Hücre Tipi özel Yerelleştirme Analizi için Heterokaryon Tekniği

Bu prosedürün genel amacı, iki farklı florofor taşıyan tek bir proteini iki ayrı hücre hattında eksprese ederek ve bu hücre hatlarını birbirine kaynatarak protein hareketini takip etmektir. Bu işlem, öncelikle ilgi alanı olan genin iki farklı florofor protein geninden birine kaynaştırıldığı plazmidlerin iki ayrı hücre tipine transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hücreleri bir araya getirmek ve her bir hücre tipinin protein biriktirmesine izin vermektir.

Prosedürün üçüncü adımı protein sentezini inhibe etmek, ardından hücreleri polietilen glikol kullanarak kaynaştırmaktır. Prosedürün son adımı, protein lokalizasyonunu floresan mikroskopi aracılığıyla görselleştirmektir. Sonuç olarak, floresan mikroskopi ile protein lokalizasyonundaki veya taşınma davranışındaki değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, hücreler transforme olduğunda ayrı protein fonksiyonlarının ve davranışlarının nasıl değiştiği gibi kanser biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, transforme hücreye özgü değişimler hakkında içgörü sağlayabilse de hücre diferansiyasyonu, gelişim biyolojisi ve hücre sinyalizasyonu gibi diğer çalışmalara da uygulanabilir.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaklardır çünkü her farklı hücre tipi için hem transfeksiyon koşullarının hem de füzyon koşullarının optimizasyonu gerekecektir. Plazmid DNA'nın hücrelere aktarılması için bu protokolde gösterilen ilk yöntem, Lonza nuclear effector solüsyonu kullanan NU Nuclear Affection yöntemidir; bu yöntemde, yakın zamanda pasajlanmış ve logaritmik büyüme evresinde olan hücreler fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanır vetrizasyon ile hasat edilir. Hücreler yapışkanlıklarını kaybettikten sonra, serum içeren besiyeri ekleyerek tripsini nötralize edin ve hücreler santrifüj edilirken 1500 G'de beş dakika boyunca santrifüjle toplayın.

Sterilize edilmiş lamelleri doku kültürü davlumbazı içerisinde altı kuyucuklu bir plakaya yerleştirin, ardından her bir kuyucuğa 1,5 milliliters tamamlanmış kültür medyumu pipetleyin. Plağı kapatın ve dengeleme için hücre kültürü inkübatörüne taşıyın.

Santrifüjlemeden sonra tüpleri çeker ocağa taşıyın, süpernatantı aspire edin ve hücre peletlerini minimum hacimde PBS içinde yeniden süspanse edin. Ardından, hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunu steril mikro santrifüj tüplerine paylaştırın. Bu işlem, örnek başına yaklaşık 5 × 10⁵ hücre sağlayacaktır; 1500 G'de beş dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.

Santrifüj işlemi tamamlandığında, tüpleri hücre kültürü ön kabinine yerleştirin, SNA'yı aspire edin ve dikkatlice yeniden süspande edin. Her tüpteki hücreleri 100 µL oda sıcaklığındaki nükleer efektör çözeltisi ile süspande edin. Ardından her örneğe 5 µg plazmid DNA ekleyin ve örneği nükleer efektör Q vete'ye aktarıp kapağını kapatın.

Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Örnek qve'yi Q vet tutucuya yerleştirin. Uygun nükleer efektör programını seçin ve başlatın.

Minimum mortalite ile optimal transfeksiyon verimliliğini belirlemek için en uygun programın seçilmesi ön testler gerektirebilir. Ardından hücreleri, altı kuyucuklu plakaya ya karma popülasyonlar halinde ya da kontroller olarak ayrı ayrı ekleyin. Plağı inkübatöre geri yerleştirin ve hücrelerin 12 saat boyunca iyileşmesini sağlayın.

Plazmidlerin geçici ekspresyonu için gösterilen ikinci yöntem, kagen etkili reaktif ile transfeksiyondur. Başlamak için, steril bir santrifüj tüpündeki 200 µL EC tamponuna her bir plazmid DNA örneğinden 0,8 µg ekleyin. Ardından, her örneğe 6,4 µL geliştirici reaktif ekleyin.

Tüpleri hafifçe vurarak kısa süreliğine karıştırın ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca inkube edin. Bu kısa inkübasyonun ardından, her örneğe 20 µL etkileyici reaktif ekleyin. Her tüpü hafifçe vurarak karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkube edin.

İnkübasyon sırasında, deneyde kullanılacak iki hücre hattını hazırlayın. Transfeksiyon için hücrelerin yakın zamanda pasajlanmış ve yaklaşık %80 konfluens değerinde, logaritmik büyüme evresinde olması gerekir. Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve ardından 1,5 mililitre %10 FBS içeren taze DMEM ekleyin.

DNA transfeksiyon reaktifleri 15 dakika boyunca inkübe edildikten sonra, her örneğe 1,2 mililitre %10 FBS içeren DMEM medyumu ekleyip pipetleme ile karıştırın ve ardından komplekslerden yaklaşık 700 mikrolitreyi hemen damla damla altı kuyucuklu plakadaki iki kuyucuğun her birine aktarın. Plakayı dairesel hareketlerle sallayarak karıştırın. Hücrelerin inkübatörde en az üç saat boyunca transfekte olmasını sağlayın; istenirse altı kuyucuklu plakanın her kuyucuğuna bir adet sterilize edilmiş kapatma lamı yerleştirin.

