Assaying Lokomotor, Öğrenme ve Hafıza Açıkları. Drosophila Nörodejenerasyon, modeller

Prosedürün genel amacı, yetişkin Drosophila melanogaster'da öğrenme ve belleği incelemektir; ancak öncelikle sineklerin lokomotor defisitler yaşayıp yaşamadığı belirlenir. Sinekler, negatif geotaksi testiyle test edilir. Ardından, sineklerin bir T-labirente yerleştirilmesi ve tercih edilen aydınlık bölmeye doğru hareket etme süresinin kaydedilmesiyle pozitif fototaktik davranış doğrulanır.

Pozitif fototaksi gösteren sinekler daha sonra, aydınlık bölmeyi kininin acı tadıyla ilişkilendirmek üzere koşullandırılır. Son aşamada, sineklerin itici uyarıcıyı aydınlık bölmeyle ne kadar iyi ilişkilendirdikleri test edilerek öğrenme ve hafıza ölçümü sağlanır. Ola, X laboratuvarına hoş geldin.

Bugün size, drosophila'da nörodejenerasyonu incelemek için yaygın olarak kullanılan iki davranışsal testi göstereceğiz. İlk olarak, laboratuvarımızda lisans öğrencisi olan Wil Fredo Sala ve benim tarafımdan sunulacak olan itici fototaksi baskılama testi, ardından laboratuvarımızda lisansüstü öğrencisi olan Kaiwan tarafından sunulacak olan negatif geotaksi testi gösterilecektir. Sinekleri, 25 °C'de, 12 saatlik ışık-karanlık döngüsünde, standart mısır unu agar melas maya besiyerinde tutun.

Oklüzyon günü, bakire sinekleri 20'şerli gruplar halinde ayırın. Bakire sinekler, açık renklerinden ve abdomenlerinin alt kısmında bulunan koyu yeşilimsi bir lekeden ayırt edilir. Sinekler her üç günde bir taze bir viyale aktarılmalı ve genetik arka planlardan kaynaklanan farklılıkları en aza indirmek için kardeş sinekler kullanılmalıdır.

Bir geo taksis çalışmasında, genotip veya işlem başına 10 ila 20 grup test edilmelidir. Başlamak için dişi ve erkek sinekleri 10'arlı gruplara ayırın. Bu sinekler ayrı ayrı test edilmelidir.

Davranış cinsiyetten önemli ölçüde etkilendiği için, lokomotor aktivitenin bozulmadığından emin olmak adına anestezi sonrası işleme geçmeden önce en az bir saat bekleyin. Sinekler tamamen hazır olduğunda, iki boş polistiren tüpün ağızlarını, tüpleri dikey olarak alt tüpün üzerine birleştirerek hizalayın.

Alttan sekiz santimetre ölçün ve çevre boyunca bir daire çizin. Düzenek kurulduğuna göre, 10 sineklik bir grubu alt tüpe aktarın. Tüpleri hemen tekrar birleştirin ve testten önce sineklerin bir dakika boyunca adapte olmasını sağlayın.

Sinekler yerleştikten sonra, onları nazikçe tüpün tabanına vurun ve 10 saniye içinde sekiz santimetre işaretinin üzerine çıkan sinek sayısını ölçün. Her gruptan bu işareti geçen sinek sayısı, toplam sineklerin yüzdesi olarak kaydedilir. Sineklerin denemeler arasında bir dakika dinlenmesine izin vererek bu prosedürü her grup için 10 kez tekrarlayın.

Bir PS analizinden altı saat önce, dişi sinekleri suyla nemlendirilmiş filtre kağıdı içeren polistiren tüplere ayırın. Bu adım, sineklerin aç kalmasını ve itici tada karşı daha hassas hale gelmesini sağlar. Bu analizde, kinin çözeltisi itici uyaran olarak kullanılır.

0,1 molar stok çözeltiden bir mikromolar konsantrasyonda bir çalışma çözeltisi hazırlayın. T labirenti; kapan kapaklı bir merkez sütunu ile bir karanlık oda ve bir aydınlık oda şeklinde iki yan odadan oluşur. İki milimetre işaretinden, 15 mililitrelik iki plastik santrifüj tüpünün kapalı uçlarını manuel bir testere ile kesin; her iki uca konnektör adaptörleri takın ve bağlantıyı parafilm ile sızdırmaz hale getirin.

