Name: Assaying Lokomotor, Öğrenme ve Hafıza Açıkları. Drosophila Nörodejenerasyon, modeller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Öğrenin Drosophila melanogaster'da lokomotor fonksiyonları, öğrenme ve hafıza değerlendirmek için negatif geotaksi ve aversif fototaksi baskılama testlerini. Bu yöntemler nörodejenerasyon modellerinde davranışsal analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar T-labirent ve davranış oda Dr Charles Luetje teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (YA), Nörolojik Bozukluğu Ulusal Enstitüsü ve Stroke Hibe R01NS64269 (RGZ) ve Pew Charitable Trust (RGZ) tarafından desteklenmektedir.

1. Giriş Bu video, Drosophila kullanarak ölçüm hareketlilik ve nörodejeneratif hastalıkların tehlikeye öğrenme ve hafıza fonksiyonları göstermek için iki davranış testleri gösterecektir. Öncelikle, lokomotor davranışları olumsuz geotaxis tahlil kullanarak nasıl ölçülebilir gösterecektir. İkincisi, biz olumlu-phototactic sinekleri caydırıcı bir acı tadı ile ışık ilişkilendirmek için eğitilmiş ve daha sonra bellek fonksiyonları değerlendirmek için 6 saat sonra test kullanarak öğrenme ve hafıza yetenekleri değerlendirir. Son olarak, bu davranış testlerinin sonuçları ve sınırlamalar ele alınacaktır. 2. Ekipman ve Reaktifler <ol><li> Çalışmak Fly <ul><li> Stereo kapsamı (Zeiss) </li><li> Sinekler itmek için küçük boya fırçaları </li><li> Drosophila karbondioksit (CO 2) anestezi cihazları (Geneseesci, Inc.) </li></ul></li><li> Negatif Geotaxis Testi <ul><li> 28.5 x 95 mm Polistren Flakon (Capitol şişe, Inc.) </li><li> Mini Alarm Timer / Kronometre (VWR Uluslararası) </li><li> Sharpie kalem </li><li> Yapıştırıcı Bant </li></ul></li><li> Caydırıcı Phototaxis Bastırılması Testi <ul><li> Kinin hidroklorür (Sigma Aldrich; CAS numarası: 6119-47-7) </li><li> Distile Su </li><li> Ağırlık olarak hassas seyreltme için dijital ölçme skalası </li><li> Hızlı kes Konnektörler, Yüksek Yoğunluklu Polietilen (Nalgene VWR Katalog No 62.868-021) </li><li> Hızlı kes Connector adaptör ile ışık kaynağı için uygun kapalı sonundan itibaren 2 mL işaretine kesilmiş 15 ml Santrifüj Tüpü (VWR International), </li><li> Tek kanallı odasına astar filtre kağıdı üzerine kinin çözüm yüklemek için 200 mcL pipetter </li><li> T-Labirent (Basit Davranış Sistemleri; Şekil 1) </li><li> Alüminyum Folyo </li><li> Işık Kaynağı (Zeiss) </li><li> Kırmızı ışık olan bir lamba. </li><li> Filtre Kağıdı </li><li> Mini Alarm Timer / Kronometre (VWR Uluslararası) </li></ul></li></ol> 3. Sinekler hazırlanması <ul><li> Sinekler, 25 standart mısır unu-agar-pekmez-maya ortamda tutulur ° C, 12 saat ışık / karanlık döngüsü. </li><li> Virgin sinekler eclosion gün karbondioksit anestezi altında izole edilmiştir. Yaşlanma çalışmalar için, sinekler vialde yirmi gruplar halinde tutulur ve her 3 günde bir, taze bir flakon transfer. Genetik kökenden kaynaklanan farkları en aza indirmek için, yaşlanma çalışmaları için aynı ebeveyn çapraz kardeş sinekler kullanmak önemlidir. </li><li> Her ikisi için deneyleri, sinekler vialde on sinekler gruplar halinde cinsiyetli ve korunur. Cinsiyet farkı davranışı üzerinde önemli ve veri 6 yorumlamak ve üremek için zor olabilir bir çalışmada, dişi ve erkek sineklerin karıştırmak için tavsiye edilir. </li><li> Negatif geotaxis testi için, sinekler vialde on gruba sıralanır ve anestezi sonrası bir saatlik test. Bu lokomotor faaliyetleri üzerinde etkisi olabilecek bir sinek anestezi tamamen kurtarmak için çok önemlidir. </li><li> APS testi için, her grubun sinekler tahlil yapılmadan önce, altı saat boyunca filtre kağıdı nemlendirilmiş bir, boş polistiren şişe su ile yerleştirilir. Bu sinekler tahlil önce açlıktan ve caydırıcı bir tat daha duyarlı olacağını garanti eder. Tahlil yapılır hemen önce, on bir grup her sinek sonra kaçmayı önlemek için, gevşek kapatılmış boş bir 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirilir. </li></ul> 4. Negatif Geotaxis Testi <ul><li> Geotaxis genellikle aynı genotip veya tedavi (100-200 sinekler her genotip / tedavi için toplam) 7 on kişiden on ila yirmi gruplar için ölçülür. Her grup ayrı bir flakon CO 2 anestezi aparatı ve yerde on kadın ya da erkek sineklerin göre