Name: Canlı görüntüleme Sf9 Hücreler ve PKC Translokasyon Aplysia Duyu Nöronlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Öğrenin, canlı hücrelerde floresan etiketli PKC translokasyonunu lazer tarama mikroskobisi ile görüntüleme yöntemini. Aplysia duyu nöronları ve Sf9 hücrelerinde gerçek zamanlı sinyal iletimi dinamiklerini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR) Hibe Wayne S. Sossin Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Carole A. Farah de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) ve bir Conrad Harrington dostluk Viyana bir doktora sonrası dostluk alıcı. Yazarlar Joanna buji, Margaret Hastings ve Margaret Labban grafik genel yardım için video çekimi ve Madeline Richmond Havuzu ile ilgili yardım için teşekkür etmek istiyorum.

1. Hazırlık ve Sf9 Hücre Monolayer Kültürler Bakım <ol><li> Bir doku kültürü kaputu Sf9 hücre kültürü ve bakım yapılır. </li><li> Sf9 hücreleri Spodoptera frugiperda yumurtalık hücreleri (Sf21 hücre) türetilmiştir ve Invitrogen Grace medya donmuş hücreleri olarak satın alınabilir. </li><li> Yeri 8 mL takviye Grace böcek, orta (1X),% 30 fetal sığır serumu (FBS) eğimli bir boyun ile 75 cm 2 hücre kültürü şişesi eklenmiştir. </li><li> 37 ° C su banyosunda hızla (yaklaşık 1-2 dakika), ileri ve geri tüp hareket Sf9 hücreler dondurulmuş tüp çözülme. </li><li> Hücreler eşit olarak dağıtmak için elle hafifçe Sf9 hücreler 75 cm 2 hücre kültürü şişesi ve taş plaka transfer. </li><li> Hücreleri bağlı 27 ° C kadar 1-2 saat inkübe edin. </li><li> Eski orta çıkarın ve% 30 FBS freshGrace böcek orta 10 ml ile değiştirin. </li><li> Konfluent hücreleri 27 ° C kadar inkübe edin. </li><li> Tek tabaka kültürleri korumak için, eski orta Sf9 hücrelerinin konfluent balon kaldırmak ve 5 ml% 10 FBS Grace böcek orta ekleyin. </li><li> Balonun tarafında Sf9 hücreleri ayırmak için birkaç kez hafifçe dokunun. </li><li> Pipet, bir kez hafifçe aşağı pipetleme sırasında balon duvar püskürtme, yukarı ve aşağı 10 ml pipet ve bir pipet medya kullanımı. 15 ml steril bir polysterene tüp hücreleri aktarın. </li><li> El ile yavaşça 75 cm 2 yeni hücre kültürü şişesi ve taş plaka% 10 FBS (log fazı büyüme sağlamak için seyreltme 01:05) ile Grace böcek orta 8 mL, Sf9 hücre süspansiyonu 2 mL ekleyin . </li><li> Konfluent hücreleri 27 ° C kadar inkübe edin. </li></ol> 2. Sf9 Hücreler floresan Takip edilen PKC İfadesi <ol><li> Canlı görüntüleme deney, kültür 35 mm Mattek cam alt kültür disheswith cam yüzey 14 mm ve 0,16 - 0,19 mm lamel kalınlığı bir Sf9 hücre. </li><li> Floresan proteinleri ile etiketlenen PKC aşağıda ayrıntılı değişiklikler ile üreticinin Cellfectin II transfeksiyon reaktif aşağıdaki tavsiye Sf9 hücreleri kullanılarak ifade edilir. </li><li> 1. Gün: hücrelerin kaplama önce, en az 30 dakika süreyle% 10 FBS Grace böcek orta her Mattek çanak tedavi. </li><li> Hemasitometre kullanarak adım 11 (üstte) Sf9 hücreleri sayın. </li><li> Plaka 0.05 x 10 6 hücre toplam hacmi 150 mcL her Mattek cam lamel. Hücrelerin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca takmak için izin verin. </li><li> Grace hücreleri koparmasını önlemek için yavaş yavaş bir anda her çanak 1 