Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen ilaçlarla tedavi edilen deniz Elgan solucanlarının ömrünü ölçmektir. Bu, önce solucanları beslemek için kullanılan bir bakteri türü olan OP 50'nin hazırlanmasıyla elde edilir. Daha sonra yaşla senkronize edilmiş bir solucan popülasyonu oluşturulur ve besleme bakterileri OP 50 ile birlikte 96 oyuklu plakaya tohumlanır.

Önümüzdeki iki gün boyunca, solucanlar L dört larva aşamasına kadar büyür ve üremeyi önlemek için FUDR ilacı eklenir. Ertesi gün, solucanlar yetişkinliğe ulaşır ve ilgilenilen ilaçlar bireysel kuyucuklara eklenir. Bu noktadan itibaren, tüm solucanlar ölene kadar her iki ila üç günde bir canlı ve ölü solucanların sayısı belirlenir.

Gözlem, ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak yapılır ve her seansta ölü ve canlı solucanların sayısı kaydedilir. Merhaba, ben Greg Solis. Scripps Araştırma Enstitüsü Kimyasal Fizyoloji Bölümü'ndeki Petro Laboratuvarı'ndayım.

Bugün size solucanları nasıl senkronize edeceğinizi ve bunları 96 duvar mikrotitre plakasına nasıl dağıtacağınızı göstereceğim. Bu tekniğin mevcut yöntemlerinize göre en büyük avantajı, kullanım ömrünü uzatan moleküllerin hızlı bir şekilde tanımlanmasına ve C zarafetine olanak sağlamasıdır. Öyleyse başlayalım.

Besleme bakterilerini C zarafetine hazırlamak için eksi yedinci günde, mililitre başına 100 mikrogram içeren beş mililitre TB ve persin ve mililitrede 0.1 mikrogram içeren beş mililitre TB ve tek bir OP 50 kolonisi ile terin B aşılayarak başlayın, ertesi sabah erken saatlerde bir bakteri çalkalayıcıda gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, 2000 yılında gece boyunca OP 51 kültürünü mililitre ampisilin başına 50 mikrogram içeren 300 mililitre TB'de seyreltin. Kültürü, doygunluğa ulaşılana kadar 37 santigrat derecede sekiz ila 12 saat boyunca bir bakteri çalkalayıcıda inkübe edin. Kültürün 14 saatten daha uzun büyümesine izin vermeyin.

OP 50'yi steril bir ön ağırlıklı santrifüj tüpüne aktarın OP 50'yi bir masa üstü santrifüjde 3, 500 RPM veya 2, 200 kez G'de 10 dakika santrifüjleyerek peletleyin. S süpernatanı atın, OP 50 peletini yeniden süspanse edin ve santrifüjleme ile su ve rep peletimizi yıldızlandırın. Bunu tekrarlayın, ikinciden sonra iki kez yıkayın.

Dikkatlice yıkayın ve kalan tüm suyu iyice çıkarın. Pelet içeren santrifüj tüpünü tartın ve peletin ağırlığını belirlemek için boş santrifüj tüpünün ağırlığını çıkarın. Daha sonra, peleti S Complete'te mililitre başına 100 miligramlık bir konsantrasyona kadar iyice yeniden süspanse edin.

Topak bırakılmamalıdır. Mililitre başına 100 miligram OP 50 konsantrasyonu, mililitre başına 10 ila 10 bakteriye iki kez karşılık gelmelidir. Optik yoğunluk ile mililitre başına bakteri sayısı arasındaki ilişki biliniyorsa, mililitre başına bakteri sayısını belirlemek için foto spektrometreyi kullanın.

Gerekirse, OP 50 besleme çözeltisinin konsantrasyonunu mililitrede 10 ila 10 bakteri olmak üzere iki kez ayarlayın. Son olarak, OP 50 çözeltisini, solucan kültürünün yaşa senkronize bir solucan popülasyonu oluşturması için kullanılana kadar dört santigrat derecede saklayın. Eksi altıncı günde öğleden sonra geç saatlerde, solucan popülasyonunun esas olarak aç L bir larvadan oluştuğu beş ila 10 günlük bir NGM plakası ile başlayın.

Metal bir spatulayı bir bunsen brülörü üzerinde kısa bir süre ısıtarak sterilize edin. Soğumaya bırakın. Ardından, açlıktan ölmek üzere olan solucanları içeren plakadan agar parçalarını kesmek için soğuk spatulayı kullanın.