Karanlık bölme olarak kullanmak için bir tüpü alüminyum folyo ile sarın. Aydınlık ve karanlık bölmeleri merkez sütunun her iki yanına vidalayarak TMAs'ları monte edin. Ortadaki kapak kapalıyken, ışık kaynağını doğrudan aydınlık bölme adaptörüne bağlayarak kurulumu tamamlayın. Analizi gerçekleştirmeden önce, 10'lu gruplar halindeki her bir sineği boş bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve kaçmalarını önlemek için kapağı hafifçe kapatın.

Ardından, karanlık bölmeyi TMA'lardan sökün. Tüpe tek bir sinek aktarın ve tüpü hemen labirente geri yerleştirin. Odadaki ışıkları kapatın ve kırmızı bir lambayı açın.

Sinenin karanlık bölmede 30 saniye boyunca aklimatize olmasına izin verin ve ardından aydınlık bölmeyi aydınlatan ışık kaynağını yavaşça açın. Işık açıldıktan sonra, iki bölmeyi birbirinden ayıran tuzak kapağını açın. Sinek 10 saniye içinde aydınlık bölmeye yürürse, pozitif fototaktik olarak kabul edilir ve eğitilmeye hazır hale gelir.

Bu şekilde yanıt verilmemesi, görsel sistemde bir soruna işaret eder ve deneyden çıkarılmayı gerektirir. Pozitif fototaksis onaylandığında, 32 saniyelik bir dinlenme süresi boyunca sineği hafifçe vurarak karanlık bölmeye geri gönderin, kapan kapısını kapatın ve ışığı söndürün. Filtre kağıdını aydınlatılmış bölmeye yerleştirerek ve filtre kağıdının üzerine bir mililitre kinin çözeltisi pipetleyerek kaçınma uyaranını hazırlayın.

Tüm filtre kağıdının itici uyaranlarla tamamen nemlendirildiğinden emin olun. Koşullandırmaya başlamak için kapan kapısını yavaşça açın ve ışığı yakın. Sineğin kinin kokulu aydınlatılmış bölmeye yürümesine izin verin.

Bir dakika sonra, sineği tekrar karanlık bölmeye doğru vurun. Toplam 10 koşullanma denemesi için bu işlemi dokuz kez tekrarlayın. Genellikle, eğitilmiş sinekler eğitimden hemen sonra, üç ila beş eğitim denemesinin ardından aydınlık bölmeden kaçınırlar.

Beş test denemesi gerçekleştirin. Eğitilen sinek 10 saniye içinde haznenin ışığına doğru yürümezse, bu durum bir geçiş olarak kaydedilir. Beş ardışık deneme üzerindeki geçiş oranı kaydedilir ve belirlenir.

PC sıfır. Eğitim ve başlangıç PC sıfır kayıtlarından sonra, her sinek kendi numaralı orijinal besin dosyasına geri yerleştirilir ve altı saat boyunca bekletilir. Eğitimden altı saat sonra, daha önce gösterildiği gibi beş ek test denemesi gerçekleştirilir; bu geçme oranı PC altıyı temsil eder ve kısa süreli belleğin bir ölçüsüdür.

Negatif geotaksi deneyinde, sekiz santimetre işaretini geçen sineklerin sayısı bir yüzdeye dönüştürülür ve tırmanma geçiş oranı olarak sunulur. Sağda görüldüğü üzere 10 deneme boyunca, insan tau proteinini aşırı eksprese eden 10 günlük erkek veya dişi sinekler, soldaki yaş eşli GFP aşırı eksprese eden sineklere kıyasla belirgin lokomotor eksiklikler göstermektedir.

Aversif fototaksi baskılama deneyindeki performans, ortalama geçme oranı veya başarılı kaçınma denemelerinin yüzdesi ile temsil edilir. Sağda gösterilen tau aşırı eksprese eden sinekler, toplam denemeler üzerinden değerlendirildiğinde, hem eğitimin hemen ardından hem de altı saat sonra yapılan testlerde, soldaki kontrol grubuyla karşılaştırıldığında ışığı acı bir tatla ilişkilendirmekte yetersiz kalmaktadır. Bu prosedürün ardından, morfolojik farklılıklar hakkındaki ek soruları yanıtlamak amacıyla immünohistokimyasal analiz için örnekler alınabilir. Bu videoyu izledikten sonra, sineklerde öğrenme ve hafızanın nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Ve unutmayın, her şey sizinle ilgili.