ml% 10 FBS ile takviye 2 mL ekleyin. </li><li> 27 ° C&#39;de bir gece inkübe edin. </li><li> Bu noktadan itibaren, plazmid DNA ile Sf9 hücre transfeksiyon için üretici firmanın tavsiye kullanın. </li><li> 2. Gün: Cellfectin II transfeksiyon reaktif kullanarak floresan etiketli PKC Transfect Sf9 hücreleri. Biz genellikle gelişmiş Yeşil Floresan Protein (eGFP) ve monomerik kırmızı floresan proteini (MRFP) (plazmid inşaat için daha önce 2,5 tarif edilmiştir) ile etiketlenen bu sistem PKC eş dile getirdiler. İfade bir defada bir floresan protein% 70-80 hakkında ifade hücreler 72 saat sonrası transfeksiyon verir. Co-iki floresan proteinleri ifade transfeksiyon verimliliği yaklaşık% 30 co-ifade hücreleri azalır. EGFP etiketli PKC ve MRFP etiketli PKC co-ifade edilirken, optimum protein ekspresyonu için MRFP etiketli protein daha plazmid DNA 2x kullanın. </li><li> Gerçekleştirin canlı görüntüleme 48-72 saat sonrası transfeksiyon (optimal protein ekspresyonu, 72 saat bekleyin). </li></ol> 3. Aplysia Duyu Nöronlar floresan Takip edilen PKC Açıklanması <ol><li> Zhao ve meslektaşları 4 video makalede açıklanan Aplysia nöronal hücre kültürlerinin hazırlanması olmuştur. </li><li> Floresan proteinleri ile etiketlenen PKC Aplysia duyusal nöronlar aşağıda ayrıntılı mikroenjeksiyon yordamı kullanarak ifade edilir. </li><li> Distile su içinde% 1 Hızlı Yeşil (FCF) stok solüsyonu hazırlayın, bir şırınga ve 28 mm şırınga filtresi (0.20 mikron) filtresi. -20 ° C&#39;de kısım ve mağaza </li><li> Duyu nöronlarının Mikroenjeksiyon nöronlar izole sonra günde 1 veya 2 günde ancak 2 gün bekledikten lamel daha iyi hücre bağlılık sağlar olabilir. </li><li> Duyu nöronlarının izolasyon sonra, günde 2 Hızlı Yeşil bir kısım Çözülme ve bir şırınga ve 28 mm şırınga filtresi (0.20 mikron) kullanarak tekrar filtre. </li><li> Distile su içinde% 0.5 Hızlı Yeşil içeren plazmid DNA bir çözüm hazırlayın. Mcg / ml 0.4 gibi yüksek bir plazmid DNA konsantrasyonları kullanılabilir ama bu değerlerin üstünde gitmek için tavsiye edilmez. </li><li> Filtre 1 ml şırınga ve 4 mm&#39;lik bir şırınga filtresi (0.20 mikron) kullanarak plazmid DNA / Hızlı Yeşil çözüm. </li><li> Bir mikrofon kullanarak 15 dakika boyunca 16.110 xg&#39;de plazmid DNA / Hızlı Yeşil çözüm Santrifüjrocentrifuge. </li><li> Mikroelektrot çektirmenin kullanarak nöronlar mikroenjeksiyon (Sutter Flaming / Brown Mikropipet Çektirme, Model P-97) keskin elektrotlar hazırlayın. 1 mm dış çapı, iç çapı 0.75 mm ve 100 mm uzunluğunda içinde filament (Dünya Hassas Aletler TW100F-4) ile ince cidarlı cam kapilerleri kullanarak cam bir kutu filament kullanarak, Mikroelektronlar çekin. Sutter elektrot yemek kitabı mikroenjeksiyon elektrotlar çekme hakkında daha fazla bilgi için bakınız. </li><li> Microloader pipet ucu (Eppendorf CA32950-050) kullanarak plazmid DNA / Hızlı Yeşil çözüm 2 mcL her elektrot doldurun. </li><li> Mikroenjeksiyon istasyonu Aplysia nöronal kültürlerin içeren Mattek cam alt kültür kaplarına aktarın. </li><li> Mikroenjeksiyon istasyonu aşağıdakilerden oluşur: bir ev yapımı bir titreşim izolasyonu tablosu (Kinetik Sistemleri titreşim izolasyonu iş istasyonu), dış halojen aydınlatma