Name: Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Öğrenin canlı konfokal görüntüleme yöntemiyle Drosophila embriyolarında hücre şekli değişimlerini gözlemleme tekniklerini. Bu protokol gelişim biyolojisi araştırmalarında dinamik süreçleri gerçek zamanlı izlemeyi mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz minnetle, bu protokolü geliştirildi dayandığı temel Eric Wieschaus kabul etmiş sayılırsınız. Çalışmalarımız Verna &amp; Marrs McLean, Biyokimya Anabilim Dalı ve Moleküler Biyoloji Başlangıç ​​Ödülü, Baylor College of Medicine tarafından desteklenmektedir.

1. Embriyo Koleksiyon Bardaklar birleştirin <ol><li> Mümkün olduğunca pürüzsüz kenar, ustura ile 100 ml Üç mısır beher alt kesti. Bu kesinlikle gerekli olmasa da, bardak, aynı zamanda üst kapalı üç köşe Döşeme halinde ele kolaydır. </li><li> Tel örgü (6 cm x 6 cm) bir kare kesin. Önceden ısıtılmış sıcak levha, iç davlumbaz, katman, ağır alüminyum folyo bir parça üstüne tel örgü kare. Kesme alt kenarı fincan sıcak örgü üzerine sıkıca bastırın. Birkaç saniye bekleyin ve şimdi bağlı mesh ile kupayı kaldırmayı. Folyo da sopalarla ise, sadece o kabuğu. </li><li> Gecede bardağı soğutun. Ince taneli zımpara kağıdı ile herhangi bir keskin kenarları aşırı makas örgü, kum ve çıkarın. </li></ol> 2. Elma Suyu Agar Tabaklar olun <ol><li> 6L şişesi, 100 g BD Bacto Agar ve 3L distile su birleştirir. 30 dakika yavaş egzoz ayarı agar Otoklav. </li><li> Bir heyecan çubuğu ile 2L şişesi, 100 g sakaroz, 1L elma suyu, ve 6 g p-hidroksibenzoik asit birleştirir. Sıcak bir plaka üzerine karıştırarak kaynama çözüm ısıtın. En fazla 2 dakika boyunca kaynatın. Elma suyu karışımı serin ve daha sonra heyecan çubuğu ile agar eklemek için izin ver. Tamamen karıştırın. </li><li> 60x15 mm petri kaplarına dökülmeden önce 60 ° C su banyosunda soğutmak için kombine bir çözüm izin verin. Alternatif olarak, bir peristaltik pompa agar dağıtmak için kullanılabilir. Plakaları, en az 4 saat süreyle oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. 4 ıslak kağıt havlu ve mağaza bir katman ° C ile Rubbermaid kaplarda Stack </li></ol> Notlar: <ul><li> Sonbahar ya da kış, ek bir 100 ml su agar eklemek için gerekli olabilir. </li><li> Petri kutularının marka önemlidir! Sadece BD Falcon yemekleri mısır Üç bardak uygun. Özel sipariş bilgileri aşağıda Malzeme tablo bulunabilir. </li></ul> 3. Embriyo Koleksiyon Bardaklar GFP Sinekler <ol><li> Şişe kurarak toplama ihtiyaçlarına göre GFP stokları genişletin görüntüleme için yaklaşık iki hafta önce uçar. Bir şişe sinek genellikle en az 50 kadın ve 30 erkek ile bir embriyo toplama kabına doldurmak için yeterli olandan daha fazla. En iyi döşenmesi için, sinek (yani en az 5 gün sonrası kuluçka) yeni eclosed olmalıdır. </li><li> Kabaca eşit parçaya Red Star aktif kuru maya ve distile su ile küçük bir bardak doldurarak yapıştırın bir maya ve maya eriyene kadar karıştırın. Macun ıslak fıstık ezmesi yaklaşık tutarlılık olmalıdır. Daha fazla maya veya su tutarlılık değiştirmek için eklenebilir. Maya salçası, 4, birkaç gün için kullanılır, ve saklanmalıdır, kapalı ° C </li><li> Maya yapıştırın hazır olduğunda, 4 elma suyu plakaları kaldırmak ° C depolama. Maya hamuru ile elma suyu plakalar ve bunların 22-25 ısınmasını bekleyin Streak ° C, yumurtlama teşvik edecektir. </li><li> Sonra yine yarım, yarım yuvarlak bir filtre kağıdı katlayın. 8-9 cm çapında kesin ve çeyrek daire içinde akordeon kıvrımları. Daire açın, invert ve örgü temas edene kadar bir toplama kabına yerleştirin. Sonbahar ve sinek ezmek, böylece kağıt bardak güvenli olduğundan emin olun. Filtre kağıdı, isteğe bağlıdır, ancak çiftleşme için davetkar bir ortam sağlar, ve fincan nem tutar. </li><li> Stok adı ve tarih ile birlikte bir fincan etiketleyin. Fincan ters şişe hafifçe sallayarak ve hemen hazırlanmış bir elma suyu plaka ile fincan kapağı sineklerin şişe toplama kabına aktarın. Plaka fincan bir lastik bant ile sabitleyin. Doğrudan güneş ışığı ile bir alanda bardak örgü yüzü yukarı ayarlayın. Sinekler karanlıkta yatıyordu olmaz gölgeler, fincan düştüğü emin olun. </li><li> Elma suyu plakası, gerektiği gibi değiştirin. İki saat koleksiyonları, oda sıcaklığında, görüntüleme cellularization için iyi çalışır. </li></ol> 4. Montaj Odası hazırlayın <ol><li> Embriyolar için bir montaj odası hazırlamak için, 2-3 cm uzunluğunda çift taraflı bant bir parça kesme ve bir slayt üzerine yerleştirin, teyp ve slayt uzun ekseni hizalayarak. Kenarları hizalanır emin olmak için, ikinci bir 2-3 cm, çift taraflı bant ve diğer bant parçasının üstüne katmanı uzun bir parça kesin. </li><li> Bir jilet kullanarak, bant ve slayt uzun eksenine dik merkezi dışında iki yaklaşık 3 mm keser. Kesimler arasında bir kanal yapmak için bandı çıkarın. Kanal içine Halokarbon 27 Petrol pipetleyin bir damla. Bu kanal, embriyoların burada monte edilecektir. </li></ol> Notlar: <ul><li> Sadece ½ inç Scotch çift taraflı bant, embriyoları yerleştirmek için doğru kalınlığı. </li><li> Halokarbon 27 Yağ oksijen geçirgen ve embriyo dehidratasyon önlerken oksijen alışverişi sağlar. Refraktif indeks nedeniyle, Halokarbon 27 Yağ evreleme için de idealdir.ve görüntüleme embriyolar. </li></ul> 5. Dechorionate Embriyolar <ol><li> Toplamak ve dechorionate embriyolar için, tüm yüzey tamamen daldırın elma suyu agar plaka üzerinde yeterince% 50 çamaşır suyu dökün. Embriyoların koryon serbest