boyunca göç eden bir nöroblastın tüm uzunluğunun mükemmel çözünürlükle izlendiğini göstermektedir. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, kesitler buz soğukluğundaki taze hazırlanmış %4 paraformaldehit ile fikse edilebilir ve göç akımının farklı bileşenleri için immünoboyama yapılabilir.

Bu vakada, floresan immünohistokimya kullanılarak mavi renkte GFAP pozitif astrositler ve yeşil renkte CD 31 pozitif kan damarları ortaya çıkarılmıştır; sitoskeletal proteinler olan mavi renkte aktin ve yeşil renkte tübülin için boyanan kesitlerin yüksek büyütmeli analizi, migrasyon halindeki bir hücre tarafından bu bileşenlerin homojen olmayan ekspresyonunu göstermektedir. Protokolümüz, hem hazırlık hem de sonuçların analizi için sabır, pratik ve ayrılmış zaman gerektiren bazı zorluklar içermektedir.

Deneylerinizden en iyi sonuçları almanıza yardımcı olacak bazı faydalı öneriler şunlardır. Deneyimlerimize göre, P1 ile P10 yaş aralığındaki fareler en iyi sonuçları vermektedir. Donör ve alıcı beyinler arasında yaş uyumunun sağlanması da deneylerin tekrarlanabilirliğini artırır.

Çoğu reaktif ve kültür kabının taze olarak hazırlanması gerektiğinden, dilim analizimiz tek bir günde birkaç saatlik kesintisiz hazırlık ve görüntüleme gerektirir. Beyinler alındıktan sonra, sonraki adımlar mümkün olduğunca hızlı bir şekilde tamamlanmalıdır. Dekapitasyon ile dilimlerin hazırlanması arasındaki tüm adımlar buz kullanarak gerçekleştirilmeli, soğuk reaktifler kullanılmalı ve anatomik bozulmaları önlemek için doku manipülasyonu minimum düzeyde tutulmalıdır.

Bu diseksiyonlar için kullanılan aletler steril olmalı ve yalnızca canlı doku manipülasyonları için ayrılmalıdır. Formaldehit gibi fiksatiflerle temas etmiş aletler asla kullanılmamalıdır. Kesitler genellikle 36 saate kadar canlı kalır; ancak 24 ile 36 saat arasında migrasyon, hız ve oryantasyonda gözle görülür bir azalma meydana gelir.

Deneylerinizi ve analizlerinizi planlarken bu kısıtlamayı göz önünde bulundurun.