ile stereo kapsam mikromanipülatör (Sutter Huxley Duvar Tipi Mikromanipülatör kültür yemekleri tutmak için büyük cam aşamasında olan) üç eksen kaba ve ultra-ince konumlandırma sağlar, pnömatik pompa (Dünya Hassas Aletler PV820 Pnömatik Pico-Pompa) bağlı bir mikroelektrot sahibi. Pnömatik pompa basıncı Giriş sıkıştırılmış bir Azot tankına bağlı. </li><li> Mikroelektrot mikroelektrot tutucu içine yerleştirin. </li><li> Stereo-mikroskop altında görüntülenen, hücre çekirdeği içine mikropipet ucuna takın. </li><li> Azot kısa basınç darbeleri sunun (10 ila 100 ms süresi, 20 lb / 2) çekirdeğin düzgün olarak yeşil olana kadar. </li><li> Hücreleri 4 saat oda sıcaklığında inkübe edin ve 4 ° C kullanana kadar az tutmak. Enjeksiyon sonrası 24 saat optimum PKC translokasyonu için canlı görüntüleme deney 20 gerçekleştirin. </li></ol> 4. Sf9 Hücreler Yaşayan ve Aplysia Duyu Nöronlar PKC Translokasyon Görselleştirme <ol><li> Görüntüleme için, biz bir Axiovert 200 ile Zeiss LSM510 ters konfokal mikroskop kullanıyoruz. </li><li> Aplysia duyusal nöronlar x40 immersiyon yağı hedefi ile görüntülü ise Sf9 hücreleri X63 immersiyon yağı hedefi imaged: Görüntüleme protokolü Sf9 hücreler ve Aplysia duyusal nöronlar için aşağıdaki hariç aynıdır. Aplysia duyusal nöronlar, 18-20 o C civarında muhafaza oda sıcaklığında görüntülü ise Sf9 hücrelerin bakımı, 26-27 o C sıcaklık kontrollü bir odasında görüntülü </li><li> % 50 lazer çıktı eGFP protein ve MRFP protein ile görüntü etiketledi PKC HeNe lazer (543nm azından uyarma) etiketli görüntü PKC 30 mW Argon lazer (488nm az eksitasyon). Argon ve HeNe lazer çizgileri% 4 oranında azaltılmış ve görüntüleme ve iğne deliği önce sırasıyla% 50 iletim çıkışı bir şekilde ayarlanır. </li><li> Kültür çanak görüntüleme sahnede stabilize olması ve hareket veya titreşim önlemek için önemlidir. </li><li> Yavaşça bırakarak bir tabak içinde 1 ml toplam hacmi 10 mL pipet kullanarak çanak 1 ml kültür ortamı çıkarın. </li><li> Çekirdeğin görülebilir hücrelerinin orta bölümünde fotoğraflar çekin. </li><li> Her 30 saniyede bir resim alarak 10-20 konfokal görüntüleri bir zaman serisi ayarlayın. </li><li> Zaman serisi başlayın. </li><li> 2 resim (30 saniye noktadan sonra) alındıktan sonra, yavaşça ilacın 1 ml (2X konsantrasyon) P1000 bir pipet kullanarak hücrelerin üstüne bırak bırak ekleyin. Ilaç yaklaşık 30 saniye boyunca sürekli olarak eklenir. </li><li> Bazı ilaçlar, diğerleri sadece en iyi 5-10 dakika tedavi sonrası (Film 1 ve Movie 2) yavaş bir translokasyon neden while (60 saniye noktada) hemen sonra ilaç tedavisi görülebilir hızlı bir translokasyona neden olur. </li><li> Ilaç yıkanıp gerekiyorsa, çanağı bir tarafta bir pipet yardımıyla hafifçe aşağı yıkama tamponu pipetleme ve diğer tarafta medya pipeting yıkama yapmak için 2 x 10 ml pipetler kullanabilirsiniz. </li><li> Yıkama etkili olmuştur ve ilacın etkisi geri dönüşümlü olup olmadığını, KZÇ sitoplazmada 30-60 saniye içinde geri döner. </li><li> Film LSM bir dosya olarak kaydedin. </li><li> LSM dosyaları açmak ve görüntüleri öncesi ve sonrası ilaç tedavisi ölçmek için NIH Image J yazılımı kullanın. Niceleme başka bir yerde 1 tarif edilmiştir. </li></ol>

