Name: Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans ömrünü 96 kuyucuklu mikrotiter plakalarda ölçme yöntemini. Bu yüksek verimli tarama tekniği, uzun ömürlülüğü artırabilecek bileşikleri hızla belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu Protokol, başlangıçta Linda Buck Laboratuvar Xiaolan Ye ve Michael Petrascheck Seattle&#39;daki Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi&#39;nde geliştirildi. Yukarıda ayrıntılı bir versiyonu, toplumun tüm işlem yapmak için hazırlanmıştır. Carol Taylor, Sarah LeBoeuf ve Andy Tomacelli protokol eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Bu el yazması # 2866 Scripps Araştırma Enstitüsü. Petrascheck Lab Novartis ADI programı tarafından finanse edilmektedir.

Bakış: protokol dört bölümden ayrılmıştır. Bölüm 1 beslenme bakteri nasıl hazırlanacağını açıklar. Bölüm 2, solucan kültürü nasıl hazırlanacağını açıklar. Bölüm 3 ömrü puanı nasıl açıklamaktadır. Bölüm 4, bazı temsilcisi sonuçları gösterir ve Bölüm 5, gerekli çözümler hazırlamak anlatılmaktadır. Ömrü deneyleri tamamlamak için birkaç hafta sürebilir. Protokol haftanın her adım için, gün ve günün zamanı planlama kolaylaştırmak için yer almaktadır. (Gün 0) L4 aşamasında tüm protokol için referans noktası olarak kullanılır. 1. Besleme Bakteriler hazırlanması Bu bölümde, beslenme bakterilerin hazırlık açıklamaktadır. Özel E. coli OP50 denir C.elegans beslemek için kullanılan suşu. Diğer bakterilerin solucan kültürüne çapraz bulaşmasını önlemek için bu protokol, önce, OP50 gerginlik Carbenicillin / ampisilin dirençli 21 yapılmıştır. OP50 4-5 gün önceden hazırlayın. OP50 ile temas eden tüm malzemeler steril olmalıdır. -7 Gün: Perşembe (1. hafta): 5 ml, 37 gece boyunca bir tek OP50 kolonisi ve inkübe ° C bakteriyel bir çalkalayıcı 100 mg / ml ampisilin ve 0,1 mg / ml Amfoterisin B içeren TB İnokülasyon . Gün -6: Cuma (hafta 1). Sabah 08:30. Kültür için yeterli süre doygunluk ulaşmak için izin vermek için erken İnokülasyon <ol><li> 50 mcg / ml ampisilin içeren 300 mL TB OP50 1:2000 gecelik kültür sulandırınız. Doygunluk ulaştı kadar 37 8-12 saat bir bakteri çalkalayıcı ° C kültür inkübe edin. Kültür 14 saatten daha uzun büyümek için izin vermeyin. </li><li> OP50, ön ağırlıklı steril bir santrifüj tüpü içine aktarın. Pelet bir masa üstü santrifüj 3500 rpm (2200 xg) 10 dakika süreyle santrifüj OP50. </li><li> Süpernatantı atın ve steril su içinde yeniden askıya OP50 pelet ve santrifüj yoluyla yeniden pelet. Bu yıkama iki kez tekrarlayın. </li><li> İkinci yıkamadan sonra, kalan suyun dikkatli bir şekilde kaldırın. Tüp su bırakılmalıdır. Pelet içeren santrifüj tüpü tartılır ve pelet ağırlığı belirlemek için, boş santrifüj tüp ağırlığı çıkarma. </li><li> 100 mg / ml 'lik bir konsantrasyon iyice S-komple pelet yeniden askıya. Hiçbir kümeleri bırakılmalıdır. </li><li> 100 mg / ml OP50 2 x10 10 bakteri / ml konsantrasyonu uygun olmalıdır. ML başına bakteri optik yoğunluk ve sayı arasındaki ilişki biliniyorsa mL başına bakteri sayısını belirlemek için bir fotoğraf spektrometre kullanın. Gerekirse, OP50 besleme çözüm 2 x10 10 bakteri / ml konsantrasyon ayarlayın. </li><li> 4 OP50solution Mağaza ° C kadar solucan kültürü için kullanılır. </li></ol> 2. Senkron Worm Kültür hazırlanması Bu bölümde, solucan kültürünün hazırlanması açıklamaktadır. Onun hedefi, solucanlar bir yaş eşzamanlı nüfus üretmek için. , Çamaşır suyu tedavisinden sonra 5. adımda C.elegans ile temas eden tüm malzemeler steril olmalıdır . Plakalar 20 ° C sürece aksi belirtilmedikçe tutulur. Gün -6: Cuma (hafta 1), 16:00: yeni bir plaka Transfer hayvanlar <ol><li> Solucan nüfusunun çoğunluğu açlıktan L1 larvaları oluşan bir 5-10 gün eski NGM plaka atın. </li><li> Bunsen beki üzerinden kısa bir süre ısıtılması ile metal bir spatula sterilize edin. Soğumasını bekleyin. Hasret solucanları içeren plaka agar parçaları kesip soğutmalı spatula kullanın. OP50 ile taze bir 10 cm NGM plaka numaralı seribaşı üzerine bu parçaları birkaç aktarın. Yaklaşık inkübe edin. 65 saat 20 ° C kadar solucan nüfusunun çoğunluğu gravid yetişkin oluşur. Gravid yetişkin içine büyümeye hasret L1 hayvanlar için gereken zaman zorlanma zorlanma değişebilir. </li></ol> Gün -3: Pazartesi (2. hafta) saat 10:00: senkron bir nüfusun oluşturulması <ol start="3"><li> 5-10 ml steril su ile plaka yıkayarak 10 cm plaka solucanları toplayın. Solucan / su solüsyonu 15 ml konik bir tüp içine aktarın. </li><li> 1200 rpm (280 xg) bir masaüstü santrifüj 2 dakika santrifüj solucanlar yıkayın. Süpernatant atın ve 10 ml su ekleyin. Tekrarlayın. </li><li> Süpernatantı ve taze hazırlanan çamaşır suyu / NaOH çözeltisi (2.5 ml çamaşır suyu, 1 ml 10N NaOH, 6.5 ml H 2 O) 5 ml ekleyin. Solucanların açık ara kadar oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Her dakika hafifçe vorteks için emin olun. Diseksiyon mikroskobu altında reaksiyon ilerleme izleyin. </li><li> En kısa sürede çözülür tüm yetişkinler gibi tepki nötralize etmek için M9 tampon 5 ml ekleyin. </li><li> (2500 rpm'de 2 dakika santrifüj yumurta 10 ml M9 tamponu ile üç kere yıkayın1100 xg). </li><li> Aynı yumurta yıkayın 10 ml G-tam 2500 rpm (1100 xg) 2 dk santrifüj. </li><li> Süpernatantı, 10 ml S-tam ve taze bir 50 ml konik tüp çözüm transfer. S-tam 30 ml, 40 ml nihai hacmi ekleyin. Nutator veya benzeri bir cihaz, oda sıcaklığında yavaşça gecede tüp sallamak. </li></ol> -2 Gün: Salı (2. hafta), 12:00: Tohum tabak içine hayvanlar <ol start="10"><li> Diseksiyon kapsamında, solucanlar, gece boyunca yumurtadan olmadığını kontrol edin. Diseksiyon kapsamı kullanarak 10 mcL damla solucanlar sayısı sayarak S-komple bir çözüm solucanlar konsantrasyonu belirleyin. Her bir numune için en az 10 damla güvenin. </li><li> 80-100 solucanlar / mL S-tam bir konsantrasyon solucanlar yeniden askıya aldı. Carbenicillin (stok 100 mg / ml) 0.1 mg / ml bir final konsantrasyon son konsantrasyonu 50 mcg / mL ve Amfoterisin B (stok 250 mcg / mL) ekleyin. Bir nutator çalkalayınız. Solucanlar büyük miktarlarda hazırlanması, filtre kapağı ile 600 mL nunclon şişesi kullanın. </li><li> 02:30 nihai konsantrasyonu 6 mg / ml (= 1.2 x10 9 bakteri / ml) Bölüm 1 hazırlanan OP50 ekleyin. Geri dön OP50 4 ° C </li><li> 96 plaka her kuyuya 120 mcL worm/OP50 çözüm aktarın. Şeffaf bir alt 96 kuyucuğu kullanın. Pipetleme süre askıya solucanlar tutmak için emin olun. </li><li> Kontaminasyon ve buharlaşmasını önlemek için bir bant macunu kullanarak plaka Seal. 2 dakika süreyle mikrotiter plate çırpıcısı plaka Shake ve hayvanlar L4 sahne ulaşana kadar 2 gün 20 ° C'de inkübe edin. </li></ol> Gün 0: Perşembe (2. hafta) öğleden önce: Fluorodeoxyuridine ekleyerek hayvanlar sterilize (FUDR) <ol start="15"><li> Hayvanların her kuyuya 0.6 mM FUDR stok solüsyonu 30 mcL sterilize etmek. Bu adım, her bir kuyunun 150 mcL son hacmi getiriyor ve 5 mg / ml (1x10 9 bakteri / ml) 6 mg / ml OP50 nihai konsantrasyonu azaltır . Mühür ve plaka bant Avcılar kullanarak bir mikrotiter plate çırpıcısı 2-3 dakika sallayın. OP50 -2 gün 2:30 'da eklendi, FUDR, öğleden önce eklendi olması önemlidir. 20 ° C inkübatör plakaları dön </li></ol> 1. Gün: Cuma (hafta 2): kültürüne ilaç <ol start="16"><li> By 9:00 am hayvanların en gravid ve birkaç yumurta her içermelidir. Olan etkisi ömrü istenilen konsantrasyonda test edilmesi ilaçlar ekleyin. DMSO uyuşturucu çözme Eğer DMSO son konsantrasyonları,% 0.6 C.elegans ömrünü kısaltır DMSO konsantrasyonlarda daha yüksek olarak,% 0.6 'dan fazla olmamalıdır. Ilacın eklenmesinden sonra, bant macun plakaları ve mikrotiter plate çırpıcısı 2-3 dakika sallayın. 