bırakmak için, iletilen ışık Zeiss Discovery V8 gibi, bir diseksiyon mikroskop kullanarak izlemek. Koryon gevşetir ve bir kaç embriyolar (30-60 saniye) sürümleri gibi, bir hücre süzgeç içine çamaşır suyu ve embriyolar dökün. </li><li> Fışkırtma bir şişe saf su ile derhal ve şiddetle süzgeç embriyolar yıkayın. Dab süzgeç kağıt havlu üzerine. Dabbing sonra herhangi bir pembe havlu görüldüğü takdirde, su ile embriyolar yıkama devam etmektedir. </li><li> Temiz bir elma suyu plaka (maya yapıştırın olmadan) 10-50 embriyo transferine nemli bir fırça kullanın. Yırtık bir kağıt havlu kenarı ile su uzak Wick ve hemen Halokarbon 27 Yağı küçük bir miktarı ile embriyoların kapsayacak. </li></ol> Notlar: <ul><li> Clorox çamaşır suyu kullanmayın. Bunun yerine, &lt;% 6 sodyum hipoklorit Austin Ticaret Bleach, A-1 gibi bir marka kullanın. </li><li> Aşırı ağartma veya yetersiz durulama düzensiz cellularization Duygusal embriyolar neden olacaktır. </li></ul> 6. Sahne ve Montaj Embriyolar <ol><li> Iletilen ışık ile diseksiyon mikroskop kullanarak, plaka üzerinde embriyolar aşamasına Bownes 20 morfolojik yönergeleri izleyin. Forseps kullanarak, montaj odasına kanal Bownes evre 4 karşılık, 5 mitotik döngüsü 11 veya 12 embriyoların transferi. Dorsal ve ventral tarafı aşağı görünür ve yan tarafında bir çizgi embriyolar düzenleyin. Embriyolar yalnız petrol bu yönde kolayca düzenlenir. Kapak kayma aşağıda uygulandıktan sonra oksijen komşuları mahrum kalabalık embriyolar birlikte etmeyin. (Aralarında embriyo uzunluğu yaklaşık yarım bırakın). </li><li> Kanalın bir tarafında çift taraflı bant kayma 25x25 mm kapak kenarına yatırın. Kanal kapağı için kapak kayma bırakın. Hava altında yakalanmış ise, kapak kayma kenarında Halokarbon 27 Yağı küçük bir miktar uygulanır. Kılcal etkinlik kanal içine yağ çekme ve hava dışarı itecektir. </li></ol> Notlar: <ul><li> Embriyolar evreleme için bir başka mükemmel bir kaynak aşağıdadır: Campos-Ortega, JA ve Hartenstein, V. (1985). Drosophila melanogaster Embriyonik gelişim. Springer-Verlag, Berlin. Bu kitap artık yayınlanmış olmasına rağmen, kullanılan kopya Amazon.com düzenli olarak kullanılabilir. </li><li> Idareli Halokarbon 27 Yağ her zaman kullanın. Bu montaj daha kolay hale getirecektir. Ayrıca aşağıdaki görüntüleme adımları mikroskop objektif üzerine yağ sızmaya yanlışlıkla önleyecektir. </li></ul> 7. Resim Embriyolar <ol><li> Tabii burada Nasıl devam görüntüleme olduğu hücre şekil değişikliği ve size hitap soru tarafından dikte olacaktır. Herhangi bir şekil değişikliği için, montaj odasına ya dik ya da ters mikroskop yere iletilen ışık embriyolar bulmak ve daha sonra bölgeye bir ilgi odağı konfokal görüntüleme geçmek. Nikon'un MicroscopyU (tartışılacak gibi konfokal mikroskopi için en iyi uygulamalar, <a href="http://www.microscopyu.com/articles/confocal">uyun</a> http://www.microscopyu.com/articles/confocal) . Photobleaching ve fototoksisite önlemek için, mümkün olduğu kadar az lazer gücü, canlı embriyolarının ifşa özellikle dikkatli olun. </li><li> Cellularization için, biz bir Zeiss 710 lazer tarama konfokal mikroskop görüntü, bir C-Apochromat 40x/1.2 W Corr amacı ile. Bu mikroskop, 18-20 ° C den arasında değişen sıcaklıklarda, sıcaklık kontrollü bir oda içinde yer alır Sıcaklık kontrolü kesinlikle gerekli değildir, ancak mikroskop için daha iyi ve görüntü daha tutarlı hale getirir. Biz düzenli olarak embriyo ortasına yakın tek bir düzlemde görüntü, kesit plazma zarı invajinasyonları (Şekil 2) takip etmek. , Sadece invajinasyon dinamikleri takip için 30-60 saniyelik aralıklarla zaman atlamalı görüntüleme için yeterli ve embriyolar oksijensizlik hiçbir belirgin belirti&gt; 90 dakika için görüntüleme dayanacak. </li><li> Görüntüleri aldıktan sonra, görüntü analiz paketleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri freeware, ImageJ (adı da dahil olmak üzere herhangi bir sayı <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">kullanılarak</a> analiz edilebilir http://rsbweb.nih.gov/ij). Bu veriler daha sonra film (Film 1), diziler (Şekil 2) veya kymographs 21 olarak sunulabilir. </li></ol> Not: <ul><li> C-Apochromat suya daldırma 40x/1.2 W Corr amacı sulu örneklerinde derin doku görüntüleme için sapmaları sınırlar yüksek diyafram nedeniyle orta bölümünde embriyo yakın görüntüleme için çok uygun ve yüksek çözünürlük ve yüksek floresan sinyal verir. Buna ek olarak, bu amacaçok uzun bir çalışma mesafesi (220 mikron). Ancak, diğer su ya da gliserin daldırma hedefleri ilgi hücre şekil değişikliği embriyo yüzeyine yakın görüntülü özellikle iyi bir performans olacak. </li></ul> 8. Alternatif Yöntem: "embriyo-tutkal" Montaj Embriyolar <ol><li> Cellularization daha başka bir hücre şeklini değiştirmek için, belirli bir yönde kolayca tek başına petrol tutulmaz embriyolar monte etmek için gerekli olabilir. Bunu yapmak için, daha önce açıklanan bir alternatif montaj metodu kullanın. Sintilasyon flakon 250 mcL heptan ile 20 cm çift taraflı bant ile birleştirerek "embriyo-tutkal" yaparak başlayın. Sintilasyon bir nutator flakon ya da dönen bir platform yerleştirin ve geceleme karıştırın. </li><li> Embriyo yapıştırıcı bir sarı pipet ucu batırın ve sonra tutkal bir iz bırakarak, bir slayt boyunca ucu iz. Heptan buharlaşan iken, agar bir blok gerekli yönde embriyolar sahnelenen hizalayın. (Görüntülü embriyo yüzey agar karşı karşıya olması gerektiğini