Kalsiyum Göstergeleri ile yükleme Drosophila Sinir Terminalleri

Merhaba, adım Greg McLeod. Laboratuvarım, sinir uçlarındaki kalsiyum düzenlemesini ve bunun nörotransmisyon üzerindeki etkilerini incelemektedir. Bu çalışmaları Drosophila melanogaster üzerinde gerçekleştiriyoruz.

Meyve sineği, genetik esnekliği ve basit, erişilebilir sinir sistemi nedeniyle nörobilimciler için çekici bir modeldir. Bu sinir sisteminde, sinir uçlarındaki kalsiyum değişimlerini tespit etmek için genetik olarak kodlanmış floresan indikatörler mevcuttur. Ancak, bu indikatörlerin kalsiyuma karşı duyarlılığı sınırlıdır ve sıklıkla lineer olmayan bir yanıt sergilerler.

Sentetik indikatörler, sinir aktivitesiyle ilişkili hızlı kalsiyum değişimlerini ölçmek için daha uygundur. Oph larva canlı sinir terminallerine dekstrin konjuge sentetik kalsiyum indikatörlerinin yüklenmesi için bir tekniği göstereceğiz. Dekstrin konjugasyonu, kalsiyum indikatörlerinin mitokondri gibi organellerde hapsolmasını önlemeye yardımcı olur.

Yükleme tekniği, larva embriyolarına ve yetişkinlere eşit şekilde uygulanabilir. Bir larvayı, cam lam üzerindeki küçük bir sigara banyosunda diseke edeceğiz. Mavi diş mumu, cam yükleme yatağını destekleyecektir.

Kalabalık olmayan bir vialin yan tarafındaki star lava'dan rastgele bir üçüncüsünü alın. Larvayı soğutulmuş Schneider solüsyonunun birkaç damlası içine yerleştirin ve sırt orta hattı en üstte kalacak şekilde başından ve kuyruğundan iğneleyin. Kesmek için keskin bir mikro makas çifti kullanın.

Makasın alt bıçağının nüfuz edebileceği büyüklükte, tra ile burası arasına küçük bir insizyon yapın. Traia arasındaki dorsal orta hat boyunca kütikülü başa kadar kesin. Larvayı 180 derece döndürün ve insizyonu kuyruğa kadar uzatın.

Alt bıçağın viscera içerisine çok derin nüfuz etmemesine, sadece larva boyunca ilerlemesine dikkat etmek önemlidir; aksi takdirde incelenmek istenen kaslar ve sinirler zarar görecektir. Visceraların çoğu insizyon boyunca yukarı itilecektir; kuyruğa yakın olan bu kısımdaki trake hattını kesin ve alttaki trake boyunca baş kısmına kadar kesin. İşlemi diğer taraf için de tekrarlayın.

Keserek ayırarak ve banyodan çıkararak iç organların çoğunu uzaklaştırın. Makası bir kenara bırakıp ikinci bir penset almak için kısa bir ara verin. Kütikülün kesik kenarını tutun ve bir kenara sabitleyin.

Diğer taraf için işlemi tekrarlayın. Prosedürü tekrarlamak için başa doğru dört segment ilerleyin. Bu aşamada kalan tüm visceraları temizleyin. Segmentlerin hiçbirinde 7, 6, 13 veya 12 numaralı kaslara zarar verilmediğinden emin olun.

Herhangi bir hasar oluşmuşsa, başka bir larva diseke edin; çünkü bu hasar kaçınılmaz olarak, sonraki görüntülemeleri sorunlu hale getirecek genik kontraksiyonlara yol açar. Beyin hemisferleri, ventral gangliyon ve segment sinirleri şu adımlarda görünür hale gelecektir. Basınç kesim ucunu segment sinirine doğru bir cam FOP yatağına çekeceğiz ve sinirin açıkta kalan ucuna kalsiyum indikatörü uygulamak için plastik bir dolgu filamenti kullanacağız.

Ancak öncelikle, dolgu filamentini ve dolgu etkisini oluşturmak için dolgu filamentinin nasıl hazırlanacağını göstereceğiz. Sarı renkli bir kusurlu parçaya, plastik yumuşayıp şeffaflaşana kadar uzunluğunun yarısına kadar yavaşça ısıtma işlemi uygulanacak olan iki aşamalı çekme tekniği uygulanacaktır. Bu noktada ısıtmayı durdurun ve ince bir şerit oluşturmak için ucu hemen yukarı doğru çekin.

