Name: Kalsiyum Göstergeleri ile yükleme Drosophila Sinir Terminalleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: Öğrenin Drosophila sinir terminallerine kalsiyum göstergeleri yükleme tekniğini. Bu yöntem, sinir iletimindeki kalsiyum dinamiklerini in vivo çalışmak için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li> Herhangi bir fiksatif maruz olmamıştır temiz bir diseksiyon çanak seçin. </li><li> Schneider Drosophila Orta Ca 2 içeren bir gezgin 3. instar Drosophila larva teşrih + ve L-glutamin, (herhangi bir sinir ya da hasar kas lifleri No 7, 6, 13 veya 12 kesmeyin). </li><li> 12 mikron ucu (iç çapı) ile bir bardak doldurma pipet seçin. </li><li> (Pipet negatif basınç uygulamak için) bir şırınga ve tüp kullanarak pipet ucu tıkalı olmadığından emin olun. </li><li> Cam pipet uzunluğu aşağı eklenebilir ince bir plastik dolum filament seçin. </li><li> + Göstergesi plastik filament 5 mM dekstran-konjuge Ca 2 ~ 1 cm çizin. </li><li> Tüm segmenti sinirler kesin. </li><li> Pipet disseke larva ventral orta hat yaklaşım sağlayacak bir rampa üzerinde pipet Destek. </li><li> Pipet sonuna (Schneider ve orta küçük bir miktar dahil), sinir sıkışmasını, No.4 segmentine bir sinir kesik ucuna çizin. </li><li> Filament sonunda (sinir dokunmaktan kaçının) sinir kesme sonu 50 mikron girene kadar tüpünü çıkarın ve plastik filament pipet içine yerleştirin. </li><li> Çıkar yeterli Ca 2 +, yaklaşık% 33 (son konsantrasyonu &lt;2mm olmalıdır) Schneider ortamın ses seviyesini artırmak için biten sinir üzerine göstergesi . Önemli - Bu sinir kesme 5 dakika içinde tamamlanması gerekir. </li><li> Oda sıcaklığında, karanlıkta hazırlık yerleştirin sinir yükler. </li><li> 40 dakika filament kullanarak Ca 2 +-gösterge kaldırdıktan sonra. </li><li> Pipet yerde bırakın ve bu sinir uyarıcı darbeler uygulamak için kullanılan olacak gibi tamamen taze Schneider orta doldurun. </li><li> Ca 2 + göstergesi en az 60 dakika boyunca sinir denge sağlaması için izin verin, ancak en fazla 4 saat, Ca 2 + görüntüleme başlamadan önce. </li><li> Taze Schneider orta her 30 dakikada bir değişikti ise hazırlık durulayın. </li><li> Görüntüleme 20 dakika önce hemolimf-Benzeri No.6 çözüm (Macleod ve ark 2002, 2003 HL6) Schneider orta yerine. </li><li> L-glutamik asit ya da glutamat postsinaptik glutamat reseptörleri duyarsızlaştırmak sinir uyarılmış kas kasılması önlemek için 7mm az HL6 çözüm eklenebilir (Macleod ve ark 2004;. Reiff ve ark 2002, 2005). </li></ol>

<ol><li>Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).</li>
<li>Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neuron+activity+in+the+Drosophila+larval+CNS+detected+with+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators.</a> J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).</li>
<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles%3A+test+for+a+role+in+presynaptic+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li>
<li>Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+active+zone+density+during+long-term+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).</li>
<li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

<table><tbody><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Böcek Besiyeri</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td>L-glutamin ve kalsiyum içermelidir</td></tr><tr><td>L-glutamik asit monosodyum tuz hidratı</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr></tbody></table>

kalsiyum göstergeleri ile yükleme drosophila sinir terminalleri

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Kalsiyum sinir sistemi birçok roller oynar ama hiçbiri nörotransmitter serbest bırakılması için tetikleyici olarak daha etkileyici ve sinaptik plastisite, öğrenme ve hafıza destekler için gerekli elçi olarak daha hiçbiri daha derin. Ca 2 moleküler temellerinin daha da aydınlatmak için +-bağımlı sinaptik mekanizmalar, genetik uysal ve fizyolojik olarak erişilebilir bir model sistem olması gereklidir . Drosophila melanogaster böyle bir model sağlar. Bu sistemde, sinir uçlarında Ca 2 + değişiklikleri tespit etmek için genetik olarak kodlanmış floresan göstergeler mevcuttur. Ancak, bu göstergeler Ca 2 duyarlılık sınırlı + ve genellikle doğrusal olmayan bir tepki göstermek. Sentetik floresan göstergeler daha iyi, hızlı bir şekilde Ca 2 + sinir aktivitesi ile ilişkili değişiklikler ölçmek için uygundur. Burada Drosophila larvaları canlı sinir terminallerine dekstran-konjuge sentetik Ca 2 + göstergeleri yükleme için kullanılan bir tekniktir göstermektedir. Özellikle vurgu hazırlık sağlığı devamlılığının uzun yükleme dönemleri sırasında sağlanması bakımından, izole sinirler boyunca statik elektrik deşarjları önlemek için ne gibi, tekniği Kullanıcı başarısı için en kritik protokolün bu yönleri üzerine yerleştirilir, ve Ca 2 sağlayan akson hayatta kalma sağlanması . + kopmuş akson uçlarının sızdırmazlık teşvik. Düşük afiniteli dekstran-konjuge fluo-4 ve rhod + göstergeleri, Ca 2 + dinamikleri presinaptik Ca 2 kesintiye minimal yüksek sinyal-gürültü oranı gösteren mevcuttur. Dekstran-konjugasyon Ca 2 + göstergeleri gibi mitokondri gibi organellerin içinde sekestre önlemeye yardımcı olur. Larvaları, embriyoları ve yetişkinler için eşit yükleme tekniği uygulanabilir.