20 ° C inkübatör plakaları dön </li><li> Ilaçların eklenmesi, özellikle su dışında diğer bir çözücü kullanarak, zaman zaman, plaka başına birkaç hayvanları öldürebilir. Inverted mikroskop, ölü hayvanları kontrol etmek için kullanın. Genel olarak, 96 plaka başına en az 10 ölü hayvanlar olması gerekir. 20 ° C inkübatör plakaları geri dön. </li></ol> 4. Gün: Pazartesi (hafta 3): Değişim Avcılar <ol start="18"><li> Taze oksijen mühürleyen kaldırmak kültür girmek için izin vermek için, 1 dakika bekleyin ve plaka yeniden mühürlemek. Mikrotiter plate çırpıcısı 2-3 dakika plaka çalkalayınız. Haftada bir kez tekrarlayın. </li></ol> 5. Gün: Salı (3 hafta): açlık önlemek için yeni OP50 ekle <ol start="19"><li> 96 kuyu açlık önlemek için her bölüm 1 hazırlanan 100 mg / ml OP50 çözüm 5 mcL ekleyin. </li></ol> 3. Ömrü, Puanlama. Bu bölümde, Bölüm 2 senkronize solucan nüfusun yaşam hayvanlar ölene kadar nasıl izlenir açıklamaktadır. 96 kuyucuğu hayvanları gözlemlemek için, 2x veya 2.5x objektif bir inverted mikroskop kullanın. Kayıt sağkalım verileri haftada üç kez, Pazartesi, Çarşamba ve Cuma günleri. Hareket hayvanların canlı ya da ölü olup olmadığını belirlemek için kullanın. Güçlü ışık, özellikle de mavi ışık taşımak için hayvanların neden olur. Testte ölü hayvanlar çıkarmayın. Bazen, hayvanların hareket etmedi ve bir önceki sayısında ölü tespit edildi, daha sonra üzerinde hareket edebilir. <ol><li> 0 gün, deney başında solucanlar her kuyuda toplam sayısını. Bu kuyulardan hayvan olarak analiz fazla 18 hayvan içeren kuyu sansür yeterli OP50 olmaz ve diyet kısıtlaması etkilerini gösterecektir. </li><li> Hayvanların hareket ettiğini, 2 dakika süreyle mikrotiter plate çalkalayıcı 96 plaka sallamak şansını artırmak için. önce sayma. </li><li> Her sayma oturumda, kayıt tarih ve hayvanların sayısı.canlı hayvan olarak hareket ettirin. Sıvı hareket katı ortam üzerinde çok daha kolay ve güçlü ışıkları ile uyarılabilir. Daha yüksek bir büyütme yutak ucu gibi çok ince hareketler nokta yardımcı olabilir. Bu ince hareketler, sık sık çok yaşlı hayvanlarda görülen tek hareket. </li><li> 20 ° C inkübatör plakaları dön </li><li> Tüm hayvanların ölü kadar 2-3 günde bir 2-4 adım tekrarlayın. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar. Bu bölüm, bu testte ve bazı temsilcisi sonuçları tarafından oluşturulan ömrünü veri kayıtlarını tutmak nasıl bir örnek gösterir. Şekil 1A Bu testte sırasında ömrü veri kaydetmek için nasıl bir örnek gösterir. Bir excel sayfasına her kuyuda nüfusun hayatta kalma izlemek için kullanılır. Her iyi plakasını koordine, gerilme, ilaç, ilaç konsantrasyonu ve 0 gün canlı hayvanların toplam sayısı (X0) Deneyin başında. Kayıt tarihi yanı sıra, her bir kuyu içinde çeşitli toplumlarda hayatta takip edebilmek için bir hafta, canlı ve ölü hayvan sayısının üç katı. Sonuçları grafik için, her gün için canlı hayvanların kısmını hesaplamak ve gün içinde zamanın bir fonksiyonu olarak arsa. P-değerleri STATA ya da benzer bir yazılım gibi istatistiksel paketleri kullanılarak hesaplanmalıdır. C.elegans, orta ömrü sıcaklığa bağlıdır. Şekil 1B ömrü sıcaklık bağımlı değişiklikler doğru ömrü testi 22 mikrotiter çoğaltılamaz olduğunu gösterir. Benzer şekilde, mikrotiter plate assay vahşi tip N2 hayvanlar 23-24 25 (Şekil 1C) farklı yaşam süresini bildirildi mutantlar ömrü değişiklikler üretir. Tahlil daha nicel ifadeler yapmak için kullanılabilir. Fig1D ortalama ömrü 7 Mirtazepine konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Her veri noktası 7-12 nüfusun ortalama ömrü, her zamanda farklı yaşam temsil eder. De başına hayvan sayısı (5-15 hayvanlar) nispeten düşük olsa da hata çubukları görüleceği gibi, iyi-iyi varyasyon nispeten küçük. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 tabanlı ömrü testi mikrotiter plate literatürde bildirilen ömrü değişiklikleri doğru üretir. (A) Örnek verileri bir Excel hesap toplanmıştır. Her sayma oturum tarih boyunca, iyi koordine etmek ve canlı ve ölü hayvan sayısı kaydedildi. Deneyin başında, her bir kuyunun hayvanların toplam sayısı tespit edildi. (B) vahşi tip sağkalım eğrisi (N2) hayvanlar 20 büyüdü ° C ve 25 ° C (C) ömrü etkileyecek mutasyonları taşıyan suşlarının sağkalım eğrileri. Her dört suşları 20 ° C'de paralel olarak ölçüldü (D) Mirtazepine tedavi N2 hayvanlar doz yanıt eğrisi. Ortalama ömrü Mirtazepine konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Hata çubukları başına 8 kuyu durum SEM göstermektedir. 5. Malzemeler. M9 tampon, 1000 mL <ul><li> 6 g Na 2 HPO 4 </li><li> 3 g KH 2 PO 4 </li><li> 5 g NaCl </li><li> 0,25 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 1000 mL deiyonize su ekleyin </li><li> Otoklav </li></ul> Potassiumphosphate tampon pH 6.0, 1000 mL <ul><li> 136 g KH 2 PO 4 </li><li> 900 mL deiyonize su ekleyin </li><li> 5M KOH ile pH 6,0 'a ayarlayın. </li><li> 1000 mL deiyonize su ekleyin </li><li> Otoklav </li></ul> Trace metal çözümü <ul><li> 1,86 g Na 2 EDTA </li><li> 0.69 g FeSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0.29 g ZnSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0.016 g CuSO 4 </li><li> 1000 ml su deiyonize </li><li> Otoklav ve karanlıkta saklayın. </li></ul> S-bazal orta, 1000 mL <ul><li> 5.9 g NaCl </li><li> 50 ml 1M potasyum fosfat, pH 6.0 </li><li> 1000 ml su deiyonize </li><li> Otoklav </li><li> Sonra, 5 mg / ml 'kolesterol (Et-OH çözünmüş) 1 ml eklemek çözüm soğumasını bekleyin. </li></ul> Potasyum sitrat 1M, 1000 mL <ul><li> 268,8 g tripotasyum sitrat </li><li> 26.3 sitrik asit monohidrat </li><li> 900 mL deiyonize su ekleyin </li><li> 5M KOH ile pH 6,0 'a ayarlayın. </li><li> 1000 mL deiyonize su ekleyin </li><li> Otoklav </li></ul> S-tam orta, 1000 mL <ul><li> 977 ml S-bazal </li><li> 10 ml 1M potasyum sitrat pH 6 (steril) </li><li> 10 ml Trace metaller çözüm (steril) </li><li> 3 ml 1M CaCl 2 (steril) </li><li> 3 mL 1M MgSO 4 (steril) </li></ul> NGM agar <ul><li> 3.0g NaCl </li><li> 2.5g pepton(Kazein gelen, pankreas sindirimi) </li><li> 17g Agar </li><li> 975 mL deiyonize su ve karıştırma çubuğu ekle </li><li> Otoklav </li><li> - - 55 soğumasını otoklav sonrası ° C ve aşağıdaki bileşenleri ekleyin: <ul><li> 0.5 mL 1M CaCl 2 (steril) </li><li> 1 mL etanol içinde 5 mg / ml Kolesterol </li><li> 1 ml 1M MgSO 4 (steril) </li><li> 25 ml Potassiumphosphate tamponu, pH 6.0 (steril) </li></ul></li></ul> TB, 1000 mL <ul><li> 12g Bacto Tripton </li><li> 24 gr Maya Özü </li><li> 4 mL gliserol </li><li> 900 mL deiyonize su ekleyin </li><li> Otoklav </li><li> - - 55 soğumasını otoklav sonrası ° C ve aşağıdaki bileşen eklemek: <ul><li> 100 mL 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 </li></ul></li></ul> 0.6 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR, sigma kedi # F0503), 1000 mL <ul><li> 100 mg FUDR </li><li> Çözülür S-tam steril 670 ml, 10 ml veya 45 ml alikotları olun. </li><li> -20 ° C'de muhafaza </li></ul> 100 mg / ml Carbenicillin, 10 ml <ul><li> 1 g Carbenicillin </li><li> 10 ml steril deiyonize su </li><li> Steril süzüntü ve kısım </li><li> -20 ° C'de muhafaza </li><li> Son bir 50 mg / ml konsantrasyonda </li></ul> 250ug / ml Amfoterisin B, 4 mL <ul><li> 1mg Amfoterisin B </li><li> 4 mL Et-OH </li><li> -20 ° C'de muhafaza </li><li> Son bir 0.1 mg / ml konsantrasyonda </li></ul>