<ol><li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &amp, Klein, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2%2B-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li>
<li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li>
</ol>

Biz Sf9 hücreleri ve Aplysia duyu nöronları gerçek zamanlı olarak floresan etiketli PKC görüntü translokasyon bir teknik tanımlanmıştır. Kültür ve onları transfecting oldukça düz ileri olduğundan Sf9 hücreleri görüntü PKC translokasyonu basit bir sisteme de sağlar. Aksine, Aplysia duyu nöronlarının mikroenjeksiyon master için biraz zaman alır; birkaç ay. Bu tekniği ile ilgili güçlükler elektrot tıkanma içerir. Enjeksiyon çözüm Filtreleme ve santrifüj genellikle yardımcı olur, ancak o kadar dolum esnası...

<table><tbody><tr><td>Dondurulmuş Sf9 hücreleri</td><td>&lt;em&gt;Spodoptera frugiperda&lt;/em&gt; over hücreleri</td><td>Invitrogen</td><td>B825-01</td><td></td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;Takviye Edilmiş Böcek Besiyeri, (1X), sıvı</td><td>Reaktif</td><td>Life Technologies tarafından üretilen GIBCO</td><td>11605-094</td><td>Sf9 hücrelerini kültüre etmek için kullanın</td></tr><tr><td>Corning 75cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; eğik boyunlu hücre kültür flaskı</td><td>Araç</td><td>Corning</td><td>430720</td><td>Sf9 hücrelerini kültürlemek için kullanın</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Reaktif</td><td>CanSera</td><td>CS-C08-500</td><td>Ek Grace&amp;rsquo;kullanım öncesinde FBS içeren besiyerleri</td></tr><tr><td>Enjektör</td><td>Araç</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>Fast Green çözeltüsünü filtrelemek için kullanın</td></tr><tr><td>Enjektör</td><td>Araç</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td>Plazmit DNA / Fast Green çözeltisini filtrelemek için kullanın</td></tr><tr><td>Filtrele</td><td>Araç</td><td>Corning</td><td>431229</td><td>Fast Green çözeltisini filtrelemek için kullanın</td></tr><tr><td>Filtre</td><td>Araç</td><td>Corning</td><td>431212</td><td>Plazmit DNA / Fast Green çözeltisini filtrelemek için kullanın</td></tr><tr><td>Cam Tabanlı Kap</td><td>Araç</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Transfeksiyon ve görüntüleme öncesinde Sf9 hücrelerini kültüre etmek için kullanın</td></tr><tr><td>Cellfectin II Reaktifi</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Sf9 hücrelerinde floresan etiketli PKC'lerin eksprese edilmesi için kullanılır</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>Plazmid DNA solüsyonunun mikroenjeksiyonla iletilmesini görselleştirmek için kullanın &lt;em&gt;Aplysia&lt;/em&gt; duyusal nöronlar</td></tr><tr><td>İnce duvarlı cam kapilerler</td><td>Araç</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td>mikro yapımında kullanılır&amp;#8211;mikroenjeksiyon elektrotları</td></tr><tr><td>Mikro yükleyici pipet ucu</td><td>Araç</td><td>Eppendorf</td><td>CA32950-050</td><td>Mikro doldurmadan önce otoklavlayın&amp;#8211;mikroenjeksiyon için elektrotlar</td></tr><tr><td>PV820 Pnömatik PicoPump </td><td>Araç</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-PV820</td><td>Mikroenjeksiyon istasyonunun parçası</td></tr><tr><td>Mikr&amp;#8211;elektrot tutucu</td><td>Araç</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH6S</td><td>Mikro... tutmak için kullanın&amp;#8211;elektrot </td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Araç</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-85</td><td>Mikroskobun konumlandırılmasında kullanın&amp;#8211;üç eksenli elektrot</td></tr></tbody></table>

