Name: Hücre Tipi özel Yerelleştirme Analizi için Heterokaryon Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Öğrenin hücre tipine özel protein yerelleşmesini ve nükleositoplazmik taşınımı heterokaryon tekniği ile incelemeyi. Bu yöntem, floresan mikroskopi kullanarak kanser biyolojisi ve hücre sinyalleşmesi araştırmalarında protein dinamiklerini analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Worcester Politeknik Enstitüsü Bölümü Kimya ve Biyokimya finansman için teşekkür etmek istiyorum.

1. Hücre Hatları, Transfeksiyon Transfeksiyon Yöntem 1 (Lonza, artan primer hücre transfeksiyon verimlilik için Nucleofection) <ol><li> Hücreler son geçiş ve önce transfeksiyon log fazı büyüme olmalıdır. Fosfat içinde hücreler yıkayın trypsinization tamponlu salin (PBS) ve hasat hücreleri. </li><li> 1500 xg'de 5 dakika santrifüj hücreleri toplayın. </li><li> 6 plaka sterilize kapak fişleri ekleyin. Kapak fişleri gelişmiş hücre adezyon kaplı olabilir. Yeri 1.5 ml kültür ortamı (bu durumda Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS)) ve her kuyuya inkübatör ortam dengelenmesi. </li><li> Fosfat minimal volüm trypsinization ve tekrar süspansiyon hücreleri tarafından Hasat tamponlu salin (PBS). </li><li> Hücre sayımı ve tabanda örnek başına ~ 5x10 5 hücre sağlamak için doğru miktarda santrifüj. </li><li> Numune başına 100 mcL oda sıcaklığında Nucleofector çözüm hücreleri dikkatli bir şekilde tekrar </li><li> 5 mg plazmid DNA ile birleştirin ve hücre süspansiyonu 100 mcL Nucleofector Küvet hava kabarcıkları dahil etmek için dikkatli bir örnek aktarmak. </li><li> Uygun Nucleofector Programı (minimal mortalite ile optimal transfeksiyon etkinliğini kurmak için önceki testi gerekebilir) seçin. </li><li> Nucleofector Küvet Tutucu hücre / DNA süspansiyon içeren küvet takın ve seçilen program başlar. </li><li> Tamamlanmasının ardından, küvet kaldırmak ve (6 plaka alınan) ~ 500 mcL ön dengelenmiş kültür ortamı ekleyin. </li><li> Hemen yanı başına 1.5 mL son hacmi ile 6-plaka içine örnek aktarmak. Hücreler kontrolleri için, karma nüfuslu ya da ayrı ayrı ya kaplama olmalıdır. </li></ol> Transfeksiyon Yöntemi 2 (Qiagen Effectene transfeksiyon hücre hatları için) <ol><li> Her plazmid DNA örneği 0.8 mg 200 mcL EC tampon ekleyerek ilk Qiagen Effectene Reaktif transfeksiyon kompleksleri kullanarak hazırlayın. </li><li> Her numune için 6.4 mcL arttırıcı reaktif, tüp Flicking kısaca karıştırın ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin. </li><li> Tüp Flicking tarafından her örnek, mix 20 mcL Effectene reaktif ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. </li><li> Bu kuluçka sırasında, transfeksiyon için ilgi iki hücre hatları hazırlamak. Son geçişli hücreler (&lt;% 80 izdiham) yıkayın kez fosfat tamponlu salin (PBS). 1.5 ml taze ısıtılmış ve dengelenir büyüme orta Ekle (Bu durumda Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS)). </li><li> 15 dakika boyunca inkübe transfeksiyon kompleksleri sonra, her bir örnek 1.2 mL medya aktarın. Pipetleme, ve 6-plaka hemen her iki kuyu için yaklaşık 700 mcL kompleksleri transferi ile karıştırın. Damla damla ekleyin ve plaka dönen hafifçe karıştırın. Hücrelerin en az 3 saat transfect için izin ver (hücre tipi ile değişiklik gösterebilir). </li><li> Sterilize kapak fişleri yeni bir 6-plaka ekleyin. Kapak fişleri gelişmiş hücre adezyon kaplı olabilir. </li><li> Hücrelerin transfekte sonra, her bir kuyunun yaklaşık 100 mcL tripsin çözüm ekleyerek, kısaca her bir kuyunun tam kat plaka ajitasyon ve hemen tripsin aspire PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve minimal trysinization hücreleri tarafından hasat. Hücreleri kaldırdı sonra, 1.5 mL taze medya ekleyin. </li><li> Bu noktada, hücrelerin steril bir örtü fişleri üzerine karışık veya ayrı olarak nüfus (kontrol) kaplama olmalıdır. </li><li> Hücreler 12 saat kurtarmak için izin verin. </li></ol> 2. Hücre Fusion <ol><li> Hücrelerin kültür ortamları çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Bu noktada, protein sentezini inhibe sikloheksimid (100 mg / ml) ile hücrelerin tedavisi için tavsiye edilir. Hücreler 2 saat süreyle inkübe ve sonra hücreler PBS ile iki kez yıkamak için izin verin. </li><li> 125 saniye boyunca oda sıcaklığında serum serbest DMEM% 50 polietilen glikol 1000 (PEG 1000) bir çözüm onları teşhir ederek Sigorta hücreleri. </li><li> PEG 1000 çözüm kaldırmak ve 2 ml taze ısıtılmış ve dengelenir medya eklemek hücreleri PBS ile yıkayın. </li><li> Hücreleri için 18 - 24 saat inkübe için izin verin. </li></ol> Floresan Mikroskopi <ol><li> Kültür ortamı çıkarın ve hücreler PBS içinde iki kez yıkayın. </li><li> Her iyi bir% 4 paraformaldehid solüsyonu (PBS) 1 ml ekleyerek hücreleri saptamak. 15 dakika boyunca yavaşça ajitasyon. </li><li> Sabit hücreler PBS içinde iki kez yıkayın. </li><li> Plaka kapağını dikkatlice fişleri kaldırmak, aşırı PBS kapalı fitil. Üzerine mikroskop yüklenen montaj orta (% 90 gliserol, 100 mM Tris, pH 7.5,% 2 DABCO (1,4-diazabicoyclo oktanlı) içeren DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole) ile bir damla slaytlar. Haricindekileri </li><li> Slaytları fazla montaj orta çıkarın ve mühür cooje ile ver sığar. </li><li> Konfokal veya Epifloresans mikroskobu ile hücre gözünüzde canlandırın. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 2 birincil fibroblastlar ve H1299 küçük hücreli dışı akciğer kanseri hücreleri kullanarak bir örnek heterokaryon deney gösterir. Bu deneyde ilgi protein (Tavuk Anemisi Virüs VP3) Epifloresans mikroskopi tarafından görüntülenmiştir olarak öncelikle birincil hücre tipleri sitoplazmik yerelleştirme ve transforme hücre tipleri nükleer lokalizasyon gösterir. Protein H1299 hücrelerinde birincil sünnet derisi fibroblastlar (PFF) veya dsRed GFP ya da bir füzyon (pEGFP N1 vektör, Clontech) (dsRed-N1 vektörü, Clontech) olarak ifade edilir. Kendi füzyonlar içeren kontrol numuneleri (üst iki satır), kararlı durum lokalizasyon desen hiçbir değişiklik multinükleer hücreler gösterir. Bu tür değişiklikler aksi füzyon koşulları veya syncitia oluşumu hassasiyeti nedeniyle meydana gelebilir. Heterokaryon füzyonlar (alt sıra) nükleer GFP-erimiş birincil hücre kaynaklı protein ve transforme hücre malzeme giriş yanıt dsRed erimiş protein ile ko giriş göstermektedir. Gösterilen örnek, hem Fluoroprotein sinyallerin varlığını gösterdiği gibi, sadece iki hücre, her tür, oldukça nadir görülen bir heterokaryon füzyon. Nükleositoplazmik mekik faaliyet yerelleştirme geçişler bu tür tespit ek olarak, hem de çekirdeklerin tek bir fluorofor varlığı kolayca tespit edilebilir. Bu tip tayini 01:01 hücre füzyonlar incelenmesi ve çeviri inhibisyonuna bağlı olacaktır açıktır. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Heterokaryon yöntemin birincil fibroblastlar ve H1299 küçük hücreli dışı karsinom hücreleri kullanarak akış şeması ilgi gen iki floresan protein genleri tek bir kare füzyon üretmek için klonlanmış. Daha sonra hücre hatları geçici ya da inşa transfekte ve kurtarmak için izin vardır. Heterokaryon oluşumu daha fazla inkübasyon polietilen glikol (PEG) ile kısa süreli tedavi ile meydana gelir. Son olarak, faiz protein alt hücresel yerleşimi floresan mikroskobu çeşitli formları kullanarak görülmektedir. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Nükleositoplazmik kaçakçılığı ve Tavuk Anemisi Virüs VP3 proteinin aktivitesi mekik heterokaryon füzyon tarafından görüntülendi. Üst satır: dsRed-VP3 ifade kendinden erimiş H1299 hücreleri Temsilcisi Orta sıra: PEG füzyon sonra GFP-VP3 ifade birincil sünnet derisi fibroblast hücreleri (PFF) Temsilcisi Epifloresans görüntüleri Alt satır: PFF ve H1299 hücreleri Heterokaryon füzyon. Sarı GFP ve dsRed sinyaller ko gösterir. Hücreler bir Leica AF6000E floresan mikroskop ve Leica görüntüleme yazılımı kullanılarak görüntülenmiştir.