<ol><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+life-span+of+age-1+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+and+lower+Gompertz+rate+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging.</a> Science. 249, 908-912 (1990).</li>
<li>Kenyon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genetics of ageing.</a> Nature. 464, 504-512 (2010).</li>
<li>Finch, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The genetics of aging.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).</li>
<li>Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blueberry+polyphenols+increase+lifespan+and+thermotolerance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 5, 59-68 (2006).</li>
<li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticonvulsant+medications+extend+worm+life-span%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Anticonvulsant medications extend worm life-span.</a> Science. 307, 258-262 (2005).</li>
<li>McColl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetic+analysis+of+lithium-induced+delayed+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).</li>
<li>Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antidepressant+that+extends+lifespan+in+adult+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 553-556 (2007).</li>
<li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+can+confer+stress+tolerance+and+lifespan+extension+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans.</a> Biogerontology. 9, 309-316 (2008).</li>
<li>Wood, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuin+activators+mimic+caloric+restriction+and+delay+ageing+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans.</a> Nature. 430, 686-689 (2004).</li>
<li>Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproic+acid+extends+Caenorhabditis+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 7, 305-317 (2008).</li>
<li>Onken, B., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+induces+a+dietary+restriction-like+state+and+the+oxidative+stress+response+to+extend+C.+elegans+Healthspan+via+AMPK%2C+LKB1%2C+and+SKN-1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1.</a> PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+increases+stress+resistance+and+extends+life+span+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%29%22%5BJournal%5D)">Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).</li>
<li>Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+extension+in+Drosophila+by+feeding+a+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Life extension in Drosophila by feeding a drug.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).</li>
<li>Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamotrigine+extends+lifespan+but+compromises+health+span+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster.</a> Biogerontology. 11, 45-52 (2010).</li>
<li>Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+life-span+with+superoxide+dismutase%2Fcatalase+mimetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics.</a> Science. 289, 1567-1569 (2000).</li>
<li>Benedetti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+that+confer+thermal+stress+resistance+and+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan.</a> Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).</li>
<li>Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+MPP%2B+model+of+Parkinson%27s+disease+for+high-throughput+drug+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22Neurodegener+Dis%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson's disease for high-throughput drug screenings.</a> Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).</li>
<li>Kwok, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).</li>
<li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+function+in+novel+targets%3A+C.+elegans+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).</li>
<li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli%3A+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li>
</ol>