Bu parçalardan birkaçını OP 50 ile tohumlanmış 10 santimetrelik yeni bir NGM plakasına aktarın. Solucanları, solucan popülasyonunun çoğunluğu mezar yetişkinlerinden oluşana kadar 20 santigrat derecede yaklaşık 65 saat kuluçkaya yatırın. Açlıktan ölmek üzere olan L one hayvanlarının mezar yetişkinlerine dönüşmesi için geçen süre, türden türe değişebilir.

Kuluçka işleminden sonra, solucanları 10 santimetrelik plakadan beş ila 10 mililitre steril su ile yıkayarak toplayın. Solucan suyu çözeltisini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Solucanları 1, 200 RPM veya 280 kez G'de bir masa üstü santrifüjde iki dakika santrifüjleyerek yıkayın

Yıkama adımını tekrarlayın, SUP natantını çıkarın ve beş mililitre taze hazırlanmış çamaşır suyu ekleyin. Sodyum hidroksit çözeltisi, solucanlar açılana kadar RT'de beş dakika inkübe edilir. Her dakika nazikçe girdap yaptığınızdan emin olun.

Tüm yetişkinler çözülür çözülmez diseksiyon mikroskobu altında reaksiyonun ilerlemesini izleyin. Reaksiyonu nötralize etmek için beş mililitre M dokuz tampon ekleyin. Yumurtaları 10 mililitre M dokuz tampon ile üç kez 2, 500 RPM veya 1, 100 kez G'de iki dakika santrifüjleyerek

10 mililitre S tamamlayın ve çözeltiyi 50 mililitrelik taze bir konik tüpe aktarın. 40 mililitrelik son hacme 30 mililitre S tam ekleyin. Ertesi gün öğlen saatlerinde hayvan plakalarını tohumlamak için tüpü gece boyunca oda sıcaklığında bir mutatör veya benzeri bir cihaz üzerinde hafifçe çalkalayın.

Bir diseksiyon kapsamı altında, solucanların gece boyunca yumurtadan çıkıp çıkmadığını kontrol edin. 10 mikrolitrelik damlalardaki solucan sayısını sayarak S tam çözeltisindeki solucan konsantrasyonunu belirleyin. Bir diseksiyon dürbünü kullanarak, her numune için en az 10 damla sayın. Resus.

Solucanları mililitre başına 80 ila 100 solucan konsantrasyonunda askıya alın. S tam ortamda, mililitre başına 50 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona karbenisilin ve mililitre başına 0.1 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona amfoterisin B ekleyin. Bir mutatör üzerinde sallayın.

Daha büyük miktarlarda solucan hazırlıyorsanız, filtre kapaklı 600 mililitrelik clon olmayan bir şişe kullanın Saat 14:30'da Birinci bölümde hazırlanan OP 50'yi mililitre başına altı miligramlık bir nihai konsantrasyona ekleyin. OP 50'yi dört santigrat dereceye geri döndürün. 120 mikrolitre solucan OP 50 solüsyonunu, şeffaf tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aktarın.

Pipetleme sırasında solucanları ve süspansiyonu tuttuğunuzdan emin olun, kontaminasyonu ve buharlaşmayı önlemek için plakayı bir bant kapatıcı kullanarak kapatın. Plakayı bir mikrotitre plaka çalkalayıcı üzerinde iki dakika çalkalayın ve hayvanlar L dört aşamasına ulaşana kadar 20 santigrat derecede iki gün boyunca inkübe edin. Hayvanları sterilize etmek için, her bir oyuğa 30 mikrolitre 0.6 milimolar FUDR stok çözeltisi ekleyin.

Bu adım, her bir oyuktaki nihai hacmi 150 mikrolitreye getirir ve OP 50'nin nihai konsantrasyonunu mililitre başına altı miligramdan mililitre başına beş miligrama düşürür. Plakayı bant kapatıcılar kullanarak kapatın ve bir mikrot plaka çalkalayıcı üzerinde iki ila üç dakika çalkalayın. OP 50, eksi ikinci günde iki 30'da eklendiyse, FUDR'nin öğleden önce eklenmesi önemlidir: plakaları ertesi gün saat 9: 00'a kadar 20 santigrat derece inkübatöre geri getirin.