unutmayın. Örneğin, ventral karık oluşumu sırasında görüntü hücre şeklini değiştirmek için, agar karşı karşıya ventral yüzü embriyolar monte edin.) </li><li> Yapıştırıcı ile slayt, invert ve yavaşça agar bloğu embriyoların karşı tutkal izi basın. Şimdi tekrar slayt çevirin. Embriyolar uygun bir yönlendirmeye sıkışmış olacak. Embriyoların her iki tarafında çift taraflı bant ile iki kat, Halokarbon 27 Yağ kapağını ve bir lamel geçerlidir. Yukarıda açıklandığı gibi görüntüleme ile devam edin. </li></ol> 9 - Temsilcisi Sonuçlar: Embriyoların sağlıklı ve en iyi görüntü ise, daha sonra cellularization 50-60 dakika almalı ve plazma membran invajinasyonları girişine yaklaşık 40 mikron. Ancak, embriyolar üzerinde ağartılmış, fototoksisite tarafından oksijen yoksun veya hasarlı olup olmadığını, daha sonra invajinasyon ya özellikle görüntülü alanda, yavaş ya da duracaktır. Embriyo sağlık Böyle bozulma, sık sık değişmiş geliştirme ve larva olarak yumurtadan bir başarısızlık ile sonuçlanır. Böylece, görüntüleme sonra tahlil embriyo sağlık için sıkı bir test için, nemlendirilmiş bir odasında slaytlarınız tutmak ve ertesi gün kuluçka izlemek. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Embriyo toplama görüntüleme iş akışı, iş akışı protokol dört ana aşamaya bölünebilir . İlk aşamada, tüm bireysel kaynakları ve bileşenleri hazırlanır ve daha sonra embriyo toplama fincan elma suyu agar plaka ve GFP sinekler embriyo-döşeme ortamı yaratmak için bir araya konur. İkinci aşamada ise, elma suyu agar plakları üzerine koydu, yumurta ve embriyolar toplanır. Üçüncü aşamada ise, embriyoların plaka kaldırılır, sahnelenen ve montaj odasına aktarılır. Dördüncü evrede, monte embriyolar konfokal mikroskop görüntülü. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Cellularization zaman atlamalı görüntüleme Temsilcisi veri Embriyolar dorsal (D) ve açıkça görünür ventral (V) taraf ile monte edilir ve kesit plazma zarı invajinasyonları takip etmek onların ortasına yakın görüntülü. Burada gösterilen embriyo ifade GFP-Myosin-2 prob 6, plazma zarı invajinasyonları ucunda yoğunlaşmaktadır. Böylece, zamanla bu ön ingression izleme plazma zarı invaginates hangi hızda verir. 0:00 dakika zaman noktası cellularization başlangıçlı karşılık gelir. 56:00 dakikalık bir zaman noktasında kısa bir süre sonra, gastrulasyon embriyonun ventral tarafında başlar. Bar 40 mikron. Movie 1. Cellularization zaman atlamalı görüntüleme Temsilcisi film Bu film Şekil 2 tekabül etmektedir. , Görüntüleme cellularization tüm süreci kaydetmek için yakalama pseudocleavage karık regresyon, önceki mitotik döngüsü 13 başladı ve gastrulasyon hareketleri embriyonun ventral tarafında görüldü kadar devam etti. Görüntüler bir dakikalık aralıklarla toplanmıştır. Şiddetleri gastrulasyon hareketleri daha kolay hale getirmek için alım sonrası artmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2503/Movie%201.mov">Video için tıklayın</a> <table border="1"><tbody><tr><td> * Gelişimsel olay ve zamanlama </td><td> Hücre şekil değişiklikleri ile ilgili </td><td> Hastalık ya da insan sağlığı için bir bağlantı </td><td> Canlı görüntüleme ile son referanslar </td></tr><tr><td> Pseudo-bölünme karık oluşumu (4, 90 dakika pf) </td><td> Sitokinez </td><td> Poliploidi ve kanser ilerlemesi 1 </td><td> Mavrakis ve ark, 2009 8 Cao ve ark, 2010 9 </td></tr><tr><td> Cellularization (5, 130 dakika pf) </td><td> Sitokinez </td><td> Poliploidi ve kanser ilerlemesi 1 </td><td> Cao ve ark, 2008 10 Sokac &amp; Wieschaus, 11, 2008 </td></tr><tr><td> Ventral karık formasyonu; Mezoderm invajinasyon (6, 180 dakika pf) </td><td> Apikal daralma; Epitel mezenkimal geçiş </td><td> Kanser metastaz 2 </td><td> Fox &amp; Peifer, 12, 2007 Martin ve ark, 2009 13 </td></tr><tr><td> Germband uzantısı (7, 195 dakika pf) </td><td> Yakınsak uzantısı </td><td> Nöral tüp defektleri 3 </td><td> Bertet ve ark, 2004 14 Blankenship ve ark, 2006 15 </td></tr><tr><td> Tracheogenesis (11, 320 dakika, pf) </td><td> Epitelyal tüp oluşumu ve dallanma </td><td> Anjiyogenez 4 </td><td> Caussinus ve ark, 2008 16 Gervais &amp; Casanova, 2010 17 </td></tr><tr><td> Dorsal kapatma (14, 620 dakika pf) </td><td> Apikal daralma </td><td> Yara iyileşmesi 5 </td><td> Gorfinkiel ve ark, 2009 18 Solon ve ark, 2009 19 </td></tr></tbody></table> Yaşayan sinek embriyolar görüntülü cep şekil değişiklikleri Tablo 1. * Bownes sahne sayısı ve süresi sonrası fertilizasyon (pf), her olay başladığında, Campos-Ortega, 1985 göre sıralanmıştır. <table border="1"><tbody><tr><td> Stok Fly </td><td> Etiketler </td><td> Orijinal referans </td></tr><tr><td> Spider-GFP (95-1) </td><td> Plazma membran </td><td> Morin ve ark, 2001 22 </td></tr><tr><td> Resille-GFP (117-2) </td><td> Plazma membran </td><td> Morin ve ark, 2001 22 </td></tr><tr><td> GAP43-Venüs </td><td> Plazma membran </td><td> Mavrakis ve ark, 2009 8 </td></tr><tr><td> Spagetti Squash GFP (SQH-GFP) </td><td> Miyozin-2 </td><td> Royou ve ark, 2002 6 </td></tr><tr><td> E-kaderin-GFP (ECAD-GFP) </td><td> Hücre-hücre kavşaklar </td><td> Oda ve ark, 2001 23 </td></tr><tr><td> GFP-Moesin </td><td> F-aktin </td><td> Kiehart ve ark, 2000 24 </td></tr><tr><td> Utrophin-Venus (Utro Venüs) </td><td> F-aktin </td><td> Sokac ve ark. Yayınlanmamış sonuçları </td></tr></tbody></table> Tablo 2 sinek embriyolar görüntüleme hücre şekil değişikliği Faydalı stokları