gruplar. Anestezi kurtarmak için sinekler için en az bir saat izin verin. </li><li> Her grup için iki boş polistiren şişeleri dikey olarak birbirine bakacak şekilde bant katıldı bu tür tırmanma aparatı, hazırlayın. Şişeleri açıklıklar mükemmel bile tırmanma sinekler için bir yüzey sağlamak için birbirleri ile uyumlu olduğunu emin olmak için çok önemlidir. </li><li> Alt flakon için, 8 cm alt yüzeyi üzerinde dikey bir mesafe ölçmek ve her flakon flakon tüm çevresinde bir daire çizerek işaretlemek. </li><li> On sineklerin bir grup dikkatli bir şekilde herhangi bir sinek kaçmasını engelleyen düşük şişenin içine aktarın. Hemen alt flakon güvenli iletişime açıklıklar yakın üst şişe ve bant ile kaplayın. Sineklerin tahlil yapmadan önce 1 dakika için yeni bir ortam için iklime alıştırmak için izin verin. </li><li> Yavaşça flakonun alt sinekler dokunun ve musluk 10 saniye sonra 8 cm işareti üzerine tırmanmaya sineklerin sayısı ölçmek. </li><li> Her deneme arasında 1 dakikalık dinlenme süresi için izin veren bu testte, aynı grup on kez tekrarlayın. </li><li> Olarak 8 cm aştı grup başına sineklerin numarasını kaydedin.toplam sinekler yüzdesi. </li></ul> 5. Caydırıcı Phototaxis Bastırılması Testi (APS Testi) Le Bourg ve Buecher (2002) 4 adapte caydırıcı stimuli (Bu durumda, kinin acı bir tat) ışık ilişkilendirmek için onları eğitmek için, bu testte pozitif phototactic davranış sinekler patlatır. Bir eğitim / Klima aşamasından sonra, vahşi tip sinekleri caydırıcı bir tat ile ışıklandırılmış alan doçent ve bunu önlemek mümkün olacaktır. Sinekler tehlikeye öğrenme kapasiteleri ile bu dernek yapmak için başarısız olacak. Ayrıca, APS testi de kısa süreli hafıza fonksiyonu ölçmek için kullanılan öğrenilen görev hatırlayarak kendi yeteneğini test etmek için aynı test sonrası 6 saat klima zaten eğitimli sinekler tabi 5 uçar. <ol><li> Kinin Çözüm hazırlanması <ul><li> 0.1M stok solüsyonu (50ml distile su 1.98g) yapmak için kinin hidroklorür distile su ile çözülür. Stok solüsyonu küçük alikotları -20 ° C'de bir yıl kadar muhafaza edilebilir </li><li> Stok solüsyonu distile su ile seyreltilmesi ile 1 mcM bir çalışma çözeltisi hazırlayın. </li></ul></li><li> T-Labirent hazırlanması <ul><li> T-labirent tuzak kapı ve iki bağımsız odaları, bir "karanlık" odasına ve bir "ışıklı" odası (Şekil 1) ile orta sütun oluşur. </li><li> Odası hazırlık: iki 15 mL plastik santrifüj tüplerine almak ve alttan 2 mL işaretine kesilmiş bir kılavuz ile sona kapalı gördüm. Her iki ucunda konnektör adaptörleri Fit ve parafilm ile bağlantı mühür. Tüp sonunda adaptör Gooseneck ışık kaynağı için giriş yuvası olarak hizmet vermektedir. Işık kaynağı ile bir tüp bağlayın ve bu tüp "ışıklı" odasına olacaktır. "Karanlık" odası olarak hizmet etmek için diğer tüp, alüminyum folyo ile sarın. </li><li> Distile su veya hafif odasında kağıt ve filtre kinin çözüm ya 180uL ekleyin. </li><li> Tuzak kapı ile orta kapalı (Şekil 1), orta sütun her iki tarafta ışıklı ve karanlık odaları vidalama T-labirent birleştirin. </li><li> Işıklı odasına ışık kaynağı yerleştirin. </li></ul></li><li> Eğitim caydırıcı stimuli phototaxis bastırmak için uçar <ul><li> Sökün T-labirent karanlık odası ve bu odanın içine bir sinek transferi ve hemen geri labirent karanlık tüp vidalı. </li><li> Oda ışıkları kapatın ve kırmızı lamba açmak. </li><li> 30 saniye boyunca karanlık odasında sinek iklime alıştırmak ve yavaş yavaş ışıklı odasının aydınlatan ışık kaynağı açmak için izin verin. Yavaş yavaş iki odadan ayıran tuzak kapı açın. </li><li> Anında 10 saniye içinde ışıklı odasına doğru yürür, olumlu phototactic olarak kabul edilir ve tahlil için eğitimli olmaya hazır. Phototaxis başarısızlık görsel sistem sorunları gösterir ve testte negatif phototaxis hariç gerekir ile uçar. </li><li> Caydırıcı Phototaxis Bastırılması (APS) eğitimi için, karanlık odaya geri olumlu phototaxis gösterdi sinek dokunun tuzak kapağını kapatın ve ışığı kapatın. Acclimatizing 30 saniye bekleyin. Bu süre zarfında ışıklı odasına kinin çözümü ile filtre kağıdı koydu. Yavaş yavaş tuzak kapı açmak ve ışığı açın. Kinin kaplı ışıklı odasının içine sinek yürüyüş izin verin. Bir dakika sonra, karanlık odaya geri sinek dokunun ve bu 9 kez