Bu, yaklaşık yarım milimetre çapındadır. Filamenti 50 milimetre uzunluğunda kesin. Şimdi filamenti bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin ve kesik kısmı sabitleyin.

Bir ucunu başparmak tırnağıyla tutun ve diğer ucunu çekerek bir santimetre uzunluğunda ince bir filament oluşturun. Ezilmesini önlemek için bu kısım, doku kağıdı üzerinde yeni bir jiletle kesilmeli ve dolgu hazırlanacak şekilde uçları sivriltilmelidir. Herhangi bir filamenti olmayan, ince duvarlı bir kılcal boru ile başlayın.

Bir pet çekici kullanarak ucu ince ve konik bir nokta haline getirin. Hazırladığınız bu parçayı bir diseksiyon mikroskobuna götürün ve konik kısmı bir parça zımpara kağıdı ile çizin. Çizilen kısmın distalindeki ucu, ucun düzgün bir şekilde kırılmasını sağlayacak şekilde çizik tarafının tersine doğru itin.

Kırığın iç çapı, dış çaptan daha büyük olmalıdır. Dolgu filamentinin sonunda, kırılan kısmı camın içine doğru ısı ile daraltmak için mikro forg kullanın ve iç çap yaklaşık 12 µm değerine ulaşana kadar bu işlemi sürdürün. Kırık ucun küt kısmını düzeltmek için Buns burner kullanın.

Sıkıca oturan bir Celtic tüpü, sert polilin boru ve bir şırınga kullanılarak efektin küt ucuna negatif basınç uygulanabilir. Aynı tüp ve şırınga, kalsiyum indikatörünü filamanın içerisine çekmek ve boşaltmak için kullanılacaktır. Kalsiyum indikatörü, distile su içinde beş milimolar konsantrasyona gelecek şekilde çözülmelidir.

Bu çözeltiyi beş mikrolitrelik alikotlara bölün. Bunları dört dereceye kadar ısıtın. Gerektiğinde kullanana kadar donmamaları için bu alikotları dondurmayın.

Şimdi, filamente bir ila iki santimetre kalsiyum indikatörü çekin; böylece bu yükleme tekniğinin en kritik adımına geçmeye hazırsınız. Makasınızı ve pensetinizi alarak, en anterior segment sinirlerini ventral gangliyonlara yakın bir noktadan tek tek kesin. Ventral ventten gelen en AOR segment sinir kitlesini kesin.

Tüm kalıntıları kesin. Dolgu filamentini, ucu larvanın merkezine gelecek şekilde dental mum rampasına yerleştirin. Scholastic tüpü ve şırıngayı takın.

Bir miktar Schneider çözeltisini mükemmel bir uca çekin. Şimdi sinirin ucunu mükemmelce ucun içine yerleştirin. Yerleşim sıkı olmalı ancak ucu sıkıştırmamalıdır.

Schneiders'ların korumaya daha fazla girişini engellemelidir. Genel olarak skolastik tüpü ve şırıngayı çıkarın ve F filamentine bağlayın. Statik elektriği boşaltmak için filamentin yan kısmını banyodaki Schneiders'lara dokundurun ve filaman sakız etkisini, sinir kesisine gerçekten dokunmadan, 50 mikron mesafede hemen yerleştirin.

Kalsiyum indikatörünü, Schneider çözeltisinin hacmini etkili olarak yaklaşık üçte bir oranında artıracak şekilde yavaşça ekleyin. Bu işlemle, final kalsiyum indikatörü konsantrasyonu 2 mM'in hemen altında olacaktır; hazırlığı karanlık, nemli bir konumda ve oda sıcaklığında yaklaşık 40 dakika bekletin. Burada iki önemli noktaya değinmek istiyorum.

Öncelikle, kalsiyum indikatörünü seyreltmek için uç kısımda bir fizyolojik solüsyon bulunmalıdır. Çünkü kalsiyum indikatörü yalnızca su içinde çözünmüştür. Akson sızdırmazlığı (axon sealing) kalsiyuma bağımlı bir süreç olduğundan ve sinir uçlarının sağlığını korumak için temel olduğundan, fizyolojik solüsyon birkaç milimolar konsantrasyonda kalsiyum içermelidir.