<ol><li>Sagona, A. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis and cancer.</a> FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).</li>
<li>Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease.</a> Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).</li>
<li>Kibar, Z., Capra, V., Gros, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+understanding+the+genetic+basis+of+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Toward understanding the genetic basis of neural tube defects.</a> Clin Genet. 71, 295-310 (2007).</li>
<li>Jazwinska, A., Ribeiro, C., Affolter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+tube+morphogenesis+during+Drosophila+tracheal+development+requires+Piopio%2C+a+luminal+ZP+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial tube morphogenesis during Drosophila tracheal development requires Piopio, a luminal ZP protein.</a> Nat Cell Biol. 5, 895-901 (2003).</li>
<li>Martin, P., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallels+between+tissue+repair+and+embryo+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis.</a> Development. 131, 3021-3034 (2004).</li>
<li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 15, 838-850 (2004).</li>
<li>Lecuit, T., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+insertion+of+new+membrane+from+a+cytoplasmic+reservoir+during+cleavage+of+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polarized insertion of new membrane from a cytoplasmic reservoir during cleavage of the Drosophila embryo.</a> J Cell Biol. 150, 849-860 (2000).</li>
<li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+polarity+and+compartmentalization+are+established+before+cellularization+in+the+fly+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane polarity and compartmentalization are established before cellularization in the fly embryo.</a> Dev Cell. 16, 93-104 (2009).</li>
<li>Cao, J., Crest, J., Fasulo, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+Actin+Dynamics+Facilitate+Early-Stage+Centrosome+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cortical Actin Dynamics Facilitate Early-Stage Centrosome Separation.</a> Curr Biol. , (2010).</li>
<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. N. uf <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> J Cell Biol. 182, 301-313 (2008).</li>
<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+actin-dependent+endocytosis+is+zygotically+controlled+to+initiate+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Local actin-dependent endocytosis is zygotically controlled to initiate Drosophila cellularization.</a> Dev Cell. 14, 775-786 (2008).</li>
<li>Fox, D. T., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abelson+kinase+%28Abl%29+and+RhoGEF2+regulate+actin+organization+during+cell+constriction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila.</a> Development. 134, 567-578 (2007).</li>
<li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+contractions+of+an+actin-myosin+network+drive+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457, 495-499 (2009).</li>
<li>Bertet, C., Sulak, L., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-dependent+junction+remodelling+controls+planar+cell+intercalation+and+axis+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation.</a> Nature. 429, 667-671 (2004).</li>
<li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Dev Cell. 11, 459-470 (2006).</li>
<li>Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip-cell+migration+controls+stalk-cell+intercalation+during+Drosophila+tracheal+tube+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation.</a> Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).</li>
<li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr Biol. 20, 359-366 (2010).</li>
<li>Gorfinkiel, N., Blanchard, G. B., Adams, R. J., Arias, M. artinez, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+global+cell+behaviour+during+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila.</a> Development. 136, 1889-1898 (2009).</li>
<li>Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+forces+timed+by+a+ratchet-like+mechanism+drive+directed+tissue+movement+during+dorsal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure.</a> Cell. 137, 1331-1342 (2009).</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).</li>
<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotically+controlled+F-actin+establishes+cortical+compartments+to+stabilize+furrows+during+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization.</a> J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).</li>
<li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).</li>
<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
</ol>