Sunulan protokol 96 microtiter plakalar C.elegans ömrü ölçümü sağlar. Temsilcisi sonuçlarında görüldüğü gibi bölümünde güvenilir bir önceki bulgularla çoğaltır ve kantitatif bilgi sağlar. Bu testte başarılı C.elegans ömrü üzerindeki etkileri için 89.000 moleküller üzerinde gösterildi. Ilaç-tarama amacı için, ömrü 96 mikrotiter plate formatında ölçüm klasik katı ortam tahlil üzerinde birçok avantajı vardır. Bu medya hazırlık, kuluçka alanı miktarı ve gerekli ilaç miktarı için gerekli emek azaltır. 96-iyi bir format ve yüksek kapasiteli gösterimleri için tüm testinin mikroskopi kurulum otomasyonu izin verir. Testin geliştirilmesi sırasında her değişken ve kombinasyonları için birden çok değer bunların C.elegans ömrü üzerindeki etkileri için test edildi. Bu testler için 3 ila 10 arasında değişen farklı OP50 konsantrasyon mg / ml (3, 4, 6, 8, 10 mg / ml), solucanlar de ortalama 7 ila 45 (7, 10, 15, 22, 45 arasında değişen farklı sayıda solucanlar / iyi), 40 de ortalama 150 mcL (40, 60, 80, 100, 120, 150 mcL) ve tampon kompozisyonunda değişiklikler arasında değişen farklı bir kültürü hacimleri. Girersek Carbenicillin dirençli OP50 konsantrasyonlarda Carbenicillin ne Amfoterisin B ne belirtilen C.elegans ömrü etkileyecek bulundu. Plakaları sürekli nazik sallayarak C.elegans sıvı kültüründe genellikle tavsiye edilir, bu testte kullanılan küçük miktarlar için vazgeçilebilir bulundu. Büyük kuyu microtiter plakalar kullanılacak, Nazik sallayarak ancak gereklidir. Değerler Bu protokol, farklı koşullarda test edilen istatistiksel karşılaştırma dayalı olarak dikkatli bir şekilde seçilmiştir. Bu testin en şaşırtıcı özelliği muhtemelen C.elegans bandı ile mühürlenir 96 kuyucuğu tutulabilir bir gerçektir. Yan yana karşılaştırmalar, plastik mühürleyen ile mühürlü plakalar, ya da hava değişimi izin Avcılar ile mühürlü plakalar, kaplanmadan plakalar kültür hayvanların ömrü içinde herhangi bir fark ortaya koymamıştır. Her üç koşul, L1, 65 saat içinde gravid yetişkin hayvanların çok homojen geliştirilen ve çok karşılaştırılabilir ömürlü gösterdi. NGM paralel olarak yetiştirilen hayvanlar biraz daha hızlı gelişti, ancak bu fark, bir mühürleyen varlığı veya yokluğu bağımsız oldu. Sunulan protokol canlı bakteri dayalı, ancak ölü bakteriler için adapte edilebilir. Ancak, bir sıvı tayininde bir tek hayatta kalan bakteriler hızla çoğalmaya ve kültür yeniden doldurmak. Bizim ellerde, sıvı kültürü için kullanılabilir olması ölçüde bakterileri öldürmek için tek güvenilir yolu, gama radyasyon ile bakteri uzun süreli tedavi. Ömrü deneyi planlama göz önünde bulundurulması gereken önemli bir nokta tespiti güçtür. Etkisinin büyüklüğüne bağlı olarak, faiz ilacın etkisi çok kuyularda test edilmelidir. Tipik bir tahlil 4 ilaç ile tedavi edilen ve 4 kontrol kuyuları, karşılık gelen yaklaşık 40-50 hayvanların her deneylerde% 95 daha fazla bir ömrü içinde% 30 artış tespit etmek için yeterli olacaktır. Olguların sadece% 60% 14 artış tespit edilir ve bu nedenle daha fazla çoğaltmak kuyu gerektirir. Bu testte tarafından oluşturulan ömrü veri zenginlik, deney geliştirmek veya özel parametrik Gompertz modelleri 1 zorlanma olabilir . Bu Gompertz modelleri algılama gücünü belirlemek ve büyük ölçekli ekranlar için yanlış pozitif ve negatiflerin sayısını tahmin etmek için yararlı. Biz kör deneylerde bu modellerin öngörüleri doğrulanmış ve büyük ekranlarda yanlış negatif numaraları (yayınlanmamış) tahmin etmek için onları kullandı. Özetle, biz sunulan tahlil C.elegans, ömrünü uzatmak ve altında yatan mekanizmaları incelemek için küçük moleküller tanımlamak için büyük bir kullanım olacağını tahmin ediyoruz .