<ol><li>Belaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIPing+heterokaryons+to+analyze+nucleo-cytoplasmic+shuttling+of+yeast+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins.</a> RNA. 12, 921-930 (2006).</li>
<li>Bhaumik, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+target+of+a+transcriptional+activator+revealed+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer.</a> Genes Dev. 18, 333-343 (2004).</li>
<li>Cohen, H. R., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIST+RNA+exhibits+nuclear+retention+and+exhibits+reduced+association+with+the+export+factor+TAP%2FNXF1%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1.</a> Chromosoma. 116, 373-383 (2007).</li>
<li>Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dapper1+is+a+nucleoplasmic+shuttling+protein+that+negatively+modulates+Wnt+signaling+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus.</a> J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).</li>
<li>Grespin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+Hormone+Receptor+%CE%B11+Follows+a+Cooperative+CRM1%2FCalreticulin-mediated+Nuclear+Export+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).</li>
<li>Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptin+Nucleocytoplasmic+Shuttling+Is+Required+for+Cell+Type-Specific+Localization%2C+Apoptosis%2C+and+Recruitment+of+the+Anaphase-Promoting+Complex%2FCyclosome+to+PML+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virology%22%5BJournal%5D)">Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies.</a> J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).</li>
<li>Jeffries, S., Capobianco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+transformation+by+Notch+requires+nuclear+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization.</a> Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).</li>
<li>Keaton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+trafficking+of+G2%2FM+regulators+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).</li>
<li>Ling, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear-Cytoplasmic+Shuttling+Is+Not+Required+for+the+Epstein-Barr+Virus+EBNA-LP+Transcriptional+Coactivation+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function.</a> J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).</li>
<li>Lin, X. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RXR%CE%B1+acts+as+a+carrier+for+TR3+nuclear+export+in+a+9-cis+retinoic+acid-dependent+manner+in+gastric+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells.</a> J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).</li>
<li>Vissinga, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Export+of+NBN+Is+Required+for+Normal+Cellular+Responses+to+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation.</a> Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).</li>
<li>Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+p19Arf+localization+accompany+apoptotic+crisis+during+pre-B-cell+transformation+by+Abelson+murine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus.</a> J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).</li>
</ol>