daha tekrarlayın. (Tipik olarak, vahşi tip 3 ila 5 eğitim denemeden sonra ışıklı odasının önlemek uçar.) </li><li> Eğitim hemen sonra, beş test eden çalışmalar yapılacaktır. Her test çalışmasında, ışık ışıklı odasına yürümeye eğitimli sinek açıldığında 10 saniye sonra izin verir. Işıklı flakon yürüyerek yapılmaması "güçlendirme yoluyla öğrenilen görev" eşdeğer "Pass" olarak kaydedilecektir. Pass oranı beş çalışmalarda üzerinde kaydedilir ve Şekil 2 PC0 (0 saat yazılan klima) olarak aşağıda gösterilmiştir. </li></ul></li><li> Sinekler Kısa Süreli Bellek Fonksiyonu değerlendirilmesi <ul><li> Eğitim ve ilk PC0 kayıtları sonra, her sinek orijinal gıda şişenin içine geri yerleştirilir ve altı saat boyunca bir kenara tuttu. </li><li> Altı saat eğitim, konu her anında, önce olduğu gibi aynı şekilde yine 5 çalışmalarda, ve kaç kez sinek (başarısız) ışıklı flakon önler (geçer) veya gider kaydı. Bu başarı oranı, kısa süreli hafıza bir göstergesi PC6 (6 saat klima), olarak kaydedilir. </li></ul></li></ol> 6. Veri Yorumlama ve İstatistiksel Analiz <ol><li> Negatif Geotaxis Testi <ul><li> Bu testte elde edilen ham veriler, her grupta 10 saniye içinde 8 cm işareti geçiş sinek sayısını temsil eder. Yüzdesi bu dönüştürme ve 10 seans üzerinden her grup için ortalama başarı oranı hesaplamak. </li><li> Veriler, ortalama standart hata (SEM) ile grup başına ortalama bir başarı oranı (genotip, tedavi vb.) Olarak grafiksel olarak temsil edilmektedir. </li><li> Gruplar arasındaki farklarsonra istatistiksel olarak anlamlı veya Öğrenci T-testi ve ANOVA kullanarak tespit edilebilir. </li></ul></li><li> Caydırıcı Phototaxis Bastırılması Testi <ul><li> Bu testte elde edilen ham veriler, beş ardışık çalışmalarda her anında ışıklı odasının önler sayısını olarak temsil edilmektedir. Başarı oranı, toplam çalışmalarda üzerinde başarılı kaçınma çalışmaların yüzdesi olarak hesaplanır. 15 sineklerin grup başına en az bu şekilde ortalama başarı oranı hesaplayınız. </li><li> Ortalama başarı oranı PC6 (6 saat klima, "bellek" göstergesi) ilgili SEM ile Veri grafiksel ortalama başarı oranı PC0 ("öğrenme" göstergesi Klima hemen sonra) olarak temsil edilmektedir. </li><li> Öğrenme ve hafıza endeksleri, vahşi tip ve "genetik olarak manipüle-iyi huylu" grubu (GFP eksprese uçar gibi) uygun hem gruplar arasında karşılaştırıldı. </li></ul></li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Bu video deneyde, merkezi sinir sistemi sinek eksprese insan Tau öğrenme ve hafıza ve motor açıkları değerlendiren ve bu sinekler eksprese GFP performanslarını karşılaştıran. Drosophila insan Tau Nöronal aşırı ekspresyonu, 8 beyin ciddi vakuolizasyon neden ve öğrenme ve hafıza fonksiyonları 9 önemli eksiklikler yol gösterilmiştir . Şekil 2A gösterildiği gibi, 10 gün yaşlı kadın ya da erkek, uçar eksprese insan Tau yaş olarak eşleştirilmiş GFP eksprese kıyasla önemli lokomotor açıkları uçar. Buna ek olarak, bu sinekler PC0 başarı oranı kontrol grubuna göre gösterildiği gibi, acı tadı ile ışık ilişkilendirmek için başarısız gibi bir düşüş PC6 başarı oranı (Şekil 2B) tarafından gösterildiği gibi bu ilişkiyi hatırlamak için başarısız. Bu deney, daha fazla insan nörodejeneratif koşulları eğitim ve insanlar ve memelilerde görülen bazı davranışsal fenotipleri yansıtan Drosophila modelleri için kullanılabilir doğrular . <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Caydırıcı Phototaxis Bastırılması Testi T-Labirent Kurulum A. Sol (folyo ile kaplanmış) ve "karanlık" boru filtre kağıdı ile kaplı bir tuzak kapı ile ayrılmış "ışıklı" şahin tüp, bağlı ışık kaynağı ile APSA deney için genel bir deney düzeneği. B. eğitim ve test aşamasında, sinek karanlık bir odasında ışık ışıklı odasında açıldıktan sonra tuzak kapı açıldı. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Temsilcisi kullanarak negatif geotaxis ve APS deney sonuçları, bir pan-nöronal sürücüsü ile eksprese GFP veya Tau uçar . Negatif geotaxis tahlil, 10-günlük yaşında erkek (mavi sütun) veya kadın (kırmızı sütun) eksprese GFP Tau-eksprese uçar daha yüksek tırmanma faaliyet gösterdi uçar. B. 20-günlük yaşında kadın eksprese GFP (PC6) işlevleri Tau eksprese uçar daha iyi öğrenme (PC0) ve bellek gösterdi uçar.