Kalsiyum sinir sistemi her yerde bulunan bir haberci, sinaptik gücü nörotransmitter salınımı ve değişiklikleri tetiklenmesi için gerekli. Burada Ca 2 +-göstergeler Drosophila sinir uçları içine yüklemek için bir teknik göstermektedir. Biz de gerekli aparat imalatı göstermek ve tekniğinin başarısı için kritik noktaları vurgulamak.

Kalsiyum Göstergeleri ile yükleme Drosophila Sinir Terminalleri

Kalsiyum, sinir sisteminde birçok rol oynamaktadır ancak bunların hiçbiri nörotransmitter salınımının tetikleyicisi olması kadar etkileyici ve hiçbiri ... kadar derin değildir.

Merhaba, adım Greg McLeod. Laboratuvarım, sinir uçlarındaki kalsiyum düzenlemesini ve bunun nörotransmisyon üzerindeki etkilerini incelemektedir. Bu çalışmaları Drosophila melanogaster üzerinde gerçekleştiriyoruz.Meyve sineği, genetik esnekliği ve basit, erişilebilir sinir sistemi nedeniyle nörobilimciler için çekici bir modeldir. Bu sinir sisteminde, sinir uçlarındaki kalsiyum değişimlerini tespit etmek için genetik olarak kodlanmış floresan indikatörler mevcuttur. Ancak, bu indikatörlerin kalsiyuma karşı duyarlılığı sınırlıdır ve sıklıkla lineer olmayan bir yanıt sergilerler.Sentetik indikatörler, sinir aktivitesiyle ilişkili hızlı kalsiyum değişimlerini ölçmek için daha uygundur. Oph larva canlı sinir terminallerine dekstrin konjuge sentetik kalsiyum indikatörlerinin yüklenmesi için bir tekniği göstereceğiz. Dekstrin konjugasyonu, kalsiyum indikatörlerinin mitokondri gibi organellerde hapsolmasını önlemeye yardımcı olur.Yükleme tekniği, larva embriyolarına ve yetişkinlere eşit şekilde uygulanabilir. Bir larvayı, cam lam üzerindeki küçük bir sigara banyosunda diseke edeceğiz. Mavi diş mumu, cam yükleme yatağını destekleyecektir.Kalabalık olmayan bir vialin yan tarafındaki star la

loading-drosophila-nerve-terminals-with-calcium-indicators

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz sinek larvaları konfokal mikroskobu ile floresan boyalar kullanarak canlı bir roman Tersyüz doku hazırlanması Glia nöromüsküler sinapsların yapısal özellikleri nitelendirdi. Biz HRP için flüoresan primer antikor ile canlı nöron terminalleri etiketli ve floresan Dextrans perisynaptic alan görüntülendi.

Canlı görselleştirme Drosophila</emFloresan Boyalar> Glial nöromüsküler Kavşağı

Biz yaşam antennal lobda koku uyarılmış kalsiyum yanıtları ölçmek ve analiz etmek için kurulmuş bir tekniği...

Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

Bu videoda, GCaMP kullanılarak Drosophila nöronlarında in vivo kalsiyum görüntüleme açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol klibi, bir koku alma koşullandırma deneyi sırasında mantar vücut nöronlarından GCaMP floresansındaki değişikliklerin nasıl kaydedileceğini gösterir.

Drosophila In Vivo Kalsiyum Görüntüleme: Nöronal Aktivitenin Fonksiyonel Görüntülenmesi İçin Bir Yöntem

Bu video, ligand bağlanması ve floresan görüntüleme kullanarak Drosophila'da duyusal nöron tepkilerini tespit etmek için bir yöntemi göstermektedir. Ligandlar nöron reseptörlerine bağlanarak kalsiyum akışına neden olur. Kalsiyum, gösterge komplekslerine bağlanarak floresan emisyonuna yol açar ve bu da ligandın nöronal tepkisini doğrular.