Burada sunulan heterokaryon protokol hücre tipine spesifik lokalizasyon davranış yanı sıra Nükleositoplazmik mekik faaliyet karakterizasyonu için etkin ve kolay yorumlanabilir bir yöntem sağlar. Bu yöntem, floresan analizi duyarlılık yanı sıra yetenek görüntü canlı hücreleri ve protein dinamiği çalışmaları gerçekleştirmek yararlanır. Tekniği, pek çok farklı hücre tipleri için kolayca adapte ve hem canlı ve sabit hücre görüntüleme için uygun. Örneğin, ters floresan mikroskopi canlı görüntüleme ve zaman atlamalı video yakalama için kullanılabilir. Buna karşılık, kararlı durum lokalizasyonu veya ayrık lokalizasyonları daha ayrıntılı konfokal görüntüleme belirlenmesi için iki Epifloresans mikroskopi monte hücreleri kullanılıyor olabilir. Ayrıca, bu tür photobleaching sonra floresan kurtarma (sıkı bağlamak), ya da floresan photobleaching içinde kaybı (FLIP) gibi teknikler, lokalizasyon kinetiği 1 tespitinde kullanılabilir . Protokol alternatif fluorophores birleşme 2 konser yapılacak floresan rezonans enerji transferi (FRET) gibi protein etkileşim deneyler için izin verecek. Leptomycin B veya olumsuz egemen olarak hücresel ticareti Çeşitli inhibitörleri Ran GTPaz yapıları, özellikle ithalat veya ihracat yollar 5,6,9 bağımlılığı kurmak için kullanılabilir . <ul><li> Faaliyet mekik içeren bazı deneylerde, bakım, yeni protein sentezi nedeniyle yerelleştirme etkilerinden kaçınmak için gerekli önlemler alınmalıdır. Bu durumlarda, çeviri inhibitörleri veya sınırlı bir süre noktaları kullanılmalıdır. Ancak, bir olasılık translasyonel inhibisyonu nedeniyle eserler kalır. Biri Hücre füzyonlar her hücre tipi içeren, mekik ve yerelleştirme davranışı net yorumlanması için en çok istenen. Hücre sayısı ve füzyon koşulları (zamanlama ve konsantrasyon) optimizasyonu tür olumlu 01:01 füzyon olayları teşvik etmek için gerekli olabilir. </li><li> Protokol bazı adımlar bu optimizasyon kullanılan özel hücre tipleri bağlı olarak gerekli olacaktır dikkat etmek önemlidir. Füzyon etkinlik, Transfeksiyonu verimlilik ve füzyon sonra canlılığını deneysel işlemin Yönleri hücre tipleri arasında büyük farklılık gösterebilir. Özellikle, birincil hücre tiplerinin karmaşık kültür koşulları ve düşük transfeksiyon verimliliği nedeniyle yönetmek için zor olabilir. Lonza Nucleofector cihazı gibi teknolojileri kullanımı hücrelerin hızlı bir şekilde işleme yanı sıra önemli ölçüde artmıştır transfeksiyon verimliliği izin verebilirsiniz. Ayrıca, elektroporasyon yöntemleri takip füzyon adımları askıya hücre kolay transferi için izin verir. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>Effectene reaktifi</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023602</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modifiye Eagle&amp;rsquo;s ortamı (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td>Yüksek glukoz</td></tr><tr><td>paraformaldehit</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Serum (fetal bovin)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6 kuyucuklu plakalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen glikol 1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>528875-25GM</td><td></td></tr><tr><td>Lam örtü camları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2522-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector HDF kiti</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre tipi özel yerelleştirme analizi için heterokaryon tekniği

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Önemli bir sayıda proteinler, hücre içi ticareti veya nucleocytolasmic mekik tarafından düzenlenir. Bu proteinler, RNA ve protein nükleer ithalat / ihracat, transkripsiyonal yönetmelik, ve apoptosis gibi hücresel fonksiyonları çeşitli bir dizi gösterir. İlginçtir, hücre bölünmesi, farklılaşma ve dönüşüm de dahil olmak üzere önemli hücresel yeniden yapılanma, sık sık bu tür faaliyetler 3,4,8,10 içerir. Bu proteinlerin ve kendi düzenleyici mekanizmaların detaylı bir çalışma bu lokalizasyon değişiklikleri zor olabilir uyarılması ve kendilerini izlemek için oldukça dinamik ve zor olabilir hareketleri gibi zor olabilir. Hücresel karsinojeneze içeren çalışmalar, örneğin, anlayış yollar ve birincil, normal hücreleri ve transforme hücreleri 6,7,11,12 arasında farklılık protein aktiviteleri yararlanmaya devam. Birçok protein değişmiş dönüşümü sırasında veya lokalizasyonu, dönüşümün bir sonucu olarak verimli bir şekilde bu proteinlerin karakterize etmek için yöntemler ve ilaç hedef karsinojeneze ve açık yeni alanlar anlayışı geliştirmek stand katıldığı yollar gösterir. Burada protein ticareti analizi için bir yöntem mevcut ve birincil ve transforme memeli hücreleri arasındaki aktivite mekik. Bu yöntem, kararlı durum ya da dinamik protein lokalizasyonu tespit etmek için kullanılan esnek bir protokol sağlamak için floresan mikroskobu ile heterokaryon füzyonlar nesil birleştirir. Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, iki ayrı hücre tipleri geçici ilgi gen bağlı bir Fluoroprotein geni taşıyan plazmid yapıları ile transfekte. Ifade sonra, hücreler polietilen glikol kullanarak erimiş ve protein lokalizasyonu daha sonra çeşitli yöntemler kullanarak görüntülü olabilir. Burada sunulan protokol, özel teknikler ilave edilebilir temel bir yaklaşımdır.