<ol><li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annual Review of Neuroscience. 26, 627-656 (2003).</li>
<li>Lloyd, T. E. &amp, Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li>
<li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+mutants+of+Drosophila+isolated+by+countercurrent+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 58, 1112-1119 (1967).</li>
<li>Le Bourg, E., Buecher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learned+suppression+of+photopositive+tendencies+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Learning+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Learned suppression of photopositive tendencies in Drosophila melanogaster.</a> Animal Learning & Behavior. 30, 330-341 (2002).</li>
<li>Seugnet, L., Suzuki, Y., Stidd, R., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aversive+phototaxic+suppression%3A+evaluation+of+a+short-term+memory+assay+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Aversive phototaxic suppression: evaluation of a short-term memory assay in Drosophila melanogaster.</a> Genes Brain Behav. 8, 377-389 (2009).</li>
<li>Nilsen, S. P., Chan, Y. -B., Huber, R., Kravitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender-selective+patterns+of+aggressive+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12342-12347 (2004).</li>
<li>Leal, S. M., Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evidence+for+GABAergic+regulation+of+specific+behaviors+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evidence for GABAergic regulation of specific behaviors in Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 50, 245-261 (2002).</li>
<li>Wittmann, C. W., Wszolek, M. F., Shulman, J. M., Salvaterra, P. M., Lewis, J., Hutton, M., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tauopathy+in+Drosophila%3A+Neurodegeneration+Without+Neurofibrillary+Tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tauopathy in Drosophila: Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles.</a> Science. 293, 711-714 (2001).</li>
<li>Mershin, A., Pavlopoulos, E., Fitch, O., Braden, B. C., Nanopoulos, D. V., Skoulakis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+deficits+upon+TAU+accumulation+in+Drosophila+mushroom+body+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Learning and memory deficits upon TAU accumulation in Drosophila mushroom body neurons.</a> Learn Mem. 11, 277-287 (2004).</li>
<li>Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+Suppression+Involving+Behavioral+Mutants+with+Altered+Nerve+Excitability+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Indirect Suppression Involving Behavioral Mutants with Altered Nerve Excitability in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 100, 597-614 (1982).</li>
<li>Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholinesterase+mutants+in+Drosophila+and+their+effects+on+the+structure+and+function+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Acetylcholinesterase mutants in Drosophila and their effects on the structure and function of the central nervous system.</a> J Comp Neurol. 189, 741-774 (1980).</li>
</ol>