Hayvanların çoğu mezar olmalı ve birkaç yumurta içermelidir. Her biri, yaşam süresi üzerindeki etkisi istenen konsantrasyonda test edilecek ilaçları ekler. İlaçlar DMSO'da çözülürse, DMSO'nun nihai konsantrasyonları% 0.6'yı geçmemelidir, çünkü DMSO% 0.6'dan daha yüksek DMSO konsantrasyonları% İlacın eklenmesinden sonra elgan ömrünü kısaltır.

Plakaları bant kapatıcı ile kapatın ve bir mikrotitre plakası üzerinde iki ila üç dakika çalkalayın. Çalkalayıcı, plakaları 20 santigrat derece inkübatöre geri koyun. İlaçların eklenmesi, özellikle su dışında bir çözücü kullanılıyorsa, bazen plaka başına birkaç hayvanı öldürebilir.

Ölü hayvanları kontrol etmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Genel olarak, 96 dünya plakası başına 10'dan az ölü hayvan olmalıdır Taze oksijenin kültüre girmesine izin vermek için plakaları iki gün boyunca 20 santigrat derece inkübatöre geri getirin. Kapatıcıyı çıkarın.

Bir dakika bekleyin ve plakayı tekrar kapatın. Plakayı mikrot daha sıkı bir plaka Çalkalayıcı üzerinde iki ila üç dakika çalkalayın, yetişkin ömrünün beşinci gününde haftada bir kez tekrarlayın, açlığı önlemek için 96 kuyucuğun her birine daha önce hazırlanan mililitre başına 100 miligram OP 50 çözeltisinden beş mikrolitre ekleyin. Solucanlar, deneyin başlangıcından ölene kadar haftada üç kez hareketlerine göre yaşam süreleri boyunca puanlanır.

96'daki solucanları gözlemlemek için iki x veya 2.5 x objektifli ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Deneyin başında sıfırıncı günde kuyu plakaları. Her kuyucuktaki toplam solucan sayısını sayın.

Analizden elde edilen 18'den fazla hayvanın bulunduğu sensör kuyularında hayvan olarak bu kuyularda yeterli OP 50 bulunmayacak ve her sayım seansında diyet kısıtlamasının etkileri görülecektir. Canlı hayvan olarak hareket eden hayvanların tarihini ve sayısını kaydedin. Hareket ve sıvı, katı ortamlara göre çok daha kolaydır ve güçlü ışıklar tarafından indüklenebilir.

Daha yüksek bir büyütmenin kullanılması, farenksin ucundakiler gibi çok ince hareketlerin tespit edilmesine yardımcı olabilir. Bu tür ince hareketler genellikle çok yaşlı hayvanlarda gözlemlenen tek harekettir. Plakaları 20 santigrat derece inkübatöre geri koyun.

Tüm hayvanlar ölene kadar sayma seanslarını her iki ila üç günde bir tekrarlayın. Bu, her kuyu için kullanım ömrü verilerini kaydetmek için bir Excel sayfasının tasarımıdır. Plaka suşundaki koordinat, ilacın ilaç konsantrasyonu ve sıfırıncı günde yaşayan toplam hayvan sayısı deneyin başında kaydedilir.

Her kuyucuktaki çeşitli popülasyonların hayatta kalmasını takip etmek için haftada üç kez canlı ve ölü hayvanların sayısını ve tarihini kaydedin. Bu şekil, deniz zarafetinin, ömrünün, 20 santigrat derece ve 25 santigrat derecede kaydedilen eğrilerin sonuçlarını göstermektedir. Mikrotitre bazlı kullanım ömrü testi, kullanım ömründeki sıcaklığa bağlı değişiklikleri doğru bir şekilde yeniden üretir.

Benzer şekilde, burada gösterildiği gibi, mikrotitre plaka testi, vahşi tip N iki hayvandan farklı yaşam sürelerine sahip olduğu bildirilen mutantların yaşam süresindeki değişiklikleri yeniden üretir. Bu şekil, artan mirtazapin dozlarının deniz zarafetinin ortalama ömrünü nasıl etkilediğini göstermektedir. Mikrotitre plaka tahlili ile elde edilen veriler, doz yanıt ilişkilerini belirlemek için yeterince niceldir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, ömrü uzatan ve zarafet gören moleküller için büyük kimyasal kütüphaneleri taramak için kullanılabilir.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.