A correction to the article Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates was made.

Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Calbiochem</td><td>cat# 171375</td><td>Fungizone olarak da adlandırılır</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat# F0503</td><td>FUDR ısı ile inaktive olur, soğuk suda çözdürün</td></tr><tr><td>Mianserin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2525-250MG</td><td>50&amp;#x03BC;M final konsantrasyonda pozitif kontrol olarak kullanın</td></tr><tr><td>Cyproheptadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat#C6022-MG</td><td>10 &amp;#x03BC;M final konsantrasyonda alternatif pozitif kontrol</td></tr><tr><td>Sızdırmazlık Bandı</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 236370</td><td>Polyester, steril değil</td></tr><tr><td>96 kuyucuklu plaka</td><td>Falcon BD</td><td>cat# 351172</td><td>İşlem görmemiş, şeffaf, steril tekli paketlenmiş, polistiren</td></tr><tr><td>Nunclon erlen</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 178883</td><td>büyük hacimler için kullanılır</td></tr></tbody></table>

Ölçme caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter tabaklar Ömrü

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Ömrü birkaç genetik yollar tarafından düzenlenen bir biyolojik süreçtir. Yaşlanma biyolojisi araştırmak için bir strateji hayvanları çalışma olduğunu yaşa düzenleyici yolların bileşenleri liman mutasyonlar. Eğer bu mutasyonlar karıştırmayı yaş düzenleyici yolun fonksiyonu ve bu nedenle tüm organizmanın ömrü değiştirmez, onlar önemli mekanistik anlayışlar 1-3 sağlar. Ömrü düzenlenmesi araştırmak için başka bir strateji karıştırmayı yaşa düzenleyici yollarda küçük moleküller kullanmaktır. Bugüne kadar bir dizi, moleküllerin çeşitli model organizmalarda ömrü uzatmak için bilinen ve yaşlanma 4-16 biyolojisi okumak için bir araç olarak kullanılır. Tespit moleküllerinin sayısı şimdiye kadar yaşlanma biyolojisi okumak için kullanılabilir genetik &quot;araç seti&quot; ile karşılaştırıldığında küçük. Caenorhabditis elegans mükemmel genetik ve üç hafta gibi kısa ömrü nedeniyle yaşlanma çalışma prensibi modelleri biridir. Daha yakın zamanlarda, C.elegans, çünkü onun küçük boyutu ve microtiter plakalar büyümeye yeteneğini fenotip bazlı ilaç ekranlar 5,7,16-20 için bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır . Burada 96 microtiter plakalar C.elegans ömrünü ölçmek için bir test sunuyoruz. Testin geliştirilen ve C.elegans ömrü 7 uzatmak molekülleri için büyük kütüphaneler ekrana başarıyla kullanılmıştır. Birden fazla testleri testinin güvenilirliği değerlendirildi: Önce, farklı sıcaklıklarda yetiştirilen vahşi tip hayvanların ömrünü ölçerek, ikinci, değişen yaşam süresini mutantlar ömrü ölçerek, üçüncü, farklı konsantrasyonlarda yanıt olarak ömrü değişiklikleri ölçerek antidepresan Mirtazepine. Mirtazepine daha önce C.elegans 7 ömrünü uzatmak için gösterilmiştir . Bu testlerin sonuçları, testin diğer testleri önceki bulguları çoğaltmak mümkün ve kantitatif olduğunu göstermektedir. Mikrotiter biçimi de bu ömrü testi otomatik sıvı taşıma sistemleri ile uyumlu hale getirir ve otomatik platformları entegrasyon sağlar.