Lokomotor veya genetik ya da çevresel manipülasyon kaynaklanan öğrenme ve bellek kapasiteleri değişiklikleri ölçmek için sağlam bir davranış testleri negatif geotaxis ve APS testlerin her ikisi de. Ancak, daha fazla optimizasyon bekliyor bu testlerin bazı dezavantajları vardır. Negatif geotaxis tayininde, belirli genlerdeki mutasyonlar, sinekler ağır motor işlev bozuklukları hale getirebilir. Bu gibi durumlarda, sinekler neredeyse ajitasyon üzerine ağırlık yanıt duvarlara tırmanmaya. Diğer davranış testleri doğrudan hareketini ölçmek daha uygun olabilir. Bu testleri, felç ve nöbet 10 ve hareket koordinasyon kaybı kayıtları optomotor davranış 11 önlemler düzeltilmesi refleks davranışı içerir . APS tayininde, ilk engel rastgele ileriye doğru hareket eden ışıklı odasının girişinde durdurma sinekler olabilir. Büyük sinekler genel olarak daha az aktif olan ve uzun süre durun ve dinlenin eğilimi yaşlanma, çalışılan koşulları biri olup olmadığını bu bir sorun olur. Bu durumda, deneyci hareketi, her zaman etkili değildir teşvik etmek için mekanik uyaranlara sağlamak için vardır. İkincisi, bir iddia edebilir ki olumlu phototaxis kaybı ışıklı odasının sonuçları gitmek hatası. Önceki iş güçlendirmek negatif 4 çıkarıldıktan sonra sinekler ışık yanıt dönüp göstermiştir, bu durum nadiren durumda. Üçüncü olarak, caydırıcı bir stimulus ile temas süresi deneme yargılanma değişebilir. Bu değişim genellikle kinin kaçınarak uçar önlemek için ıslatılmış filtre kağıdı ile iç odasının duvar çevreleyen tarafından azaltılabilir. Buna ek olarak, deneyci her sinek aksi belirtilmediği 1 dakika odasında harcanan zaman miktarını artırarak, filtre kağıdı ile temas yeterli zaman harcamak emin olabilirsiniz. Özet olarak, negatif geotaxis ve APS testleri, davranışsal açıkları değerlendirmek hızlı ve basit bir yolu vardır ve kantitatif lokomotor ve Drosophila öğrenme ve hafıza yeteneklerine işaret etmektedir . Bu testlerin Drosophila insan nörodejeneratif koşulları modelleme yararlıdır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Malzemeler </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorum </th></tr><tr><td> Polistiren Flakon </td><td> Capitol Flakon, Inc. </td><td> 28Fly </td><td> 28.5 x 95 mm Polistren Flakon; malzeme kalitesi önemli, kötü sinekler tırmanmak için çok kaygan. </td></tr><tr><td> Stereoskop Diseksiyon </td><td> Zeiss </td><td> 000000-1432-979 </td><td> 2 şube kaz boynu ışık kılavuzu (12V/30W) </td></tr><tr><td> Kinin hidroklorür </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 6119-47-7 </td><td> Distile su içinde çözülür. </td></tr><tr><td> Hızlı kes Konnektörleri </td><td> Nalgene (VWR) </td><td> 62868-021 </td><td> Yüksek Yoğunluklu Polietilen </td></tr><tr><td> T-Labirent </td><td> Basit Davranış Sistemleri </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tek kanallı 200 mcL pipet </td><td> Eppendorf </td><td> 022443305 </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying lokomotor, Öğrenme ve hafıza açıkları. drosophila nörodejenerasyon, modeller