canlı görüntüleme sf9 hücreler ve pkc translokasyon aplysia duyu nöronlar

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinaz Cs (PKC) gibi hücre büyüme ve öğrenme ve hafıza gibi çok çeşitli hücre süreçlerini düzenleyen merkezi bir rol oynayan treonin kinazlar serin. Omurgalıların PKC izoformlarını dört anılan aileler bulunmaktadır: klasik PKC (α, βI, βII ve γ), yeni tip I PKC (ε η), yeni tip II PKC (δ ve θ) ve atipik PKC (ζ ve ι .) Klasik PKC Ca 2 ile aktive olan roman PKC DAG aktif, ancak Ca 2 +-bağımsız iken + ve diacylclycerol (DAG). Atipik PKC + ne DAG Ca 2 ne tarafından aktive edilir. Aplysia californica, bellek oluşumunu incelemek için model sistem olmak üzere üç sinir sistemine özgü PKC izoformlarını her ana sınıfı, geleneksel PKC Apl Ben, roman türü PKC Apl II ve atipik PKC Apl III vardır . PKC lipid aktive kinazlar ve böylece ekstrasellüler sinyaller yanıt klasik ve yeni PKC aktivasyonu sık sık, plazma zarı sitoplazmaya PKC translokasyonu ile korele olmuştur. Bu nedenle, canlı hücreler gerçek zamanlı PKC translokasyonu görüntülenmesi PKC aktivasyonuna yol açan sinyal iletim yolları nedenlerine açıklık için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Örneğin, bu tekniğin farklı PKC izoformlarını sinaptik plastisite farklı tip arabuluculuk için farklı koşullar altında yerini değiştirmek ve II. PKC Apl bu serotonin (5HT) aktivasyonu için hem DAG ve phosphatidic asit (PA) üretim gerektirir kurmak için bize izin verdi translokasyon 1-2. Önemlisi, aynı nöron görselleştirmek için yeteneği sürekli olarak bize, örneğin, en ince ayrıntısına kadar 3 PKC yanıt duyarsızlaştırma ölçmek için izin verdi . Bu video Sf9 hücre kültürlerinin hazırlanmasında her adımı gösteren, Aplysia duyusal nöronlar kültürleri yanıt olarak floresan etiketli PKC ifade Sf9 hücreleri ve Aplysia duyusal nöronlar ve PKC translokasyonu canlı görüntüleme, başka bir video 4 üncü maddesinde tarif edilmiştir lazer tarama mikroskopisi kullanarak farklı aktivatörleri.

Bu video, floresan etiketli PKC kullanarak canlı hücreler PKC translokasyonu görselleştirme göstermektedir.

Canlı görüntüleme Sf9 Hücreler ve PKC Translokasyon Aplysia Duyu Nöronlar

Protein kinaz C'ler (PKC'ler), hücre büyümesi ve ... gibi çok çeşitli hücresel süreçlerin düzenlenmesinde merkezi bir rol oynayan serin treonin kinazlardır.

