Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Bu prosedürün genel amacı, ilgili ilaçlarla tedavi edilen C. elegans solucanlarının yaşam süresini ölçmektir. Bu işlem, öncelikle solucanları beslemek için kullanılan bir bakteri suşu olan OP 50'nin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, yaşları senkronize edilmiş bir solucan popülasyonu oluşturulur ve besleme bakterisi OP 50 ile birlikte 96 kuyucuklu plakalara ekilir.

Sonraki iki gün boyunca solucanlar L4 larva evresine kadar büyür ve üremeyi önlemek için FUDR ilacı eklenir. Ertesi gün solucanlar yetişkinliğe ulaşır ve ilgili ilaçlar tekil kuyucuklara eklenir. Bu noktadan itibaren, tüm solucanlar ölene kadar her iki veya üç günde bir canlı ve ölü solucan sayısı belirlenir.

Gözlem, ters mikroskop kullanılarak yapılır ve her oturumda ölü ve canlı solucanların sayısı kaydedilir. Merhaba, ben Greg Solis. Scripps Research Institute, Kimyasal Fizyoloji Bölümü'ndeki Petro Laboratuvarı'ndayım.

Bugün size solucanların nasıl senkronize edileceğini ve 96 kuyucuklu mikrotitrasyon plakalarına nasıl dağıtılacağını göstereceğim. Bu tekniğin mevcut yöntemlerinize göre temel avantajı, C. elegans'ın yaşam süresini uzatan moleküllerin hızlı bir şekilde tanımlanmasına olanak tanımasıdır. Öyleyse başlayalım.

C. elegans için besleme bakterilerini hazırlamak amacıyla, eksi yedinci günde, mililitre başına 100 µg kanamisin ve 0,1 µg spektinomisin içeren 5 mL TB'yi tek bir OP50 kolonisi ile inoküle ederek başlayın; 37 °C'de bakteri çalkalayıcıda gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah erkenden, gece boyu büyütülen OP50 kültürünü mililitre başına 50 µg ampisilin içeren 300 mL TB içerisinde seyreltin. Kültürü, doygunluğa ulaşana kadar 37 °C'de bakteri çalkalayıcıda 8 ila 12 saat boyunca inkübe edin. Kültürün 14 saatten daha uzun süre büyümesine izin vermeyin.

OP 50'i önceden tartılmış steril bir santrifüj tüpüne aktarın. Masaüstü santrifüjde 10 dakika boyunca 3.500 RPM veya 2.200 ×g hızında santrifüj ederek OP 50'yi çöktürün. Süpernatantı uzaklaştırın, OP 50 peletini steril su ile yeniden süspande edin ve santrifüjle tekrar çöktürün. Bu yıkama işlemini ikinci kez tekrarlayın.

Dikkatlice yıkayın ve kalan tüm suyu tamamen uzaklaştırın. Pellet içeren santrifüj tüpünü tartın ve pelletin ağırlığını belirlemek için boş santrifüj tüpünün ağırlığını çıkarın. Ardından, pelleti 100 mg/mL konsantrasyona ulaşana kadar S Complete içerisinde tamamen yeniden süspande edin.

Hiç topak kalmamalıdır. Millilitre başına 100 miligram OP 50 konsantrasyonu, mililitre başına 2 × 10¹⁰ bakteriye karşılık gelmelidir. Optik yoğunluk ile mililitre başına bakteri sayısı arasındaki ilişki biliniyorsa, mililitre başına bakteri sayısını belirlemek için fotospektrometre kullanın.

Gerekirse, OP 50 besleme solüsyonunun konsantrasyonunu mililitrede iki x 10¹⁰ bakteri olacak şekilde ayarlayın. Son olarak, yaş senkronize bir solucan popülasyonu oluşturmak için solucan kültüründe kullanılana kadar OP 50 solüsyonunu 4 °C'de saklayın. Eksi altıncı günün geç öğleden sonrasında, solucan popülasyonunun ağırlıklı olarak aç L1 larvalarından oluştuğu, 5 ila 10 günlük bir NGM plakası ile işleme başlayın.

Metal bir spatülü bunsen beki üzerinde kısa süreli ısıtarak sterilize edin. Soğumaya bırakın. Ardından, aç bırakılmış solucanların bulunduğu plakadan agar parçaları kesmek için soğumuş spatülü kullanın.