Bu protokolü biz ölçmek için bir yöntem mevcut.<em&gt; Caenorhabditis elegans</em96 microtiter plakalar&gt; ömrü.

Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Yaşam süresi, birçok genetik yolak tarafından düzenlenen biyolojik bir süreçtir. Yaşlanma biyolojisini incelemeye yönelik stratejilerden biri, ... taşıyan hayvanları çalışmaktır.

Bu prosedürün genel amacı, ilgili ilaçlarla tedavi edilen C. elegans solucanlarının yaşam süresini ölçmektir. Bu işlem, öncelikle solucanları beslemek için kullanılan bir bakteri suşu olan OP 50'nin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, yaşları senkronize edilmiş bir solucan popülasyonu oluşturulur ve besleme bakterisi OP 50 ile birlikte 96 kuyucuklu plakalara ekilir.Sonraki iki gün boyunca solucanlar L4 larva evresine kadar büyür ve üremeyi önlemek için FUDR ilacı eklenir. Ertesi gün solucanlar yetişkinliğe ulaşır ve ilgili ilaçlar tekil kuyucuklara eklenir. Bu noktadan itibaren, tüm solucanlar ölene kadar her iki veya üç günde bir canlı ve ölü solucan sayısı belirlenir.Gözlem, ters mikroskop kullanılarak yapılır ve her oturumda ölü ve canlı solucanların sayısı kaydedilir. Merhaba, ben Greg Solis. Scripps Research Institute, Kimyasal Fizyoloji Bölümü'ndeki Petro Laboratuvarı'ndayım.Bugün size solucanların nasıl senkronize edileceğini ve 96 kuyucuklu mikrotitrasyon plakalarına nasıl dağıtılacağını göstereceğim. Bu tekniğin mevcut yöntemlerinize göre temel avantajı, C. elegans'ın yaşam süresini uzatan moleküllerin hızlı bir şekilde tanımlanmasına olanak tanımasıdır. Öyleyse başlayalım.C. elegans için besleme bakterilerini hazırlamak amacıyla, eksi yedinci günde, mililitre başına 100 µg kanamisin ve 0,1 µg spektinomisin içeren 5 mL TB'yi tek bir OP50 kolonisi ile inoküle ederek başlayın; 37 °C'de bakteri çalkalayıcıda gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah erkenden, gece boyu büyütülen OP50 kültürünü mililitre başına 50 µg ampisilin içeren 300 mL TB içerisinde seyreltin. Kültürü, doygunluğa ulaşana kadar 37 °C'de bakteri çalkalayıcıda 8 ila 12 saat boyunca inkübe edin. Kültürün 14 saatten daha uzun süre büyümesine izin vermeyin.OP 50'i önceden tartılmış steril bir santrifüj tüpüne aktarın. Masaüstü santrifüjde 10 dakika boyunca 3.500 RPM veya 2.200 ×g hızında santrifüj ederek OP 50'yi çöktürün. Süpernatantı uzaklaştırın, OP 50 peletini steril su ile yeniden süspande edin ve santrifüjle tekrar çöktürün. Bu yıkama işlemini ikinci kez tekrarlayın.Dikkatlice yıkayın ve kalan tüm suyu tamamen uzaklaştırın. Pellet içeren santrifüj tüpünü tartın ve pelletin ağırlığını belirlemek için boş santrifüj tüpünün ağırlığını çıkarın. Ardından, pelleti 100 mg/mL konsantrasyona ulaşana kadar S Complete içerisinde tamamen yeniden süspande edin.Hiç topak kalmamalıdır. Millilitre başına 100 miligram OP 50 konsantrasyonu, mililitre başına 2 × 10¹⁰ bakteriye karşılık gelmelidir. Optik yoğunluk ile mililitre başına bakteri sayısı arasındaki ilişki biliniyorsa, mililitre başına bakteri sayısını belirlemek için fotospektrometre kullanın.Gerekirse, OP 50 besleme solüsyonunun konsantrasyonunu mililitrede iki x 10¹⁰ bakteri olacak şekilde ayarlayın. Son olarak, yaş senkronize bir solucan popülasyonu oluşturmak için solucan kültüründe kullanılana kadar OP 50 solüsyonunu 4 °C'de saklayın. Eksi altıncı günün geç öğleden sonrasında, solucan popülasyonunun ağırlıklı olarak aç L1 larvalarından oluştuğu, 5 ila 10 günlük bir NGM plakası ile işleme başlayın.Metal bir spatülü bunsen beki üzerinde kısa süreli ısıtarak sterilize edin. Soğumaya bırakın. Ardından, aç bırakılmış solucanların bulunduğu plakadan agar parçaları kesmek için soğumuş spatülü kullanın.Bu parçalardan birkaçını, OP 50 ekilmiş taze 10 santimetre NGM plakasına aktarın. Solucan popülasyonunun çoğunluğu yaşlı yetişkinlerden oluşana kadar solucanları yaklaşık 65 saat boyunca 20 degrees Celsius'ta inkübe edin. Aç bırakılmış L1 hayvanlarının yaşlı yetişkinlere büyüme süresi suştan suşa farklılık gösterebilir.İnkübasyondan sonra, solucanları 10 santimetrelik plakadan beş ila 10 mililitre steril su ile yıkayarak toplayın. Solucanlı su çözeltisini 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Solucanları, bir masaüstü santrifüjde 1.200 RPM veya 280 ×g hızında iki dakika santrifüj ederek yıkayın. Üst fazı atın ve 10 mililitre su ekleyin.Yıkama adımını tekrarlayın, SUP üst fazını uzaklaştırın ve beş mililitre taze hazırlanmış çamaşır suyu ekleyin. Sodyum hidroksit çözeltisini, solucanlar parçalanana kadar oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Her dakika nazikçe vortekslemeye dikkat edin.Tüm yetişkinler çözünür çözünmez reaksiyonun ilerlemesini stereomikroskop altında izleyin. Reaksiyonu nötralize etmek için beş mililitre M nine tamponu ekleyin. Yumurtaları, 2.500 RPM veya 1.100 ×g hızda iki dakika boyunca santrifüj ederek 10 mililitre M nine tamponu ile üç kez yıkayın. Ardından yumurtaları, 2.500 RPM veya 1.100 ×g hızda iki dakika boyunca santrifüj ederek 10 mililitre S complete ile bir kez yıkayın. Süpernatantı uzaklaştırın.10 mililitre S complete ekleyin ve çözeltiyi yeni bir 50 mililitre konik tüpe aktarın. Final hacmi 40 mililitre olacak şekilde 30 mililitre S complete ekleyin. Ertesi gün öğle saatleri civarında hayvan plaklarına ekim yapmak için tüpü oda sıcaklığında, bir rotatör veya benzeri bir cihaz üzerinde gece boyunca hafifçe sallayın.Bir diseksiyon mikroskobu altında, solucanların gece