Bu prosedürün amacı, canlı hücrelerde floresan işaretli PKC translokasyonunu görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle SF nine hücre kültürlerinin veya Plegia California'dan alınan duyusal nöron kültürlerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise hücrelerde floresan işaretli pkc'lerin ekspres edilmesidir.Son adım, lazer tarama mikroskopisi kullanarak farklı aktivatörlere yanıt olarak PKC translokasyonunun görüntülenmesidir. Nihayetinde, canlı hücreler kullanılarak gerçek zamanlı PKC translokasyon görüntülerlemesi aracılığıyla, farklı PKC izoformlarının diol gliserol gibi ikincil haberciler tarafından farklı şekilde regüle edildiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, benim adım Carol Ferra.Montreal Nörolojik Enstitüsü'nde Dr. Wayne Sawn'un laboratuvarında araştırma görevlisiyim. Bugün, Aplysia duyusal nöronlarında PKC translokasyonunun canlı görüntülemesini göstereceğim. Bu yöntem, bellek oluşumu sırasında farklı PKC izoformlarının nasıl aktive olduğu gibi sinaptik plastisite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.SF nine hücre monokatman kültürlerini hazırlamak için, 75 cm²'lik bir hücre kültür flakonuna %30 fetal bovine serum içeren 8 mL Grace böcek besiyeri ekleyin. Ardından, dondurulmuş SF nine hücre tüpünü, tüpü yaklaşık bir ila iki dakika boyunca ileri geri hareket ettirerek 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çözdürün. Sonrasında, SF nine hücrelerini hücre kültür flakonuna aktarın ve hücrelerin eşit şekilde dağılması için flakonu elinizle nazikçe sallayın. Hücreler yapışana kadar 27 °C'de bir ila iki saat inkübe edin.Ardından eski besiyerini flasktan uzaklaştırın ve yerine %30 FBS içeren 10 mililitre taze Grace böcek besiyeri ekleyin; hücreleri konfluen olana kadar 27 °C'de inkübe edin. Monolayer kültürleri sürdürmek için, konfluen durumdaki SF nine hücre flaskındaki eski besiyerini uzaklaştırın ve %10 FBS içeren beş mililitre Grace böcek besiyeri ekleyin; SF nine hücrelerini ayırmak için flaskın kenarına birkaç kez hafifçe vurun. Ardından, 10 mililitrelik bir pipet kullanarak besiyerini nazikçe aşağı yukarı pipetleyin.Pipetle aşağı doğru püskürterek flask duvarına bir kez sıktıktan sonra, hücreleri steril 15 mililitrelik bir polistiren tüpe aktarın. Bir ila beş seyreltme oranıyla, yeni 75 santimetrekarelik hücre kültürü flaskına iki mililitre SF nine hücre süspansiyonunu, %10 FBS içeren sekiz mililitre grace's böcek besiyeri ile ekleyin. Log fazı büyümesini sürdürmek için flaskı elinizle nazikçe sallayın.Ardından, hücreleri konfluens olana kadar tekrar 27 °C'de inkübe edin. İnkübasyonun ardından, SF nine hücreleri, yazılı prosedürde belirtildiği üzere floresan işaretli pkcs ekspresyonu için kullanıma hazırdır. Plegia nöronal hücre kültürleri, daha önce tanımlandığı gibi mattech cam tabanlı kültür kaplarında hazırlanır. Duyusal nöronların izolasyonundan iki gün sonra, daha önce hazırlanmış fast green stok çözeltisini bir şırınga ve 0,2 µm gözenek boyutuna sahip 20 mm'lik bir şırınga filtresi kullanarak süzün.Distile su içerisinde %0,5 fast green içeren, konsantrasyonu µL başına 0,4 mikrogram'dan yüksek olmayan E-G-F-P-P KC API iki için kodlayan plazmid DNA çözeltisi hazırlayın. Plazmid DNA fast green çözeltisini, bir mililitrelik şırınga ve 0,2 mikron gözenek boyutuna sahip dört milimetrelik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin. Ardından, plazmid DNA fast green çözeltisini bir mikrosantrifüj kullanarak 15 dakika boyunca 16.110 G'de santrifüjleyin.Ardından, bir mikro elektrot çekici kullanarak nöronların mikro enjeksiyonu için keskin elektrotlar hazırlayın. İçinde filamentler bulunan ince duvarlı cam kapilerler kullanarak cam mikro elektrotlar