Mekik hücre tipine spesifik protein yerelleştirme ve Nükleositoplazmik karakterizasyonu için esnek ve verimli bir yöntem açıklanmıştır. Bu heterokaryon yaklaşım görüntü protein lokalizasyonu hücre füzyonu sonra floresan etiketli füzyon proteinleri kullanır. Protokol kararlı durum lokalizasyonu veya canlı hücre görüntüleme dayalı daha dinamik tespitler mükellef.

Hücre Tipi özel Yerelleştirme Analizi için Heterokaryon Tekniği

Önemli sayıda protein, hücre altı taşınma veya nükleositoplazmik mekikleme yoluyla regüle edilir. Bu proteinler, çeşitlilik gösteren bir dizi...

Bu prosedürün genel amacı, iki farklı florofor taşıyan tek bir proteini iki ayrı hücre hattında eksprese ederek ve bu hücre hatlarını birbirine kaynatarak protein hareketini takip etmektir. Bu işlem, öncelikle ilgi alanı olan genin iki farklı florofor protein geninden birine kaynaştırıldığı plazmidlerin iki ayrı hücre tipine transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hücreleri bir araya getirmek ve her bir hücre tipinin protein biriktirmesine izin vermektir.Prosedürün üçüncü adımı protein sentezini inhibe etmek, ardından hücreleri polietilen glikol kullanarak kaynaştırmaktır. Prosedürün son adımı, protein lokalizasyonunu floresan mikroskopi aracılığıyla görselleştirmektir. Sonuç olarak, floresan mikroskopi ile protein lokalizasyonundaki veya taşınma davranışındaki değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu yöntem, hücreler transforme olduğunda ayrı protein fonksiyonlarının ve davranışlarının nasıl değiştiği gibi kanser biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, transforme hücreye özgü değişimler hakkında içgörü sağlayabilse de hücre diferansiyasyonu, gelişim biyolojisi ve hücre sinyalizasyonu gibi diğer çalışmalara da uygulanabilir.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaklardır çünkü her farklı hücre tipi için hem transfeksiyon koşullarının hem de füzyon koşullarının optimizasyonu gerekecektir. Plazmid DNA'nın hücrelere aktarılması için bu protokolde gösterilen ilk yöntem, Lonza nuclear effector solüsyonu kullanan NU Nuclear Affection yöntemidir; bu yöntemde, yakın zamanda pasajlanmış ve logaritmik büyüme evresinde olan hücreler fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanır vetrizasyon ile hasat edilir. Hücreler yapışkanlıklarını kaybettikten sonra, serum içeren besiyeri ekleyerek tripsini nötralize edin ve hücreler santrifüj edilirken 1500 G'de beş dakika boyunca santrifüjle toplayın.Sterilize edilmiş lamelleri doku kültürü davlumbazı içerisinde altı kuyucuklu bir plakaya yerleştirin, ardından her bir kuyucuğa 1,5 milliliters tamamlanmış kültür medyumu pipetleyin. Plağı kapatın ve dengeleme için hücre kültürü inkübatörüne taşıyın.Santrifüjlemeden sonra tüpleri çeker ocağa taşıyın, süpernatantı aspire edin ve hücre peletlerini minimum hacimde PBS içinde yeniden süspanse edin. Ardından, hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunu steril mikro santrifüj tüplerine paylaştırın. Bu işlem, örnek başına yaklaşık 5 × 10⁵ hücre sağlayacaktır; 1500 G'de beş dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.Santrifüj işlemi tamamlandığında, tüpleri hücre kültürü ön kabinine yerleştirin, SNA'yı aspire edin ve dikkatlice yeniden süspande edin. Her tüpteki hücreleri 100 µL oda sıcaklığındaki nükleer efektör çözeltisi ile süspande edin. Ardından her örneğe 5 µg plazmid DNA ekleyin ve örneği nükleer efektör Q vete'ye aktarıp kapağını kapatın.Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Örnek qve'yi Q vet tutucuya yerleştirin. Uygun nükleer efektör programını seçin ve başlatın.Minimum mortalite ile optimal transfeksiyon verimliliğini belirlemek için en uygun programın seçilmesi ön testler gerektirebilir. Ardından hücreleri, altı kuyucuklu plakaya ya karma popülasyonlar halinde ya da kontroller olarak ayrı ayrı ekleyin. Plağı inkübatöre geri yerleştirin ve hücrelerin 12 saat boyunca iyileşmesini sağlayın.Plazmidlerin geçici ekspresyonu için gösterilen ikinci yöntem, kagen etkili reaktif ile transfeksiyondur. Başlamak için, steril bir santrifüj tüpündeki 200 µL EC tamponuna her bir plazmid DNA örneğinden 0,8 µg ekleyin. Ardından, her örneğe 6,4 µL geliştirici reaktif ekleyin.Tüpleri hafifçe vurarak kısa süreliğine karıştırın ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca inkube edin. Bu kısa inkübasyonun ardından, her örneğe 20 µL etkileyici reaktif ekleyin. Her tüpü hafifçe vurarak karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkube edin.İnkübasyon sırasında, deneyde kullanılacak iki hücre hattını hazırlayın. Transfeksiyon için hücrelerin yakın zamanda pasajlanmış ve yaklaşık %80 konfluens değerinde, logaritmik büyüme evresinde olması gerekir. Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve ardından 1,5 mililitre %10 FBS içeren taze DMEM ekleyin.DNA transfeksiyon reaktifleri 15 dakika boyunca inkübe edildikten sonra, her örneğe 1,2 mililitre %10 FBS içeren DMEM medyumu ekleyip pipetleme ile karıştırın ve ardından komplekslerden yaklaşık 700 mikrolitreyi hemen damla damla altı kuyucuklu plakadaki iki kuyucuğun her birine aktarın. Plakayı dairesel hareketlerle sallayarak karıştırın. Hücrelerin inkübatörde en az üç saat boyunca transfekte olmasını sağlayın; istenirse altı kuyucuklu plakanın her kuyucuğuna bir adet sterilize edilmiş kapatma lamı yerleştirin.Hücre yapışmasını artırmak için kaplanmış lameller kullanılabilir. Ardından, transfekte edilen hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve minimal tripsinizasyon ile hücreleri toplayın. Bu işlem, her bir kuyucuğa 100 µL tripsin solüsyonu ekleyip tam kaplamayı sağlamak için plakayı çalkalayarak gerçekleştirilir.Ardından, kalıntı tripsin hemen aspire edilir. Hücrelerin 1,5 ml taze %10 FBS içeren DMEM içinde yeniden süspande edilmesiyle kalan tripsin nötralize edilir ve hücreler ya karışık popülasyonlar olarak ya da kontroller olarak ayrı ayrı plaklara ekilir. Lamine camlar içeren altı kuyucuklu plak, hücrelerin hücre kültürü inkübatöründe 12 saat boyunca toparlanması için bekletilir.Transfeksiyon yönteminden bağımsız olarak, hetero taşıyıcı infüzyonların oluşturulma prosedürü aynıdır. Transfeksiyondan sonra, kuyucuklardaki kültür medyasını uzaklaştırın ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Ardından, protein