Protokol, burada, gelişmekte olan sinek embriyonun hücre şekil değişiklikleri bir dizi canlı, konfokal görüntüleme izin verecektir nitelendirdi. GFP stokları görüntüleme için ayrı bir laboratuvar (Tablo 2) tarafından hazırlanan, ancak pek çok hisse senedi de Indiana Üniversitesi&#39;nden (Bloomington Drosophila Menkul Kıymetler Merkezi olarak merkezlerinin halka açık <a href="http://flystocks.bio.indiana.edu">olabilir</a> http://flystocks.bio.indiana.edu) ve flytrap Yale Üniversitesi (Menkul Kıymetler <a href="...

<table><tbody><tr><td>Slaytlar</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Lamella 25x25</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 2-524C</td><td></td></tr><tr><td>Sıkmalı şişeler (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-897-11</td><td></td></tr><tr><td>50 ml'lik Falcon tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Küçük pipetler için ampuller, 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>Kapaklı sintilasyon şişeleri</td><td>VWR international</td><td>66021-533</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Corn Beherler, 100 mL</td><td>Elektron Mikroskopisi Bilimleri</td><td>60970</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Petri kabı 60x15mm </td><td>Fisher Scientific</td><td>08757 100B</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Hücre Süzgeci</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Sarı pipet uçları</td><td>Rainin</td><td>L200</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik tel örgü, 304, 12x24</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150-F-01</td><td></td></tr><tr><td>Cam 5&amp;#190; Pasteur Pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>P4 filtre kağıdı</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-803-6F</td><td></td></tr><tr><td>Lastikler</td><td>Office Max</td><td>A620645</td><td></td></tr><tr><td>Scotch çift taraflı bant, &amp;frac12; inç</td><td>Office Max</td><td>A8137DM-2</td><td></td></tr><tr><td>Robert Simmons Expression resim fırçaları E85 yuvarlak #2</td><td>Jerry&amp;rsquo;Sanal Tarama</td><td>56460</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Penset Yüksek Hassasiyetli Inox</td><td>Elektron Mikroskobi Bilimleri</td><td>72701-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Jiletler</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Halokarbon Yağı 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H 8773</td><td></td></tr><tr><td>Heptan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Agar</td><td>VWR international</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Sakroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>p-Hidroksibenzoik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Red Star Aktif Kuru Maya</td><td>LeSaffre</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>Kağıt havlu, C-katlamalı</td><td>Kleenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yüksek dayanımlı alüminyum folyo</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çamaşır suyu</td><td>Austin&amp;rsquo;A-1 Ticari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%100 Elma suyu</td><td>Ocean Spray veya Tree Top</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

living görüntüleme hücre Şekli değiştir drosophila embriyolar

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Gelişmekte olan Drosophila melanogaster embriyo konfokal görüntüleme yaşamak için son derece müsait olan hücre şekil değişiklikleri bir dizi uğrar. Hücre sinek şekil değişiklikleri, yüksek organizmalarda benzer olup, doku morfolojilerinden sürücü. Yani, birçok durumda, yaptıkları çalışmada insan hastalığı (Tablo 1) 1-5 anlamak için doğrudan etkisi vardır. Hücre alt ölçekte, bu hücre şekil değişiklikleri, gen ekspresyonu, sinyal iletimi, hücre polarite, iskelet remodeling ve membran ticareti değişen faaliyetlerinin ürünüdür. Böylece, Drosophila embriyo doku morfolojilerinden ile ilgili olarak hücre şekil değişiklikleri değerlendirmek bağlamında sadece sağlar, ama aynı zamanda şekil hücreleri, alt-hücresel faaliyetler çalışma tamamen fizyolojik bir ortam sunmaktadır. Burada açıklanan protokol görüntü cellularization denilen özel bir hücre şeklini değiştirmek için tasarlanmıştır. Cellularization, dramatik plazma membran büyüme bir süreç olduğunu ve sonuçta hücresel blastodermin sinsityal embriyo dönüştürür. Interfaz mitotik döngüsü 14 olduğunu, plazma zarı aynı anda birincil epitel hücrelerinin bir sayfa oluşturmak için her ~ 6000 cortically demirlemiş çekirdeklerinin etrafında invaginates. Sayaç önceki önerileri, cellularization Miyozin-2 kontraktilite 6 tarafından yönlendirilen değil, ancak bunun yerine büyük ölçüde iç mağazaları 7 zarının ekzositoz tarafından körüklenen . Böylece, cellularization sitokinez veya enine-borucuk (T-tübül) kas morfolojilerinden olarak plazma zarı invajinasyon veya genişleme gerektiren hücre şekil değişiklikleri sırasında membran kaçakçılığı eğitimi için mükemmel bir sistem. Bu protokol sinek embriyo diğer hücre şekil değişiklikleri görüntüleme kolayca uygulanır ve sadece embriyo toplama aşamasında, değiştirme veya belirli bir oryantasyon (Tablo embriyo monte etmek için &quot;embriyo tutkal&quot; olarak hafif uyarlamalar gerektirir olduğunu unutmayın 1) 8-19. Tüm durumlarda, iş akışı temelde aynıdır (Şekil 1). Klonlama ve Drosophila transgenesis için standart yöntemler, Yeşil Floresan Protein (GFP) veya türevleri erimiş bir ilgi protein ifade istikrarlı sinek stokları hazırlamak için kullanılan ve bu sinekler, embriyo yenilenebilir bir kaynak sağlamak . Alternatif olarak, floresan proteinleri / problar doğrudan sinek embriyolara 9-10 basit mikro-enjeksiyon teknikleri ile tanıtıldı. Sonra, gelişimsel bir olay ve görüntülü olarak hücre şekil değişikliği göre, embriyolar toplanan ve diseksiyon mikroskobu morfolojisi tarafından sahnelenen, ve son olarak konumlandırılmış ve zaman atlamalı bir konfokal mikroskop görüntüleme için monte edilmiş.