çekin. Her bir elektrodu iki mikrolitre plazmid DNA fast green çözeltisi ile doldurun.Mikro yükleme pipet ucu kullanılarak, mikroenjeksiyon istasyonunda mikroenjeksiyon gerçekleştirilir. Mikroenjeksiyon istasyonu, titreşim izolasyon tablası üzerinde kültür kaplarını tutmaya yarayan ev yapımı büyük bir cam sahne, harici halojen aydınlatmalı bir stereoskop, bir mikro manipülatör ve pnömatik bir pompaya bağlı bir mikro elektrot tutucudan oluşur.Pnömatik pompanın basınç girişi, sıkıştırılmış azot tankına bağlanır. Plegia nöron kültürlerini içeren matech cam tabanlı kültür kabını mikro enjeksiyon istasyonuna aktarın ve mikro elektrot tutucuya bir mikro elektrot yerleştirin. Nöronları bir stereo mikroskop altında inceleyin ve mikro pipetin ucunu hücre çekirdeğine yerleştirin.Çekirdek tamamen yeşil olana kadar, 10 ila 100 milisaniye süreli ve 20 pounds per square inch basınçta kısa azot basınç darbeleri uygulayın. Hücreleri oda sıcaklığında dört saat inkübe edin ve kullanıma kadar dört degrees Celsius'ta saklayın. Hem SF nine hücrelerinin hem de plegia duyusal nöronlarının görüntülenmesi için axia avert 200 donanımlı bir Zeiss LSM five 10 ters konfokal mikroskop kullanılır.Plegia duyusal nöronlarının görüntülemesi bu videoda gösterilmektedir. SF nine hücrelerinin görüntülemesine ilişkin detaylar yazılı protokolde bulunabilir. EGFP proteini ile etiketlenmiş PKC'yi görüntülemek için %50 lazer çıkışına sahip 30 milliwatts argon lazer kullanın.Ardından, Argonne lazer hattını %4 transmisyon çıkışına kadar sönümleyin. Daha sonra iğne deliğini bire ayarlayın, kültür kabını görüntüleme tablası üzerinde sabitleyin ve hareketten veya titreşimden kaçının. 10 mL'lik bir pipet kullanarak kaptan 1 mL kültür ortamını nazikçe alın ve toplam 1 mL hacim bırakın.Kap içerisinde, çekirdeğin görülebildiği hücrelerin orta bölümünü bulun. 30 saniyelik zaman aralıklarıyla 10 ila 20 konfokal görüntüden oluşan bir zaman serisi ayarlayın.Videoyu başlatın ve ikinci fotoğraf çekildikten sonra, iki kat konsantrasyonda bir mililitre ilaç yavaşça ekleyerek translokasyonu indükleyin. İlacı yaklaşık 30 saniye boyunca sürekli olarak hücrelerin üzerine damla damla ekleyin. Burada, ilaç uygulamasının hemen ardından görünür hale gelebilen hızlı bir translokasyonu indüklemek için serotonin kullanılmıştır.Bazı ilaçlar, ancak işlemden 5 ila 10 dakika sonra optimum seviyeye ulaşan yavaş bir translokasyona neden olur; ilacı, iki adet 10 mililitrelik pipet kullanarak yıkayın; yıkama tamponunu bir pipetle kabın bir kenarından nazikçe aşağıya doğru eklerken, diğer kenardan medyumu yukarıya doğru çekin. Yıkama etkiliyse ve ilacın etkisi geri döndürülebilirse, PKC 30 ila 60 saniye içinde tekrar sitozole dönecektir. Videoyu gösterildiği gibi bir LSM dosyası olarak kaydedin.Plegia duyusal nöronlarında PKC translokasyonunun canlı görüntülemesine ait temsili sonuçlar burada verilmiştir. E-G-F-P-P KC APL two bir duyusal nöronda eksprese edilmiş ve 30 saniyelik zaman aralıklarıyla bir dizi 10 konfokal görüntü kaydedilmiştir. Bu örnekte, 30 saniyelik kayıt sürecinin ardından kaba serotonin eklenmiştir.Bu örnekte, SF nine hücrelerinde PKC translokasyonunun canlı görüntülemesi gösterilmektedir. E-G-F-P-P KC APL one ve M-R-F-P-P KC APL two, SF nine hücrelerinde birlikte eksprese edilmiş ve 30 saniyelik zaman aralıklarıyla bir dizi 10 konfokal görüntü kaydedilmiştir. One two DIOCTYL SN glycerol.30 saniyelik kayıttan sonra kaba hücre geçirgen bir DYL gliserol analoğu eklenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, aplazia duyusal nöronlarında floresan işaretli pkcs'lerin nasıl eksprese edileceği ve canlı hücrelerde PKC translokasyonunun nasıl görüntüleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