boyunca çıkıp çıkmadığını kontrol edin. 10 µL'lik damlalardaki solucan sayısını sayarak S complete solüsyonundaki solucan konsantrasyonunu belirleyin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak her örnek için en az 10 damlayı sayın.Resus.Solucanları mililitre başına 80 ila 100 solucan konsantrasyonunda süspande edin. S tam besiyerine, nihai konsantrasyonu 50 micrograms per milliliter olacak şekilde karbenisilin ve nihai konsantrasyonu 0.1 micrograms per milliliter olacak şekilde amfoterisin B ekleyin. Bir çalkalayıcıda çalkalayın.Daha büyük miktarlarda solucan hazırlanacaksa, filtre kapaklı 600 mililitrelik konik flask kullanın. Saat 14:30'da, birinci bölümde hazırlanan OP 50'yi mililitre başına altı miligram nihai konsantrasyona gelecek şekilde ekleyin. OP 50'yi dört santigrat dereceye geri getirin. Solucan OP 50 çözeltisinden 120 mikrolitreyi, şeffaf tabanlı 96 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa aktarın.Pipetleme sırasında solucanların ve süspansiyonun korunduğundan emin olun; kontaminasyonu ve buharlaşmayı önlemek için plakayı bir bant kapatıcı ile mühürleyin. Plakayı bir mikrotitre plaka çalkalayıcıda iki dakika boyunca çalkalayın ve hayvanlar L4 evresine ulaşana kadar 20 °C'de iki gün inkübe edin. Ardından, hayvanları sterilize etmek için her kuyucuğa 30 µL 0.6 mM FUDR stok çözeltisi ekleyin.Bu adım, her kuyucuktaki nihai hacmi 150 µL'ye getirir ve OP 50'nin nihai konsantrasyonunu 6 mg/mL'den 5 mg/mL'ye düşürür. Plakayı bant sızdırmazlık araçları kullanarak mühürleyin ve bir mikroplaka çalkalayıcıda iki ila üç dakika boyunca çalkalayın. Eğer OP 50, eksi iki. günde saat 02:30'da eklendiyse, FUDR'nin öğleden önce eklenmesi önemlidir; plakaları ertesi gün saat 09:00'a kadar 20 °C'lik inkübatöre geri yerleştirin.Hayvanların çoğu erişkin olmalı ve birkaç yumurta içermelidir. Yaşam süresi üzerindeki etkisi test edilecek ilaçların her biri, istenen konsantrasyonda eklenir. İlaçlar DMSO içinde çözülüyorsa, DMSO'nun nihai konsantrasyonu %0,6'yı geçmemelidir; çünkü %0,6'dan yüksek DMSO konsantrasyonları, ilacın eklenmesinden sonra Caenorhabditis elegans yaşam süresini kısaltır.Plakaları bant kapatıcı ile mühürleyin ve bir mikrotitre plaka çalkalayıcıda iki ila üç dakika boyunca çalkalayın. Plakaları 20 °C'lik inkübatöre geri yerleştirin. İlaçların eklenmesi, özellikle su dışında bir çözücü kullanılıyorsa, plaka başına bazen birkaç hayvanın ölmesine neden olabilir.Ölü hayvanların kontrolü için ters mikroskop kullanın. Genellikle, 96 kuyucuklu plaka başına 10'dan az ölü hayvan bulunmalıdır. Kültüre taze oksijen girmesini sağlamak için plakaları iki gün boyunca 20 °C'lik inkübatöre geri yerleştirin. Sızdırmazlık folyosunu çıkarın.Bir dakika bekleyin ve plakayı tekrar mühürleyin. Plakayı bir mikroplaka sarsıcısında iki ila üç dakika boyunca sallayın; bu işlemi yetişkin yaşam süresinin beşinci gününde her hafta bir kez tekrarlayın, açlığı önlemek için 96 kuyucuğun her birine daha önce hazırlanan 100 mg/mL OP 50 çözeltisinden 5 µL ekleyin. Solucanların yaşam süresi, deneyin başlangıcından ölene kadar haftada üç kez hareketlerine göre değerlendirilir.Deneyin başlangıcında, sıfırıncı günde 96 kuyucuklu plakalardaki solucanları gözlemlemek için 2x veya 2,5x objektifli bir ters mikroskop kullanın. Her kuyucuktaki toplam solucan sayısını sayın.Analizdeki sensör kuyucuklarının 18'den fazla hayvan içermemesi gerekir; zira bu kuyucuklardaki hayvanlar yeterli OP 50'ye sahip olmayacak ve her sayım oturumunda diyet kısıtlaması etkileri gösterecektir. Canlı hayvanlar olarak hareket eden hayvanların tarihini ve sayısını kaydedin. Hareket, sıvı ortamda katı besiyerine göre çok daha kolaydır ve güçlü ışıklarla tetiklenebilir.Daha yüksek bir büyütme kullanmak, farinksin ucundakiler gibi çok hafif hareketleri tespit etmeye yardımcı olabilir. Bu tür hafif hareketler, genellikle çok yaşlı hayvanlarda gözlemlenen tek hareketlerdir. Plakaları 20 degrees Celsius inkübatöre geri yerleştirin.Tüm hayvanlar ölene kadar sayım oturumlarını her iki ila üç günde bir tekrarlayın. Bu, her kuyucuk için yaşam süresi verilerini kaydetmek amacıyla tasarlanmış bir Excel sayfasıdır. Plaka koordinatı, suş, ilacın konsantrasyonu ve deneyin başlangıcında sıfırıncı gündeki toplam canlı hayvan sayısı kaydedilir.Her kuyucuktaki çeşitli popülasyonların sağkalımını takip etmek için haftada üç kez tarihi, ayrıca yaşayan ve ölü hayvan sayısını kaydedin. Bu şekil, 20 °C ve 25 °C'de kaydedilen sea elegance yaşam süresi eğrilerinin sonuçlarını göstermektedir. Mikrotiter tabanlı yaşam süresi testi, yaşam süresindeki sıcaklığa bağlı değişiklikleri doğru bir şekilde yeniden üretmektedir.Benzer şekilde, burada gösterildiği üzere, mikrotiter plaka deneyi, wild type N iki hayvanlardan farklı yaşam sürelerine sahip olduğu bildirilen mutantlardaki yaşam süresi değişimlerini yeniden üretmektedir. Bu şekil, artan mirtazapine dozlarının C. elegans'ın ortalama yaşam süresini nasıl etkilediğini göstermektedir. Mikrotiter plaka deneyi ile elde edilen veriler, doz-yanıt ilişkilerini belirleyecek kadar kantitatiftir. Bu teknik uzmanlaşarak kullanıldığında, C. elegans'ın yaşam süresini uzatan molekülleri belirlemek amacıyla geniş kimyasal kütüphanelerin taranmasında kullanılabilir.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yazıda, UV öldürüldü bakteriyel gıda ile sağlam bir medya üzerinde muhafaza nematod ömrü ölçmek için genel bir protokol mevcut.