sentezini inhibe etmek için hücrelerin sikloheksimid ilele tedavi edilmesi önerilir.Hücreleri kaplayacak şekilde kültür medyuma 100 µg/mL konsantrasyonda cycloheximide ekleyin ve hücre kültürü inkübatöründe iki saat boyunca inkübe edin. İki saat sonra hücreleri inkübatörden çıkarın ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Füzyonu başlatmak için hücrelerin üzerine serumsuz DMEM içinde %50 polietilen glikol 1000 çözeltisi ekleyin ve 125 saniye boyunca inkübe edin.Oda sıcaklığında, PEG çözeltisini uzaklaştırın ve kalıntı PEG'i temizlemek için hücreleri PBS ile yıkayın. Ardından, 37 °C'ye ısıtılmış, %10 FBS içeren iki mililitre DMEM ekleyin. Hücreleri hücre kültürü inkübatöründe 18 ila 24 saat boyunca inkübe edin.18 ila 24 saatlik inkübasyonun ardından, plakayı inkübatörden çıkarın ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Daha sonra, her bir kuyucuğa PBS içinde %4'lük paraformaldehitten bir mililitre pipetleyin ve 15 dakika boyunca hafifçe ajite edin.İnkübasyon sırasında, dpi içeren monta sıvısından tek bir damla ekleyerek kullanılacak mikroskop lamlarını hazırlayın. Ardından, fikse edilmiş hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve her bir lameli küçük bir penset yardımıyla dikkatlice kaldırın. Bir parça doku yardımıyla kalıntı PBS'yi emdirip hücre tarafı aşağı gelecek şekilde monta sıvısı ve tappi içeren bir mikroskop lamının üzerine yerleştirin.Slayttaki fazla montaj medium'unu kağıt havlu ile temizleyin ve lamellerin kenarlarını mühürleyin. Tırnak cilasıyla mühürlenen hücreler, artık konfokal veya epi floresan mikroskopi ile görüntülenmeye hazırdır. Bu akış şemasında, proteinlerin hücre tipine özgü lokalizasyonunun analizi için kullanılan hetero yöntemi üç temel adımda gösterilmektedir.Polietilen glikol 1000 ile floresan etiketli bir protein eksprese eden plazmidin hücre füzyon yoluyla transfeksiyonu ve bu epi-floresan görüntülerde görülebileceği üzere floresan mikroskopi görüntülemesi; GFP etiketli tavuk anemi virüsü VP3 proteinini eksprese eden primer prepüsyum fibroblastları, küçük hücreli dışı akciğer karsinomu hattı H1299'da proteinin öncelikle sitoplazmik lokalizasyonunu göstermektedir. Aynı VP3 proteininin DsRed ile etiketlendiği kendi kendine füze olmuş kontroller, öncelikle nükleer lokalizasyon göstermektedir. Primer prepüsyum fibroblastı ve H1299 hücrelerinin heterokariyon füzyonu, transforme hücre materyalinin primer prepüsyum fibroblastına girişine yol açmakta ve primer hücre türevli GFP etiketli VP3'ün lokalizasyonunun çekirdeğe değişmesine neden olmaktadır.Bu prosedür uygulanırken, başarının kullanılan özel hücre tiplerindeki transfeksiyon verimliliğine ve bu özel hücreler için füzyon koşullarının optimize edilmesine büyük ölçüde bağlı olduğunu unutmamak önemlidir. Lokalizasyon dinamiklerinin gerçek zamanlı analizini içeren ek soruları yanıtlamak için bu prosedürün ardından flip ve frap gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, floresan işaretli proteinler tanıtarak ve hücre füzyonları oluşturarak hücre tipine özgü protein lokalizasyonlarının nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