live-imaging-pkc-translocation-sf9-cells-aplysia-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, canlı hücre görüntüleme asimetrik sağlam duyu organı progenitör hücreleri ve epidermal hücrelerin bölünmesi için bir metodu...

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Biz intrasellüler serbest kalsiyum konsantrasyonu ve sinaptik etkinliği değişiklikleri eşzamanlı bir ganglion hazırlanmasında nasıl takip edilebileceğini...

Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler<em&gt; Aplysia&#39;nın</em

Kaynak: Jongbloets, B. C., {{}} et al. Protein Kinaz A'nın Görselleştirilmesi: İn Vivo İki Fotonlu Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanılarak Başa Sabit Davranan Farelerde Aktivite. (2019) Bu video, zorlanmış hareket sırasında kafası sabit, davranan farelerde protein kinaz A aktivitesini görselleştirmek için iki fotonlu floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu prosedürünü göstermektedir.

İki Fotonlu Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanarak Bir Farede Protein Kinaz A Aktivitesinin Görselleştirilmesi 

Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonlar ve hücre içi taşıma çalışma için iyi bir modeldir. Burada, vivo içinde kayıt ve analiz C. elegansaksonlar ve intraflagellar taşıma için bir protokol açıklayın.

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Bir prosedür protein kinaz görselleştirmek için sunulmuştur baş-sabit, davranan fareler bir aktivite. Gelişmiş A-kinaz aktivite muhabiri, tAKARα, kortikal nöronlar içinde ifade edilir ve kafatası penceresinden görüntüleme için erişilebilir hale gelmiştir. İki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskopisi, uygulanan lokomotif sırasında PKA etkinliklerini görselleştirmek için kullanılır.

In vivo Iki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu kullanarak kafa-sabit davranan fareler Içinde bir aktivite, protein kinaz görselleştirme

Bu protokol, transgenik olmayan omurgasız türlerde, absorbans voltajı duyarlı boyalar ve bir fotodiyot dizisi kullanılarak nöronal popülasyon aktivitesini tek hücreli çözünürlükle görüntüleme için bir yöntem sunar. Bu yaklaşım, görüntüleme ve analizin tek bir gün boyunca takip edilebildiği hızlı bir iş akışı sağlar.

Transgenik Olmayan Omurgasızlarda Tek Nöron Çözünürlüğü ile Ağ Dinamiklerini Kaydetmek için Fotodiyot Tabanlı Optik Görüntüleme

Bu protokol, Fibrin pıhtıları kullanılarak numune hareketsizleştirme uygulamalarını açıklar, sürüklenmeyi sınırlar ve canlı görüntüleme sırasında reaktiflerin eklenmesine ve yıkanmasına izin verir. Örnekler, bir kapak parçasının yüzeyinde kültür ortamı içeren bir fibrinojen damlasına aktarılır, daha sonra trombin eklenerek polimerizasyon indüklenir.

Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Bu makalede, Otomatik çok kanallı görüntüleme ve mekanobiyolojik analizin Evet ilişkili proteinin (YAP) mekano duyarlılığını aydınlatmasını sağlayan entegre çok fonksiyonlu ve kullanıcı tarafından programlanabilir bir sistemin nasıl kullanılabileceğine dair ayrıntılı bir adım adım protokol sunulmaktadır.

Çok Fonksiyonlu Bir Sistem Kullanarak İnsan Kanseri ve Normal Hücrelerde Evet İlişkili Proteinin Tamamen Optik Mekanobiyoloji Sorgulaması

Burada, aksonal taşıma üzerindeki patolojik protein kaynaklı etkileri analiz etmek ve bu etkilere aracılık eden mekanik yolları belirlemek için primer hipokampal kemirgen nöronlarının transfeksiyonunun canlı hücre konfokal görüntüleme ile nasıl birleştirileceğini gösteriyoruz.

Primer hipokampal nöronlarda patolojik proteinlerin aksonal taşıma üzerindeki etkilerini ölçmek için canlı hücre görüntülemenin kullanılması

Öğrenin, canlı hücrelerde floresan etiketli PKC translokasyonunu lazer tarama mikroskobisi ile görüntüleme yöntemini. Aplysia duyu nöronları ve Sf9 hücrelerinde gerçek zamanlı sinyal iletimi dinamiklerini inceleyin.

Canlı görüntüleme Sf9 Hücreler ve PKC Translokasyon Aplysia Duyu Nöronlar

Daha fazla video keşfet