Drosophila'da Duyusal Nöronlardan Gelen Fizyolojik Tepkilerin Saptanması

Bu videoda, Drosophila larvaları sinir lifleri, hücre zarı lipidlerine bağlanan FM boyasına daldırılır. Emme mikroelektrodu ve elektrik darbeleri, FM boyasını yeni oluşan endositik veziküllere dahil ederek endositoz sürecini uyarır. Nörotransmisyonun presinaptik aşamalarını görselleştiren bu yöntem, sinaptik fonksiyonu ve nörotransmitter salınımını incelemek için yararlıdır.

Drosophila Larva Sinir Hücrelerinde Mikroelektrot Aracılı FM Boya Yükleme ve Boşaltma

Bu video, bir floresan boya kullanarak channelrhodopsin eksprese eden Drosophila larvalarındaki nöromüsküler kavşaklarda sinaptik vezikül geri dönüşümünü incelemek için bir protokolü göstermektedir. Mavi ışık, channelrhodopsinleri aktive ederek kalsiyum akışına ve sinaptik vezikül ekzositozuna neden olur. Boya, nöronal membranlara entegre olur ve endositoz sırasında içselleştirilir, bu da floresanın artmasına neden olur. Daha fazla mavi ışık stimülasyonu, azaltılmış floresan ile gösterilen...

Drosophila Larvalarında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümü ve Floresan Boya Alımının Analizi

Bu videoda, sineklerde sinaptik olarak lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak in vivo kalsiyum görüntüleme yöntemi gösterilmektedir. Sinekleri mikroskopi için hazırlamak, koku alma koşullandırması yapmak ve koku kaynaklı kalsiyum akışını görselleştirmek için adımları ana hatlarıyla belirtir.

In vivo (İn canlı) Drosophila melanogaster'de Sinaptik Lokalize Kalsiyum Sensörleri Kullanılarak Kalsiyum Görüntüleme

Kaynak: Ishimoto, H. et. al., Drosophila'da endokrin sinyalizasyona beyin tepkilerini görselleştirmek için ex vivo kalsiyum görüntüleme. J. Vis. Uzm.  (2018) Bu video, çalışmak için kalsiyum görüntülemeyi göstermektedirDrosophila nöropeptitlere beyin tepkileri. Floresan kalsiyum indikatörünü eksprese eden nöronlar, hücre içi kalsiyum dinamiklerini ve sinyal moleküllerine fonksiyonel tepkileri ortaya çıkarır.

Drosophila Beyninin Nöropeptitlere Tepkilerini İncelemek için Ex Vivo Kalsiyum Görüntüleme

Drosophila'nın ön ayakları ve hortumu, tat alma duyusal nöronlarının zengin bir repertuarını içerir. Burada, canlı sineklerin ön bacak ve hortumundaki duyusal nöronlardan gelen fizyolojik tepkileri ölçmek için kalsiyum görüntüleme kullanan bir yöntem sunuyoruz.

Fizyolojik Yanıtları Ölçüm<em&gt; Drosophila</em&gt; Canlı Kalsiyum Görüntüleme kullanma Lipit Feromonlar Sensory Nöronlar

Burada, sinir uçlarına kurbağa sinir kütüğünden kalsiyuma duyarlı bir boya yüklemek için bir yöntem açıklıyoruz. Ayrıca, periferik sinir uçlarında hızlı kalsiyum geçişlerinin kaydedilmesi ve analizi için bir protokol de sunuyoruz.

Kurbağa Sinir Uçlarına Sinir Kütüğü Vasıtasıyla Kalsiyum Boyası Yükleme: Kurbağa Nöromüsküler Kavşağında Kalsiyum Geçici Kayıt

Bu protokol, Drosophila melanogaster larvalarının merkezi sinir sisteminde tanımlanmış nöronal partnerler arasındaki fonksiyonel sinaptik aktiviteyi in vivo olarak değerlendirir; genetik olarak kodlanmış araçlar kullanılır. Presinaptik cIVda duyusal nöronların CsChrimson aracılı optogenetik uyarısı, postsinaptik Basin-4 internörlerinde CaMPARI'nin kalsiyuma bağlı fotodönüşümünü indükler.

CaMPARI kullanılarak Drosophila larva merkezi sinir sisteminde bireysel pre- ve postsinaptik partnerlerin fonksiyonel karakterizasyonu

Öğrenin Drosophila sinir terminallerine kalsiyum göstergeleri yükleme tekniğini. Bu yöntem, sinir iletimindeki kalsiyum dinamiklerini in vivo çalışmak için değerli bir araç sunar.

Kalsiyum Göstergeleri ile yükleme Drosophila Sinir Terminalleri

Daha fazla video keşfet