Meyve sineği Drosophila melanogaster, erken gelişimi iyi görüntüleme yaklaşımlar için uygundur hücre şekil değişiklikleri bir dizi ile karakterizedir. Bu makale, Drosophila embriyolar canlı konfokal görüntüleme için gerekli olan temel araçları ve yöntemleri tanımlamak ve cellularization denilen bir hücreye şeklini değiştirmek üzerinde durulacak.

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

Gelişmekte olan Drosophila melanogaster embriyosu, canlı konfokal görüntülemeye oldukça uygun olan bir dizi hücre şekli değişikliğine uğrar. Hücre şekli...

Bu prosedürün genel amacı, canlı drosophila embriyolarındaki hücre şekli değişimini görüntülemektir. Bu işlem, öncelikle GFP etiketli protein probları eksprese eden transgenik sinek stoklarının oluşturulması ve genişletilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise bu sineklerin embriyo toplama kaplarına aktarılmasıdır.Prosedürün üçüncü adımı embriyoların toplanmasıdır. Dördüncü adım, embriyonun kaplanması ve sabitlenmesidir. Sonuç olarak, sabitlenen embriyoların zaman ayarlı konfokal görüntülemesi ile hücresel düzeydeki hücre şekli değişiklikleri gibi sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin sabitlenmiş doku görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücre şekli değişikliklerinin dinamik yönlerinin canlı embriyolar bağlamında yakalanabilmesidir. Burada açıklanan yöntem yemekleğe özgü hale getirilmiş olsa da, ventral oluk oluşumu, germ bandı uzaması, trake ağenazisi ve dorsal kapanma gibi erken sinek gelişimine eşlik eden diğer hücre şekli değişikliklerine uyarlanabilir ve uygulanabilir. Bu tekniğe yeni başlayanlar, embriyoları diseksiyon mikroskobu altında manipüle etmeyi ve yerleştirmeyi genellikle zor bulurlar.Lisansüstü danışmanım Anna Marie Soki ve ben, bu prosedürü uygulamalı olarak göstereceğiz. Prosedür, embriyoları toplamak için bir kap hazırlayarak başlar; bir jilet kullanarak 100 mililitrelik tricorn beherinin alt kısmını kesin ve kenarın mümkün olduğunca pürüzsüz olduğundan emin olun. Kabın tutulmasını kolaylaştırmak için üst kısımdaki üç köşeyi kesin.Ardından, bir çeker ocak içerisinde çalışarak altı santimetreye altı santimetre boyutlarında bir tel örgü kare kesin. Önceden ısıtılmış bir sıcak tabla üzerine ağır hizmet tipi bir alüminyum folyo parçası yerleştirin ve alüminyum folyonun üzerine tel örgü kareyi koyun. Kabın kesilmiş alt kenarını sıcak tel örgünün üzerine sıkıca bastırın.Birkaç saniye bekleyin ve artık eleği tutan kabı kaldırın. Eğer folyo da yapışmışsa, onu soyun. Kabı gece boyunca bekletin ve ertesi gün kullanın.Fazla ağı makasla temizleyin ve keskin kenarları ince taneli zımpara ile törpüleyin. Bir sonraki adım, dişi sineklerin embriyo üretimini teşvik edecek olan bir maya ezmesi hazırlamaktır. Küçük bir kabı yaklaşık olarak eşit miktarda red star aktif kuru maya ve distile su ile doldurun ve maya çözünene kadar karıştırın.Macunun kıvamı ıslak fıstık ezmesine yakın olmalıdır. Maya macunu hazır olduğunda, elma suyu agar plaklarını dört santigrat derece sıcaklıktaki saklama alanından çıkarın. Elma suyu agar plaklarının nasıl hazırlanacağına dair açıklama, beraberindeki el yazması metinde yer almaktadır.Elma suyu plakalarını maya pastası ile ekim yapın ve plakaların oda sıcaklığına gelmesi için en az bir saat bekleyin. Dairesel filtre kağıdını ikiye katlayın. Ardından tekrar ikiye katlayın.Kağıdı sekiz ila dokuz santimetre çapında olacak şekilde kesin. Çeyrek daire şeklinde akordeon katlamalar yapın. Daireyi açın, ters çevirin ve ağa değene kadar bir toplama kabına yerleştirin.Kağıdın, sineklerin üzerine düşüp onları ezmemesi için kapta sabitlendiğinden emin olun. Şimdi sinekleri aktarma zamanı. Üremeleri için iki hafta süre tanınmış bir stok sinek şişesi alın. Bu şişede, bir embriyo toplama kabını doldurmaya yetecek miktarda, en az 50 dişi ve 30 erkek sinek bulunmalıdır.En iyi yumurtlama için, çıkımdan sonra beş günden daha az süre geçmiş sinekleri kullanın. Toplama kabını stok adı ve tarihle etiketleyin. Sineklerin bulunduğu şişeyi ters çevirin ve sinekleri kabın içine aktarmak için toplama kabının üzerinde nazikçe sallayın, ardından kabı hemen hazırlanmış bir elma suyu plakasıyla kapatın.Plakayı bir paket lastiği ile bardağa sabitleyin. Bardak ağzı tülbentle kapatılmış şekilde, doğrudan ışık alan bir alanda oda sıcaklığında bekletin. Sinekler karanlıkta iyi yumurtlamayacağı için bardağın üzerine gölge düşmediğinden emin olun. İki saat sonra, elma suyu plağını oda sıcaklığında toplama kaplarımıza yeni bir plakla değiştirerek embriyoları toplayın.Hücresel görüntüleme için uygundur. Ardından, embriyolar için bir montaj odası hazırlayın. Bunu yapmak için, iki ila üç santimetre uzunluğunda bir parça çift taraflı bandı kesin ve bandın uzun ekseni ile lamın uzun ekseni hizalanacak şekilde lamın üzerine yerleştirin.