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Drosophila, bir model sistemi 1 olarak kullanarak insan nörodejeneratif hastalıklar yer alan genlerin çalışma genetik yöntemler gelişmeler sağlamıştır . Alzheimer, Parkinson ve Huntington hastalığı da dahil olmak üzere bu hastalıkların çoğu, öğrenme ve hafıza fonksiyonları ve hareket koordinasyonu 2 yaşa bağlı bozulma ile karakterize edilir . Burada negatif geotaxis tahlil 3 ve caydırıcı phototaxic bastırma yöntemi (APS tahlil) 4,5 davranış testleri de dahil olmak üzere, insan nörodejenerasyon ile ilişkili davranış özellikleri bazı sineklerin değinmeyecek olabileceğini göstermek için kullanın. Negatif geotaxis tahlil, doğal eğilim, ajite gen ya da lokomotor kapasiteleri engel durumları incelemek için kullanılmaktadır yerçekimine karşı hareket etmek için uçar. APS testi, öğrenme ve hafıza fonksiyonları, caydırıcı bir acı tadı ile ışık ilişkilendirmek ve böylece ışığa doğru hareket etmek, aksi takdirde doğal bir eğilim önlemek için eğitilmiş uçar olumlu-phototactic test vardır. Bu eğitimli Test 6 saat antrenman sonrası hafıza fonksiyonları değerlendirmek için kullanılır uçar. Bu deneyleri kullanarak, gelişmekte olan nörodejenerasyon yönelik herhangi bir genetik veya çevresel faktörlerin katkısı sinekler kolayca incelenebilir.

Davranış testleri, lokomotor fonksiyonları ölçme öğrenme ve hafıza yeteneklerine<em&gt; Drosophila</em&gt;.