Hücre yapışmasını artırmak için kaplanmış lameller kullanılabilir. Ardından, transfekte edilen hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve minimal tripsinizasyon ile hücreleri toplayın. Bu işlem, her bir kuyucuğa 100 µL tripsin solüsyonu ekleyip tam kaplamayı sağlamak için plakayı çalkalayarak gerçekleştirilir.

Ardından, kalıntı tripsin hemen aspire edilir. Hücrelerin 1,5 ml taze %10 FBS içeren DMEM içinde yeniden süspande edilmesiyle kalan tripsin nötralize edilir ve hücreler ya karışık popülasyonlar olarak ya da kontroller olarak ayrı ayrı plaklara ekilir. Lamine camlar içeren altı kuyucuklu plak, hücrelerin hücre kültürü inkübatöründe 12 saat boyunca toparlanması için bekletilir.

Transfeksiyon yönteminden bağımsız olarak, hetero taşıyıcı infüzyonların oluşturulma prosedürü aynıdır. Transfeksiyondan sonra, kuyucuklardaki kültür medyasını uzaklaştırın ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Ardından, protein sentezini inhibe etmek için hücrelerin sikloheksimid ilele tedavi edilmesi önerilir.

Hücreleri kaplayacak şekilde kültür medyuma 100 µg/mL konsantrasyonda cycloheximide ekleyin ve hücre kültürü inkübatöründe iki saat boyunca inkübe edin. İki saat sonra hücreleri inkübatörden çıkarın ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Füzyonu başlatmak için hücrelerin üzerine serumsuz DMEM içinde %50 polietilen glikol 1000 çözeltisi ekleyin ve 125 saniye boyunca inkübe edin.

Oda sıcaklığında, PEG çözeltisini uzaklaştırın ve kalıntı PEG'i temizlemek için hücreleri PBS ile yıkayın. Ardından, 37 °C'ye ısıtılmış, %10 FBS içeren iki mililitre DMEM ekleyin. Hücreleri hücre kültürü inkübatöründe 18 ila 24 saat boyunca inkübe edin.

18 ila 24 saatlik inkübasyonun ardından, plakayı inkübatörden çıkarın ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Daha sonra, her bir kuyucuğa PBS içinde %4'lük paraformaldehitten bir mililitre pipetleyin ve 15 dakika boyunca hafifçe ajite edin.

İnkübasyon sırasında, dpi içeren monta sıvısından tek bir damla ekleyerek kullanılacak mikroskop lamlarını hazırlayın. Ardından, fikse edilmiş hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve her bir lameli küçük bir penset yardımıyla dikkatlice kaldırın. Bir parça doku yardımıyla kalıntı PBS'yi emdirip hücre tarafı aşağı gelecek şekilde monta sıvısı ve tappi içeren bir mikroskop lamının üzerine yerleştirin.

Slayttaki fazla montaj medium'unu kağıt havlu ile temizleyin ve lamellerin kenarlarını mühürleyin. Tırnak cilasıyla mühürlenen hücreler, artık konfokal veya epi floresan mikroskopi ile görüntülenmeye hazırdır. Bu akış şemasında, proteinlerin hücre tipine özgü lokalizasyonunun analizi için kullanılan hetero yöntemi üç temel adımda gösterilmektedir.

Polietilen glikol 1000 ile floresan etiketli bir protein eksprese eden plazmidin hücre füzyon yoluyla transfeksiyonu ve bu epi-floresan görüntülerde görülebileceği üzere floresan mikroskopi görüntülemesi; GFP etiketli tavuk anemi virüsü VP3 proteinini eksprese eden primer prepüsyum fibroblastları, küçük hücreli dışı akciğer karsinomu hattı H1299'da proteinin öncelikle sitoplazmik lokalizasyonunu göstermektedir. Aynı VP3 proteininin DsRed ile etiketlendiği kendi kendine füze olmuş kontroller, öncelikle nükleer lokalizasyon göstermektedir. Primer prepüsyum fibroblastı ve H1299 hücrelerinin heterokariyon füzyonu, transforme hücre materyalinin primer prepüsyum fibroblastına girişine yol açmakta ve primer hücre türevli GFP etiketli VP3'ün lokalizasyonunun çekirdeğe değişmesine neden olmaktadır.

Bu prosedür uygulanırken, başarının kullanılan özel hücre tiplerindeki transfeksiyon verimliliğine ve bu özel hücreler için füzyon koşullarının optimize edilmesine büyük ölçüde bağlı olduğunu unutmamak önemlidir. Lokalizasyon dinamiklerinin gerçek zamanlı analizini içeren ek soruları yanıtlamak için bu prosedürün ardından flip ve frap gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, floresan işaretli proteinler tanıtarak ve hücre füzyonları oluşturarak hücre tipine özgü protein lokalizasyonlarının nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.