İkinci nokta, sinirlerin kesilmesi ile sinirin kesilen ucuna boyanın uygulanması arasında beş dakikadan fazla süre geçmemesi gerektiğidir. Beş dakika sonra, aksonların uç kısımları 10, 000 molekül ağırlığındaki dekstrin konjuge kalsiyum indikatörlerini dışlayacaktır. Bu zaman sınırına uymak biraz pratik gerektirecektir.

Kalsiyum seviyelerini düşürerek akson tavanını geciktirmeye çalışmayın; çünkü bu durum, sinir hasarının gelecekteki fizyolojik işlevini tehlikeye atacaktır. 40 dakikalık inkübasyonun ardından, Schneider çözeltisi içindeki preparatın dolgu filamenti banyonun kenarına değdirilip tekrar yerleştirilerek, ucundaki ve başlangıçtaki kalsiyum indikatör çözeltisinin çoğu uzaklaştırılır. Ardından, filament kullanılarak banyodan taze Schneider çözeltisi çekilir ve yatak tamamen Schneider çözeltisiyle doldurulur.

Schneider çözeltisi, banyodan izole edilmiş iletkenlerden biri olarak görev yapacağı için yatakta hiç kabarcık olmamalıdır; cam pet ile uyarılmış sinir hazırlığı yeniden en az 60 dakika, ancak dört saatten fazla olmamak kaydıyla karanlık bir yere yerleştirilir ve inkübasyon süresince her 30 dakikada bir taze Schneider çözeltisi ile durulanır, böylece kalsiyum indikatörü aşağı taşınır. Hazırlığı incelemek istediğiniz zamandan 20 dakika önce akson sinir terminalinde yoğunlaşır. Bunu HL six çözeltisi ile durulayın.

Glutamat veya L glutamik asit seviyesi yaklaşık 0,4 millimoların üzerindeyken, sinir kaynaklı kas kasılmalarını durdurmak için HL six içerisine 7 millimolar düzeyinde ekleyerek kalsiyumun istenen seviyede tutulmasını sağlayın. Schneider solüsyonu, halihazırda yüksek düzeylerde hem glutamat hem de kalsiyum içerdiğinden kalsiyum görüntüleme için uygun değildir. Bu seviyeleri ayarlamanız gerekecektir.

Tate ayrıca mevcuttur, böylece yükleme sırasında kalsiyum en az 2 milyon seviyesinde olduğu sürece Schneider'ın otoflüoresan yüklemesi ve görüntüleme HL altısında gerçekleştirilebilir. Hazırlığı görüntüleme için bir bileşik mikroskoba yerleştirirken, statik elektriği kendinizden boşaltmaya dikkat edin. Ardından, bir pens yardımıyla hem banyodaki çözeltiye hem de objektife dokunun.

Eğer objektif bir immersiyon objektifi ise, bunu banyoya yaklaştırın, ardından tabanı anlık olarak topraklayın veya birini banyoya yerleştirip diğerini aşağıya indirerek doldurun; üç voltun altında ve 300 mikrosaniye süreli kare DC darbeleri, sinirde güvenilir bir şekilde aksiyon potansiyeli oluşturacaktır. Burada, kas altı ve yedi arasındaki yarıkta bulunan iki grup sinir terminalinin, GFP'nin sitozolik ekspresyonu tetiklenerek görünür hale getirildiğini görüyoruz. Ayrıca bunlar, GFP'den farklı eksitasyon ve emisyon spektrumlarına sahip olan kalsiyum indikatörü Rod Dextrin ile ileriye doğru doldurulmuştur.

Bu görüş alanı hala sinir terminallerini içermektedir, ancak Rod Rin'in kalsiyuma karşı afinitesi düşüktür ve sinir sükunet halindeyken neredeyse görünmezdir. Bununla birlikte, tekil aksiyon potansiyelleri veya iki saniyelik kısa stimülasyon trenleri sırasında terminallere giren kalsiyuma karşı oldukça duyarlıdır. Az önce gösterilen, birbirine yakın yerleşimli 80 hertz trenlerinin floresan analizinde görüldüğü üzere, tip 1 S terminallerindeki yanıtlar genellikle tip 1 B terminallerindekilerden daha büyüktür.

Rod dekstrin ve flu gibi düşük afiniteli kalsiyum indikatörleri. Rod dekstrin, bu terminallerde 10 ila 80 hertz aralığındaki sinir stimülasyon frekanslarına karşı neredeyse lineer bir yanıt göstermiştir. Burada gösterilen örnek, Rod Dekstrin ile yüklenmiş dördüncü kas üzerindeki bir sinir terminalinden alınmıştır.