Assaying Lokomotor, Öğrenme ve Hafıza Açıkları. Drosophila Nörodejenerasyon, modeller

Genetik yöntemlerdeki ilerlemeler, Drosophila'nın bir model sistem olarak kullanılarak insan nörodejeneratif hastalıklarında rol oynayan genlerin çalışılmasına olanak sağlamıştır1. ...'nın çoğu

Prosedürün genel amacı, yetişkin Drosophila melanogaster'da öğrenme ve belleği incelemektir; ancak öncelikle sineklerin lokomotor defisitler yaşayıp yaşamadığı belirlenir. Sinekler, negatif geotaksi testiyle test edilir. Ardından, sineklerin bir T-labirente yerleştirilmesi ve tercih edilen aydınlık bölmeye doğru hareket etme süresinin kaydedilmesiyle pozitif fototaktik davranış doğrulanır.Pozitif fototaksi gösteren sinekler daha sonra, aydınlık bölmeyi kininin acı tadıyla ilişkilendirmek üzere koşullandırılır. Son aşamada, sineklerin itici uyarıcıyı aydınlık bölmeyle ne kadar iyi ilişkilendirdikleri test edilerek öğrenme ve hafıza ölçümü sağlanır. Ola, X laboratuvarına hoş geldin.Bugün size, drosophila'da nörodejenerasyonu incelemek için yaygın olarak kullanılan iki davranışsal testi göstereceğiz. İlk olarak, laboratuvarımızda lisans öğrencisi olan Wil Fredo Sala ve benim tarafımdan sunulacak olan itici fototaksi baskılama testi, ardından laboratuvarımızda lisansüstü öğrencisi olan Kaiwan tarafından sunulacak olan negatif geotaksi testi gösterilecektir. Sinekleri, 25 °C'de, 12 saatlik ışık-karanlık döngüsünde, standart mısır unu agar melas maya besiyerinde tutun.Oklüzyon günü, bakire sinekleri 20'şerli gruplar halinde ayırın. Bakire sinekler, açık renklerinden ve abdomenlerinin alt kısmında bulunan koyu yeşilimsi bir lekeden ayırt edilir. Sinekler her üç günde bir taze bir viyale aktarılmalı ve genetik arka planlardan kaynaklanan farklılıkları en aza indirmek için kardeş sinekler kullanılmalıdır.Bir geo taksis çalışmasında, genotip veya işlem başına 10 ila 20 grup test edilmelidir. Başlamak için dişi ve erkek sinekleri 10'arlı gruplara ayırın. Bu sinekler ayrı ayrı test edilmelidir.Davranış cinsiyetten önemli ölçüde etkilendiği için, lokomotor aktivitenin bozulmadığından emin olmak adına anestezi sonrası işleme geçmeden önce en az bir saat bekleyin. Sinekler tamamen hazır olduğunda, iki boş polistiren tüpün ağızlarını, tüpleri dikey olarak alt tüpün üzerine birleştirerek hizalayın.Alttan sekiz santimetre ölçün ve çevre boyunca bir daire çizin. Düzenek kurulduğuna göre, 10 sineklik bir grubu alt tüpe aktarın. Tüpleri hemen tekrar birleştirin ve testten önce sineklerin bir dakika boyunca adapte olmasını sağlayın.Sinekler yerleştikten sonra, onları nazikçe tüpün tabanına vurun ve 10 saniye içinde sekiz santimetre işaretinin üzerine çıkan sinek sayısını ölçün. Her gruptan bu işareti geçen sinek sayısı, toplam sineklerin yüzdesi olarak kaydedilir. Sineklerin denemeler arasında bir dakika dinlenmesine izin vererek bu prosedürü her grup için 10 kez tekrarlayın.Bir PS analizinden altı saat önce, dişi sinekleri suyla nemlendirilmiş filtre kağıdı içeren polistiren tüplere ayırın. Bu adım, sineklerin aç kalmasını ve itici tada karşı daha hassas hale gelmesini sağlar. Bu analizde, kinin çözeltisi itici uyaran olarak kullanılır.0,1 molar stok çözeltiden bir mikromolar konsantrasyonda bir çalışma çözeltisi hazırlayın. T labirenti; kapan kapaklı bir merkez sütunu ile bir karanlık oda ve bir aydınlık oda şeklinde iki yan odadan oluşur. İki milimetre işaretinden, 15 mililitrelik iki plastik santrifüj tüpünün kapalı uçlarını manuel bir testere ile kesin; her iki uca konnektör adaptörleri takın ve bağlantıyı parafilm ile sızdırmaz hale getirin.Karanlık bölme olarak kullanmak için bir tüpü alüminyum folyo ile sarın. Aydınlık ve karanlık bölmeleri merkez sütunun her iki yanına vidalayarak TMAs'ları monte edin. Ortadaki kapak kapalıyken, ışık kaynağını doğrudan aydınlık bölme adaptörüne bağlayarak kurulumu tamamlayın. Analizi gerçekleştirmeden önce, 10'lu gruplar halindeki her bir sineği boş bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve kaçmalarını önlemek için kapağı hafifçe kapatın.Ardından, karanlık bölmeyi TMA'lardan sökün. Tüpe tek bir sinek aktarın ve tüpü hemen labirente geri yerleştirin. Odadaki ışıkları kapatın ve kırmızı bir lambayı açın.Sinenin karanlık bölmede 30 saniye boyunca aklimatize olmasına izin verin ve ardından aydınlık bölmeyi aydınlatan ışık kaynağını yavaşça açın. Işık açıldıktan sonra, iki bölmeyi birbirinden ayıran tuzak kapağını açın. Sinek 10 saniye içinde aydınlık bölmeye yürürse, pozitif fototaktik olarak kabul edilir ve eğitilmeye hazır hale gelir.Bu şekilde yanıt verilmemesi, görsel sistemde bir soruna işaret eder ve deneyden çıkarılmayı gerektirir. Pozitif fototaksis onaylandığında, 32 saniyelik bir dinlenme süresi boyunca sineği hafifçe vurarak karanlık bölmeye geri gönderin, kapan kapısını kapatın ve ışığı söndürün. Filtre kağıdını aydınlatılmış bölmeye yerleştirerek ve filtre kağıdının üzerine bir mililitre kinin çözeltisi pipetleyerek kaçınma uyaranını hazırlayın.Tüm filtre kağıdının itici uyaranlarla tamamen nemlendirildiğinden emin olun. Koşullandırmaya başlamak için kapan kapısını yavaşça açın ve ışığı yakın. Sineğin kinin kokulu aydınlatılmış bölmeye yürümesine izin verin.Bir dakika sonra, sineği tekrar karanlık bölmeye doğru vurun. Toplam 10 koşullanma denemesi için bu işlemi dokuz kez tekrarlayın. Genellikle, eğitilmiş sinekler eğitimden hemen sonra, üç ila beş eğitim denemesinin ardından aydınlık bölmeden kaçınırlar.Beş test denemesi gerçekleştirin. Eğitilen sinek 10 saniye içinde haznenin ışığına doğru yürümezse, bu durum bir geçiş olarak kaydedilir. Beş ardışık deneme üzerindeki geçiş oranı kaydedilir ve belirlenir.PC sıfır. Eğitim ve başlangıç PC sıfır kayıtlarından sonra, her sinek kendi numaralı orijinal besin dosyasına geri yerleştirilir ve altı saat boyunca bekletilir. Eğitimden altı saat sonra, daha önce gösterildiği gibi beş ek test denemesi gerçekleştirilir; bu geçme oranı PC altıyı temsil eder ve kısa süreli belleğin bir ölçüsüdür.Negatif geotaksi deneyinde, sekiz santimetre işaretini geçen sineklerin sayısı bir yüzdeye dönüştürülür ve tırmanma geçiş oranı olarak sunulur. Sağda görüldüğü üzere 10 deneme boyunca, insan tau proteinini aşırı eksprese eden 10 günlük erkek veya dişi sinekler, soldaki yaş eşli GFP aşırı eksprese eden sineklere kıyasla belirgin lokomotor eksiklikler göstermektedir.Aversif fototaksi baskılama deneyindeki performans, ortalama geçme oranı veya başarılı kaçınma denemelerinin yüzdesi ile temsil edilir. Sağda gösterilen tau aşırı eksprese eden sinekler, toplam denemeler üzerinden değerlendirildiğinde, hem eğitimin hemen ardından hem de altı saat sonra yapılan testlerde, soldaki kontrol grubuyla karşılaştırıldığında ışığı acı bir tatla ilişkilendirmekte yetersiz kalmaktadır. Bu prosedürün ardından, morfolojik farklılıklar hakkındaki ek soruları yanıtlamak amacıyla immünohistokimyasal analiz için örnekler alınabilir. Bu videoyu izledikten sonra, sineklerde öğrenme ve hafızanın nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Ve unutmayın, her şey sizinle ilgili.

