Güve Koku Sistemi Elektrofizyolojik Ölçümler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, böcek sinir sisteminden koku yanıtlarının kaydedilmesinin kolaylığını göstermektir. Bu, canlı bir güve sabitlenerek ve kokuneyle tetiklenen yanıtları kaydetmek için antene veya tek bir nörona elektrotlar bağlanarak gerçekleştirilir. İlk adım olarak, toprak hattı olarak göz kısmına salin dolu bir cam elektrot yerleştirilir; ikinci adımda ise sabitlenmiş güvelerden herhangi birine, koku reseptör nöronundan tekli ünite yanıtlarını kaydetmek amacıyla bir antenigram şeklinde elektriksel yanıtların kaydedilmesine olanak tanıyan salin dolu bir cam elektrot yerleştirilir.

Kayıt elektrodu, bir antenin tabanına yerleştirilir. Ardından, sinyalleri kaydetmek ve saklamak amacıyla anten sinyali yükseltilir ve bir analog dijital dönüştürücüye aktarılır. Kaydedilen elektriksel sinyalin bir EAG sinyali veya bir spike (spike) formunda olduğu, doza bağlı koku kaynaklı yanıtlar gösteren sonuçlar elde edilir.

Naval portakal ağacı yaprak kurduyla yapılan sabitlenmiş canlı örneklemlerden Enterogram kaydetmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Bu tekniğin temel avantajı, hazırlığın uzun süre dayanması, aynı güve örneğinin birden fazla yanıt kaydetmek için defalarca kullanılabilmesi ve aynı güvenin ayrıca antenindeki tek bir sensörden tekil ünite yanıtlarını kaydetmek için kullanılabilmesidir. Kaliforniya'da önemli bir tarımsal ürün olduğu için naval portakal ağacı yaprak kurdu üzerine odaklandık.

Bununla birlikte, bu yöntem sadece temel koku fonksiyonu sorularını yanıtlamak için değil, aynı zamanda yeni çekicilerin geliştirilmesi için de diğer lepidoptera böceklerinde kullanılabilir. Güve koku sistemi üzerine yapılan bu çalışmada, naval portakal kurdu *Ullo Ella* kullanılmıştır.

Böcek kolonisi, çevresel odalarda yaklaşık 28 °C sıcaklıkta, yaklaşık %75 bağıl nemde ve 16 saat ışık ile sekiz saat karanlık fotoperiyodunda, buğday kepeği diyetiyle beslenerek sürdürülür. Plastik bir kutunun içine 10 katmana kadar suya doyurulmuş kağıt havlu yerleştirerek yeni çıkan güveler için kaplar oluşturun. Çıkan güveleri günlük olarak toplayıp cinsiyetlerini belirleyin, ardından plastik kutuya aktarın. Elektrofizyolojik kayıt hazırlıkları için hava sirkülasyonuna izin verecek şekilde kutuyu delikli bir kapakla kapatın.

İlk olarak, 200 µL pipet ucunu ucunun çapı yaklaşık iki milimetre olacak şekilde keserek güve için bir tutucu hazırlayın. EAG veya SSR için, çıkıştan sonraki iki ila dört günlük bir güve seçin. Güveyi, nemlendirilmiş bir peçete parçası kullanarak pipetin uç tarafının tersindeki ucundan içeri yerleştirin ve güveyi nazikçe pipet ucuna doğru itin.

Antenler ve başın bir kısmı uçtan çıkana kadar güveyi itmeye devam edin; başın küçük bir göz kısmını ve iki anteni açıkta bırakacak şekilde başı kurumayan bir kil ile kapatarak açıkta kalan başı sabitleyin. Güve preparatını, uç çapları bir mikrondan küçük cam elektrotlar kullanarak elektrogram mikro manipülatörünün platformundaki iki elektrot tutucu arasına yerleştirin. Elektrotları centum limb ringer ile geri doldurun.

Mikroskop altında, gözün açık olan bölgesine bir elektrot saplayın. Bu, referans elektrot olarak hizmet edecektir. Bir sonraki adım, kayıt elektrotlarını antenlere yerleştirmektir.

Erkek deniz turuncusu güvesinin anteni çok segmentlidir ve her segment çok sayıda kıl benzeri yapı ile bezelidir. Illa, ekteki görüntü antenlerden kayıt alınmasını kolaylaştırmak için illa detaylarını gösteren bir taramalı elektron mikrografıdır. Distal uçtaki bir veya iki anten segmentini kesin.

Ardından, her iki anteni de kayıt elektroduna yerleştirin. Alternatif olarak, tek sens kayıtları için kayıt elektrodunu bir sensin tabanına yerleştirin. Senslerden gelen aksiyon potansiyelleri yüksek empedanslı bir ön yükseltici ile yükseltilir ve çevrimdışı olarak autos spike yazılımı ile analiz edilmek üzere USB akıllı dijital analog dönüştürücüye aktarılır.

Bir sonraki adım, naval portakal kurdunun dişi feromon karışımının ana bileşenlerinden biri olan ZZ 1113 HEXA deca Now kullanılarak kimyasal stimülüsün hazırlanmasıdır; kimyasalı DIC dilüsyonları oluşturmak için heksan ile seyreltin. Bir watman filtre kağıdı üzerine 10 µL stimülüs çözeltisi yükleyin. Çözücüyü, kağıdı 10 saniye boyunca hafifçe sallayarak buharlaştırın.

Bir çeker ocuk altında, şeridi beş mililitrelik bir polipropilen şırıngaya yerleştirin; hazırlığı kontrol etmek için yalnızca heksan içeren bir şırınga ve boş bir şırınga kullanın. EAG veya SSR, stimulus kontrolörü tarafından saniyede 20 mililitre hızla iletilen nemlendirilmiş bir hava akımı içerisinde tutulur. Kimyasal stimulus içeren şırıngayı hava akımı kontrolörüne bağlayın.

İki saniyelik bazal elektriksel sinyalleri kaydedin. Ardından, Airstream'e 500 milisaniye boyunca saniyede dört mililitre uyarım darbesi ekleyin. Elektriksel sinyallerin kaydına sekiz saniye daha devam edin.

Uyarılmalar arasında en az bir dakika bekleyin. Bu şekil, sabitlenmiş erkek bir güve anteninden elde edilen güçlü, doza bağımlı bir yanıtı göstermektedir. Dişi feromon bileşeni olan CZ 1113 hexaco ile uyarılmıştır.

Hekzana verilen yanıt. Taşıyıcı kontrol mavi çizgi ile sırasıyla gösterilmiştir. Feromonun daha yüksek dozları, sırasıyla daha büyük elektrogram kayıtları oluşturur.

Bu şekil, dişi feromon bileşeninden gelen stimülasyona yanıt olarak bir trikanduma ait hücre dışı tek ünite kayıtlarını göstermektedir. Bu kayıtlar, doza bağlı eksitatör bir yanıt sergilemektedir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem düzgün bir şekilde yürütüldüğü takdirde birkaç saat içinde tamamlanabilir.

Bu yöntem kullanılırken kontaminasyondan kaçındığınızdan ve mümkün olduğunca saf kimyasallar kullandığınızdan emin olun.