Bu parçalardan birkaçını, OP 50 ekilmiş taze 10 santimetre NGM plakasına aktarın. Solucan popülasyonunun çoğunluğu yaşlı yetişkinlerden oluşana kadar solucanları yaklaşık 65 saat boyunca 20 degrees Celsius'ta inkübe edin. Aç bırakılmış L1 hayvanlarının yaşlı yetişkinlere büyüme süresi suştan suşa farklılık gösterebilir.

İnkübasyondan sonra, solucanları 10 santimetrelik plakadan beş ila 10 mililitre steril su ile yıkayarak toplayın. Solucanlı su çözeltisini 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Solucanları, bir masaüstü santrifüjde 1.200 RPM veya 280 ×g hızında iki dakika santrifüj ederek yıkayın. Üst fazı atın ve 10 mililitre su ekleyin.

Yıkama adımını tekrarlayın, SUP üst fazını uzaklaştırın ve beş mililitre taze hazırlanmış çamaşır suyu ekleyin. Sodyum hidroksit çözeltisini, solucanlar parçalanana kadar oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Her dakika nazikçe vortekslemeye dikkat edin.

Tüm yetişkinler çözünür çözünmez reaksiyonun ilerlemesini stereomikroskop altında izleyin. Reaksiyonu nötralize etmek için beş mililitre M nine tamponu ekleyin. Yumurtaları, 2.500 RPM veya 1.100 ×g hızda iki dakika boyunca santrifüj ederek 10 mililitre M nine tamponu ile üç kez yıkayın. Ardından yumurtaları, 2.500 RPM veya 1.100 ×g hızda iki dakika boyunca santrifüj ederek 10 mililitre S complete ile bir kez yıkayın. Süpernatantı uzaklaştırın.

10 mililitre S complete ekleyin ve çözeltiyi yeni bir 50 mililitre konik tüpe aktarın. Final hacmi 40 mililitre olacak şekilde 30 mililitre S complete ekleyin. Ertesi gün öğle saatleri civarında hayvan plaklarına ekim yapmak için tüpü oda sıcaklığında, bir rotatör veya benzeri bir cihaz üzerinde gece boyunca hafifçe sallayın.

Bir diseksiyon mikroskobu altında, solucanların gece boyunca çıkıp çıkmadığını kontrol edin. 10 µL'lik damlalardaki solucan sayısını sayarak S complete solüsyonundaki solucan konsantrasyonunu belirleyin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak her örnek için en az 10 damlayı sayın.Resus.

Solucanları mililitre başına 80 ila 100 solucan konsantrasyonunda süspande edin. S tam besiyerine, nihai konsantrasyonu 50 micrograms per milliliter olacak şekilde karbenisilin ve nihai konsantrasyonu 0.1 micrograms per milliliter olacak şekilde amfoterisin B ekleyin. Bir çalkalayıcıda çalkalayın.

Daha büyük miktarlarda solucan hazırlanacaksa, filtre kapaklı 600 mililitrelik konik flask kullanın. Saat 14:30'da, birinci bölümde hazırlanan OP 50'yi mililitre başına altı miligram nihai konsantrasyona gelecek şekilde ekleyin. OP 50'yi dört santigrat dereceye geri getirin. Solucan OP 50 çözeltisinden 120 mikrolitreyi, şeffaf tabanlı 96 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa aktarın.

Pipetleme sırasında solucanların ve süspansiyonun korunduğundan emin olun; kontaminasyonu ve buharlaşmayı önlemek için plakayı bir bant kapatıcı ile mühürleyin. Plakayı bir mikrotitre plaka çalkalayıcıda iki dakika boyunca çalkalayın ve hayvanlar L4 evresine ulaşana kadar 20 °C'de iki gün inkübe edin. Ardından, hayvanları sterilize etmek için her kuyucuğa 30 µL 0.6 mM FUDR stok çözeltisi ekleyin.

Bu adım, her kuyucuktaki nihai hacmi 150 µL'ye getirir ve OP 50'nin nihai konsantrasyonunu 6 mg/mL'den 5 mg/mL'ye düşürür. Plakayı bant sızdırmazlık araçları kullanarak mühürleyin ve bir mikroplaka çalkalayıcıda iki ila üç dakika boyunca çalkalayın. Eğer OP 50, eksi iki. günde saat 02:30'da eklendiyse, FUDR'nin öğleden önce eklenmesi önemlidir; plakaları ertesi gün saat 09:00'a kadar 20 °C'lik inkübatöre geri yerleştirin.