assaying-locomotor-learning-memory-deficits-drosophila-models

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Anahtar Drosophila birleştirici bellek ölçülmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Tahlil negatif güçlendiricidir (elektrik çarpması) ile sunulan bir koku ilişkilendirmek ve daha sonra bellek ölçülmesine izin verecek, daha sonra bu bilgileri hatırlamak için sinek yeteneği dayanmaktadır.

Drosophila Yetişkin Koku Şok Öğrenme

Burada dopaminerjik (DA) nöronların yaşa bağlı nörodejenerasyon incelemek için kurulmuştur iki deneyleri...

Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Tırmanma Tahliller tarafından Dopaminerjik nöronlar ve Tüm Beyin immün

Drosophila melanogaster'de nörodejeneratif bozukluklar için bir model olarak optimize edilmiş, ucuz ve güvenilir bir negatif jeotaksi testi sunuyoruz. Hafif lokomotor kusurlara karşı daha hassas olan bu test, potansiyel genetik etkileşimlerin ve ilaç hedeflerinin taranmasına yardımcı olacaktır.

Nörodejeneratif Hastalıkların bir Drosophila Modelinde Tırmanma Kusur Kantitatif Analiz

Drosophila yaygın nörodejenerasyonu incelemek için bir model sistem olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, beyinde vakuol oluşumu ile tespit edildiği üzere, sayısal edilebilir dejenerasyonu bir yöntemi tarif etmektedir. Aynı zamanda dolayı bir örnek olarak işleme ve kesit kontrol ve deney sinekler tarafından deneysel prosedüre etkileri en aza indirir.

Kitle Histoloji nörodejenerasyon belirlememize<em&gt; Drosophila</em

Bu protokol, kur şartlama denilen bir Drosophila öğrenme ve bellek deneyi tanımlar. Bu klasik tahlil, resepsiyona açık olmayan prematüre bir kadının cinsel reddetmesinden sonra erkek kovuşturma davranışının azaltılmasına dayanmaktadır. Davranışsal esnekliğin bu doğal biçimi, öğrenmeyi, kısa vadeli belleği ve uzun süreli belleği test etmek için kullanılabilir.

Öğrenme ve Bellek Tedrisi Olan Drosophila Kurbanlığı İklimlendirme

Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Bu adım adım protokolü Drosophila negatif geotaxis davranışı sinekler yüzlerce ev sahipliği yapan ve eylemlerinin bir elektrik motoru ile eşitler otomatik çoklu silindir sistemi kullanarak çözümler. Eşitleme sinek negatif geotaxis davranış, dijital kaydedilen ve analiz kendi kendine tasarlanmış RflyDetection yazılım kullanarak denetlesinler.

Ateş, Drosophila modeli yetişkin tırmanma davranışı çözümlemek için bir otomatik hızlı yinelemeli negatif Geotaxis tahlil

Burada drosophila öğrenme ve bellek bağlamında pre-ve/ veya postsinaptik kalsiyum görselleştirilebilen bir protokol sayılmaktadır. Sinapti lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak yapılan in vivo kalsiyum görüntüleme, bu tür bir assosiyatif öğrenmenin altında yatan sinaptik plastisitenin belirlenebileceği klasik koku alma koşullandırma paradigması ile birleştirilir.

Drosophila melanogaster Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisite Vivo Optik Kalsiyum Görüntüleme

Bu işlemin amacı Drosophila melanogasterkullanarak nörodejeneratif hastalık modellerinde DLM nöromüsküler kavşaklar (NMJs) yapısal bütünlüğünü değerlendirmek için dorsal uzunlatanal kas (DLM) doku incelemektir.

Nörodejenerasyon ile Birlikte Erişkin Drosophila'da Sinaptik Dejenerasyonun Görselleştirilmesi

Mevcut protokol, Drosophila'nın lokomotor aktivitesini, hız, mesafe vb. parametreleri hesaplamak için yüksek tanımlı video kaydına dayalı olarak her karenin piksellerini segmentlere ayırmak için eklentilerle uyumlu açık kaynaklı yazılım Fiji'yi kullanarak el yapımı bir arenada sineklerin hareketini izleyerek ve analiz ederek değerlendirir.

Drosophila'da Lokomotor Aktiviteyi Test Etmek İçin Basit Bir Teknik

Protokol, geleneksel memeli modellerine bir alternatif olarak lokomotor disfonksiyonun nicelleştirilmesi yoluyla meyve sineğindeki nörotoksisiteyi değerlendirmek için yüksek verimli, uygun maliyetli bir yöntem sunar. Farmasötik bileşiklerin, çevresel ajanların veya genetik modifikasyonların nörotoksik etkilerini hassas, tekrarlanabilir ve etik açıdan uygun bir model kullanarak değerlendirmeyi amaçlar.

Drosophila melanogaster'de Lokomotor Disfonksiyonun Nörotoksisite için Bir Okuma Olarak Davranışsal Analizi

Öğrenin Drosophila melanogaster'da lokomotor fonksiyonları, öğrenme ve hafıza değerlendirmek için negatif geotaksi ve aversif fototaksi baskılama testlerini. Bu yöntemler nörodejenerasyon modellerinde davranışsal analiz sağlar.

Assaying Lokomotor, Öğrenme ve Hafıza Açıkları. Drosophila Nörodejenerasyon, modeller

Daha fazla video keşfet