İki ila üç santimetre uzunluğunda ikinci bir çift taraflı bant parçası kesin ve kenarlarının hizalı olduğundan emin olarak diğer bant parçasının üzerine katman şeklinde yerleştirin. Bir jilet kullanarak, bandın merkezinde ve lamın uzun eksenine dik olacak şekilde, aralarında yaklaşık üç milimetre mesafe bulunan iki kesik atın. Bir kanal oluşturmak için kesikler arasındaki bandı çıkarın ve kanala bir pipet damlası halo carbon 27 yağı damlatın.Bu kanal, embriyoların yerleştirileceği yerdir. Elma suyu plakasını 50% çamaşır suyu ile 30 ila 60 saniye boyunca kaplayarak embriyoları kaplayın. Embriyoları bir hücre süzgecine toplayın ve püskürtme şişesinden gelen distile su ile kuvvetlice yıkayın.Süzgeci kağıt havlu ile kurulayın. Kaplı 10 ila 50 embriyoyu, maya macunu içermeyen temiz bir elma suyu plağına aktarmak için nemli bir boya fırçası kullanın. Suyu bir kağıt havlunun yırtık kenarıyla emdirin ve embriyoları derhal az miktarda halo karbon 27 yağı ile kaplayın.Elma suyu plağını, transmisyon ışığı kullanan bir disseksiyon mikroskobuna taşıyın. Embriyoları, belirlenen morfolojik kılavuzlara göre evreleyin. Pens kullanarak, dördüncü evreye karşılık gelen beş adet mitotik döngü 11 veya 12 embriyosunu montaj odasının kanalına aktarın.Embriyoları, dorsal ve ventral tarafları görünecek ve lateral tarafları aşağıya bakacak şekilde bir hat üzerine dizin. Embriyolar, sadece yağ içerisinde bu oryantasyonda kolayca düzenlenebilir. Embriyoların birbirine çok yakın olmaması için, aralarında en az yarım embriyo boyu kadar boşluk bırakın.25 by 25 milimetrelik bir lamellenin bir kenarını, lamellenin bir kenarını bandın bir kenarıyla hizalayarak kanalın bir yanındaki çift taraflı bandın üzerine yerleştirin. Lamelleyi kanalın üzerini kapatacak şekilde indirin. Lamellenin altında hava kalmışsa, lamelin kenarına az miktarda yağ uygulayın.Kılcal hareket yağı kanalın içine çekecek ve havayı dışarı itecektir. Montaj haznesini konfokal mikroskoba yerleştirin ve transmisyon ışığı ile embriyoları bulun. Ardından, embriyonun ortasına yakın tek bir düzlemde hücresel görüntüleme için ilgilenilen bir bölgeye odaklanmak üzere konfokal görüntülemeye geçin.İnvajinasyon dinamiklerini takip etmek için, zaman ayarlı görüntülemede 30 ila 62. aralıkları kullanın. Görüntüleri elde ettikten sonra, bunları NIH'in ImageJ adlı ücretsiz yazılım paketi gibi bir görüntü analiz paketi kullanarak analiz edin. Veriler daha sonra filmler, diziler veya CH grafikleri şeklinde sunulabilir. Hücresel olan dışındaki bir hücre şekli değişimini görüntülemek için, embriyoların yalnızca yağ içerisinde kolayca korunamayacak belirli bir yönelimde monte edilmesi gerekebilir.Bunu yapmak için, daha önce açıklanandan farklı bir montaj yöntemi kullanın. Bir tüp içerisinde 20 santimetre çift taraflı bandı 250 microliters heptan ile birleştirerek embriyo yapıştırıcısı hazırlayarak başlayın. Bu izolasyon tüpünü bir çalkalayıcıya veya döner platforma yerleştirin ve gece boyunca karıştırın.Ertesi gün, sarı bir pipet ucunu embriyo yapıştırıcısına daldırın ve ardından embriyo yapıştırıcısındaki heptan buharlaşırken pipet ucunu bir lam boyunca sürükleyerek bir yapıştırıcı izi bırakın. Hazırlanan embriyoları, görüntüleri alınacak yüzeyi agara bakacak şekilde bir agar bloğu üzerine hizalayın. Örneğin, hücre şekli değişimini görüntülemek için.Farrow oluşumu sırasında, embriyoları ventral tarafları agara bakacak şekilde yerleştirin. Embriyo yapıştırıcısı bulunan lamı ters çevirin ve yapıştırıcı şeridini agar bloğundaki embriyolara karşı nazikçe bastırın. Şimdi lamı tekrar ters çevirin.Embriyoların çoğu, uygun yönelimde lam üzerine sabitlenmiş olmalıdır. Ardından, embriyoların her iki yanına iki kat çift taraflı bant ekleyin. Bunları halo carbon 27 yağı ile kaplayın ve bir lameli yerleştirin.Embriyolar artık görüntüleme için hazırdır. Bu fotoğraflar, dorsal ve ventral tarafları net bir şekilde görülecek şekilde yerleştirilmiş hücresel embriyoların zaman atımlı görüntülerini göstermektedir ve görüntüleme orta bölgelerine yakın bir yerden yapılmıştır. Kesit görüntülerindeki plazma membranı invajinasyonlarını takip edebilmek için, burada gösterilen embriyo, plazma membranı invajinasyonlarının uçlarında yoğunlaşan bir GFP myosin two probu eksprese etmektedir. Bu ön cephenin zaman içindeki ilerlemesini takip etmek, plazma membranının invajinasyon hızını verir; sıfırıncı dakika zaman noktası hücresel başlangıca, 56. dakika zaman noktasının hemen sonrası ise embriyonun ventral tarafında gastrülasyonun başlamasına karşılık gelir.Hücrelerin bu zaman atlamalı videosu, önceki mitotik döngüde (13.) başlatılarak yalancı bölünme ve oluk gerilemesini yakalamış ve embriyonun ventral tarafında gastro hareketleri görülene kadar devam etmiştir. Uzmanlaşıldığında, uygun şekilde gerçekleştirilirse montaj ve görüntüleme 60 ila 90 dakika içinde tamamlanabilir. Elbette, embriyo toplama işlemi ek süre gerektirir ve montaj ile görüntüleme ile koordineli şekilde yürütülmelidir.Bu prosedürü uygularken, embriyo sağlığını korumak için mümkün olan her şeyin yapılması önemlidir. Örneğin, embriyoları aşırı dereyde ağartmayın ve bu prosedürü takiben görüntüleme yaparken lazer maruziyetini sınırlayın. Belirli bir hücre şekli değişimine eşlik edenle sitoiskelet ve membran dinamikleri nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için fotobleyçleme (photo bleaching) ve foto-anahtarlama (photo switching) gibi daha gelişmiş görüntüleme teknikleri kullanılabilir.