heterokaryon-technique-for-analysis-of-cell-type-specific-localization

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yazıda, sıçan primer nöronal kültürlerin ve sonraki transcriptome analizi Arna amplifikasyon kullanarak tek hücre hasat için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, herhangi bir hücre tipi için genellenememektedir.

Tek Hücre Transcriptome Analizi

Drosophila dokusu sık sık hücre tipleri heterojen bir karışım içerir. Belirli bir doku, spesifik hücre tiplerinde gen ekspresyonunu incelemek için, çekirdekler, genetik olarak etiketlendi ve daha sonra bir afinite dayalı bir yaklaşım kullanılarak izole edilebilir. İzole edilmiş çekirdek bu gen ekspresyon analizi ve kromatin immüno olarak alt uygulamalar için kullanılabilir.

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım<em&gt; Drosophila</emGen ekspresyon analizi için&gt; Dokular

Bu protokolün amacı, hücre tipine özgü gen ekspresyonunun, epigenetik belirteçlerin ve/veya protein ekspresyonunun sonraki analizi için belirli nöral hücre tiplerini sıralamak için floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) tekniğini kullanmaktır.

Sıçan beyin dokusunda incelemek için THP kullanılarak hücre-tipi-spesifik gen ifadesi

Burada, insan hücrelerindeki endojen ve eksojen sentromer-kinetokor proteinlerini tespit etmek ve bu protein seviyelerini fiksasyon (paraformaldehit, aseton veya metanol fiksasyonu) kullanarak dolaylı immünofloresan boyama yoluyla sentromer-kinetokorlarda ölçmek için protokolleri rapor ediyoruz.

Endojen ve İmmünofloresan Analizi ve Eksojen Sentromer-kinetochore Proteinler

Burada, nöronal hücre tiplerinin izolasyondan önce sınıflandırılması ve ardından tek hücreli transkriptomların karakterizasyonu için kombinatoryal bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol, başarılı RNA Sequencing (RNA-Seq) için numunelerin hazırlanmasını optimize eder ve özellikle hücresel çeşitliliğin daha iyi anlaşılması için tasarlanmış bir metodoloji tanımlar.

Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi

Bu iletişim kuralı etiket ve canlı kromozomlar Mitotik hücre Histone2B-GFP BacMam 2.0 etiket ve bir iplik kaset confocal mikroskobu sistemi kullanarak görselleştirmek için basit ve uygun bir yöntem açıklanır.

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Burada, içinde canlı hücre organelleri tek zar proteinleri çok renkli yerelleştirme için bir iletişim kuralı mevcut. Fluorophores eklemek için kendi kendine etiketleme protein kullanılır. Aynı organel farklı membranlar bölmeleri içinde bulunan proteinler, ~ 18 hassasiyetle lokalize nm.

Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Toplu gen ifade ölçümleri bulut tek hücre farkları türdeş olmayan hücre popülasyonlarının. Burada, bir protokol açıklamak nasıl tek hücreli gen ifade analizi ve dizin için Variety aktif hücre sıralama (FACS tarafından) sıralama heterojenite betimlemek için birleştirilebilir ve immunophenotypically karakterize tatlı ayrı hücre popülasyonlarının.

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Bu protokolün amacı, melez hücreler oluşturmak için iki farklı hücre türünü birleştirmektir. Erimiş hücrelerin floresan mikroskobu analizi hücresel organellerin menşe hücresini izlemek için kullanılır. Bu tetki, hücre yapısı nın ve fonksiyonun hücre füzyonu ile tedirginlik lere nasıl tepki verdiğinin araştırılması için kullanılabilir.

Hücresel Yapı ve Fonksiyonun Perturbasyonu için Genom Düzenlenmiş Hücre Hatları hücre-hücre Füzyon

Tek hücreli/tek çekirdekli transkriptomiklerin ve multi-omiklerin başarısı büyük ölçüde hücrelerin/çekirdeklerin kalitesine bağlıdır. Bu nedenle, hücrelerin/çekirdeklerin dokudan izole edilmesi ve saflaştırılması yüksek düzeyde standartlaştırılmalıdır. Bu protokol, aşağı akış tek çekirdekli multiom testi için beyin ve kemik iliğinden çekirdeklerin hazırlanmasını açıklar.

Tek Çekirdekli Multiom Tahlilleri için Yüksek Kaliteli Beyin ve Kemik İliği Çekirdeği Hazırlığı

Uzaysal analiz için euchromatin, heterokromatin ve RNAP II'nin tekrarlanabilir haritalanmasını sağlayan üç renkli kromatin tek molekül lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) boyama ve analiz protokolü sunuyoruz. Bu protokol, kromatinle ilişkili hedefler dahil olmak üzere yoğun nükleer ortamlarda verimli çok renkli etiketleme sağlar ve güvenilir eşzamanlı tespiti sağlar.

Yoğun Nükleer Ortamda Kromatinin Araştırılması İçin Çok Etiketli Tek Molekül Lokalizasyon Mikroskopi Protokolü

Öğrenin hücre tipine özel protein yerelleşmesini ve nükleositoplazmik taşınımı heterokaryon tekniği ile incelemeyi. Bu yöntem, floresan mikroskopi kullanarak kanser biyolojisi ve hücre sinyalleşmesi araştırmalarında protein dinamiklerini analiz etmenizi sağlar.

Hücre Tipi özel Yerelleştirme Analizi için Heterokaryon Tekniği

Daha fazla video keşfet