Hayvanların çoğu erişkin olmalı ve birkaç yumurta içermelidir. Yaşam süresi üzerindeki etkisi test edilecek ilaçların her biri, istenen konsantrasyonda eklenir. İlaçlar DMSO içinde çözülüyorsa, DMSO'nun nihai konsantrasyonu %0,6'yı geçmemelidir; çünkü %0,6'dan yüksek DMSO konsantrasyonları, ilacın eklenmesinden sonra Caenorhabditis elegans yaşam süresini kısaltır.

Plakaları bant kapatıcı ile mühürleyin ve bir mikrotitre plaka çalkalayıcıda iki ila üç dakika boyunca çalkalayın. Plakaları 20 °C'lik inkübatöre geri yerleştirin. İlaçların eklenmesi, özellikle su dışında bir çözücü kullanılıyorsa, plaka başına bazen birkaç hayvanın ölmesine neden olabilir.

Ölü hayvanların kontrolü için ters mikroskop kullanın. Genellikle, 96 kuyucuklu plaka başına 10'dan az ölü hayvan bulunmalıdır. Kültüre taze oksijen girmesini sağlamak için plakaları iki gün boyunca 20 °C'lik inkübatöre geri yerleştirin. Sızdırmazlık folyosunu çıkarın.

Bir dakika bekleyin ve plakayı tekrar mühürleyin. Plakayı bir mikroplaka sarsıcısında iki ila üç dakika boyunca sallayın; bu işlemi yetişkin yaşam süresinin beşinci gününde her hafta bir kez tekrarlayın, açlığı önlemek için 96 kuyucuğun her birine daha önce hazırlanan 100 mg/mL OP 50 çözeltisinden 5 µL ekleyin. Solucanların yaşam süresi, deneyin başlangıcından ölene kadar haftada üç kez hareketlerine göre değerlendirilir.

Deneyin başlangıcında, sıfırıncı günde 96 kuyucuklu plakalardaki solucanları gözlemlemek için 2x veya 2,5x objektifli bir ters mikroskop kullanın. Her kuyucuktaki toplam solucan sayısını sayın.

Analizdeki sensör kuyucuklarının 18'den fazla hayvan içermemesi gerekir; zira bu kuyucuklardaki hayvanlar yeterli OP 50'ye sahip olmayacak ve her sayım oturumunda diyet kısıtlaması etkileri gösterecektir. Canlı hayvanlar olarak hareket eden hayvanların tarihini ve sayısını kaydedin. Hareket, sıvı ortamda katı besiyerine göre çok daha kolaydır ve güçlü ışıklarla tetiklenebilir.

Daha yüksek bir büyütme kullanmak, farinksin ucundakiler gibi çok hafif hareketleri tespit etmeye yardımcı olabilir. Bu tür hafif hareketler, genellikle çok yaşlı hayvanlarda gözlemlenen tek hareketlerdir. Plakaları 20 degrees Celsius inkübatöre geri yerleştirin.

Tüm hayvanlar ölene kadar sayım oturumlarını her iki ila üç günde bir tekrarlayın. Bu, her kuyucuk için yaşam süresi verilerini kaydetmek amacıyla tasarlanmış bir Excel sayfasıdır. Plaka koordinatı, suş, ilacın konsantrasyonu ve deneyin başlangıcında sıfırıncı gündeki toplam canlı hayvan sayısı kaydedilir.

Her kuyucuktaki çeşitli popülasyonların sağkalımını takip etmek için haftada üç kez tarihi, ayrıca yaşayan ve ölü hayvan sayısını kaydedin. Bu şekil, 20 °C ve 25 °C'de kaydedilen sea elegance yaşam süresi eğrilerinin sonuçlarını göstermektedir. Mikrotiter tabanlı yaşam süresi testi, yaşam süresindeki sıcaklığa bağlı değişiklikleri doğru bir şekilde yeniden üretmektedir.

Benzer şekilde, burada gösterildiği üzere, mikrotiter plaka deneyi, wild type N iki hayvanlardan farklı yaşam sürelerine sahip olduğu bildirilen mutantlardaki yaşam süresi değişimlerini yeniden üretmektedir. Bu şekil, artan mirtazapine dozlarının C. elegans'ın ortalama yaşam süresini nasıl etkilediğini göstermektedir. Mikrotiter plaka deneyi ile elde edilen veriler, doz-yanıt ilişkilerini belirleyecek kadar kantitatiftir. Bu teknik uzmanlaşarak kullanıldığında, C. elegans'ın yaşam süresini uzatan molekülleri belirlemek amacıyla geniş kimyasal kütüphanelerin taranmasında kullanılabilir.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.