imaging-cell-shape-change-in-living-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar

Burada apoptotik hücre boşluk dinamikleri eğitim için etkili bir yöntem...

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

Bu kağıdı doğrudan puparium aracılığıyla görüntü hücre davranışı hızlı bir tarama konfokal mikroskop kullanımını gösterir. Sağlam pupa davayı bırakarak, bu yöntem doğrudan çalışma zordur Drosophila bir gelişme aşamasında gözlem ve dinamik hücre süreçlerinin ölçülmesini sağlar.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Burada, Drosophila gastrulasyonunun canlı görüntülerini yakalamak için bir prosedürü açıklıyoruz. Bu, erken gelişimde yer alan apikal daralmayı daha iyi anlamamızı ve doku yapısı modifikasyonu sırasında hücresel hareketleri yöneten mekanizmaları daha fazla analiz etmemizi sağladı.

Hücre Şekli Alteration ve Hücre Hareketi Görüntüleme Drosophila Gastrulasyon kullanarak DE-kaderin Muhabir Transgenik Sinekler

Bu protokol, meyve sineği metamorfoza uğrarken Drosophila abdominal epitelde hücre oryantasyonu ve doku büyüme dinamiklerinin görüntülenmesi ve analizi için tasarlanmıştır. Burada açıklanan metodoloji Drosophila veya diğer model organizmalarda farklı gelişimsel aşamaların, dokuların ve hücre altı yapıların incelenmesine uygulanabilir.

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Bu protokolün amacı, Rhodamine konjuge globüler aksini Drosophila embriyolarına enjekte etmek ve ısı stresini takiben intranükleer aksin çubuk tertibatını görmektir.

Canlı Isı Stresli Drosophila Embriyolarında İntranükleer Akin Çubuklarının Görüntülenmesi

Bu protokol, geleneksel GFP/mCherry etiketi yaklaşımları kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların canlı görüntülenmesini sağlamak için özelleştirilmiş antikor bazlı floresan etiketlemeyi ve erken Drosophila embriyolarına enjeksiyonu açıklar.

Floresan Antikor Enjeksiyonu ile Canlı Drosophila Embriyolarında Düşük Bolluktaki Proteinlerin ve Translasyon Sonrası Modifikasyonların Görselleştirilmesi

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Burada, pupa evresinde Drosophila bacağının uzun süreli canlı görüntülenmesi için pupariumun tamamen çıkarılmasını içeren bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol diğer dokulara da uygulanabilir.

Puparium çıkarıldıktan sonra Drosophila pupa bacak gelişiminin uzun süreli canlı görüntülenmesi

Öğrenin canlı konfokal görüntüleme yöntemiyle Drosophila embriyolarında hücre şekli değişimlerini gözlemleme tekniklerini. Bu protokol gelişim biyolojisi araştırmalarında dinamik süreçleri gerçek zamanlı izlemeyi mümkün kılar.

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

Daha fazla video keşfet