Ölçme Caenorhabditis elegans Katı Medya Ömrü

Bu videoda, C. elegans'ın ömrünü ölçmek için geleneksel, plaka tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. Örnek protokol, RNAi ile tedavi edilen solucanların ömrünü ölçer.

Yaşam Süresi Analizi: C. elegans Uzun Ömürlülüğün Ölçülmesi

Bir yumurta-in-solucan (EIW) testi yumurtlama davranışı ölçmek için yararlı bir yöntemdir. Yumurtlama değişiklikler model organizma bir davranış tepki...

Üzerinde Bakterilerin Etkilerinin Ölçme<em&gt; C. Elegans</emBir Yumurta Tutma Testi Kullanma&gt; Davranış

C. elegans, oksidatif stres direncinde yer alan sinyal iletim yolaklarını incelemek için çekici bir model organizmadır. Burada, 96 oyuklu plakada birkaç oksitleyici ajan kullanarak sıvı fazdaki C. elegans hayvanlarının oksidatif stres direncini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Oksidatif Stres Direnci Ölçüm<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 oyuklu mikrotiter plakalarında

Bir modeli hayvan, Caenorhabditis elegans, kimyasal toksisitesi değerlendirmek için temel bir protokol açıklanmıştır. Uygun ve risk değerlendirmesi çeşitli çevresel kirleticilerin gelince de eczacılık gelişimi için yararlı yöntemdir.

Büyüme ve üreme Caenorhabditis elegans kimyasallar etkisi ölçme

Burada biz hızla nematodunun büyüme medya agar, yüzlerce Caenorhhabditis elegans tutarlı numaraları iyi başına 96-şey kültür plakaların üretimi için basit bir protokol tanımlamak. Bu kültürler tüm canlıların fenotipik tarama için yararlıdır. Yanlısı uzun ömürlü efektleri için ekran kimyasallara bu kültürler kullanarak üzerinde odaklanabilir.

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Burada biz yineleme kümesi yöntemi, bir yaklaşım kantitatif ölçmek C. elegans ömrü/hayatta kalma ve healthspan yüksek üretilen iş ve sağlam bir şekilde böylece veri kalite ödün vermeden birçok koşullar tarama izin tanımlamak. Bu iletişim kuralı strateji detayları ve yineleme kümesi veri çözümlemesi için bir yazılım aracı sağlar.

Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü

Aşağıdaki protokol, proteostazdaki değişikliklerin bir değerlendirmesi olarak poliglutamin agregalarını ölçmek için solucan kültürleme, floresan görüntüleme ve otomatik görüntü işleme için yüksek verimli bir iş akışının geliştirilmesini ve optimizasyonunu açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi

Caenorhabditis elegans, sağlık süresini, ömrünü ve strese karşı dayanıklılığı araştırmak için sağlam ve düşük maliyetli yöntemlerle mükemmel bir model sistem olarak hizmet eder.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

Burada, C. elegans model organizmasını kullanarak embriyonik canlılığı ve üretilen toplam embriyo sayısını (kuluçka) belirlemek için genel bir yöntem sunuyoruz.

Caenorhabditis elegans'ta embriyonik canlılık ve yavru büyüklüğünün ölçülmesi

Bu protokol, sıvı kültürdeki bakterilerin klirensinin ölçülmesine dayalı olarak Caenorhabditis elegans besleme hızını ölçmek için bir testi tanımlar.

Bakteriyel Klerensi Ölçerek Caenorhabditis elegans'ta Gıda Alımının Ölçülmesi

Öğrenin, Caenorhabditis elegans ömrünü 96 kuyucuklu mikrotiter plakalarda ölçme yöntemini. Bu yüksek verimli tarama tekniği, uzun ömürlülüğü artırabilecek bileşikleri hızla belirlemeye yardımcı olur.

Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Daha fazla video keşfet