Name: İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) tarafından Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profil Gaz-Sıvı Kromatografi (GLC) ile birleştiğinde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Öğrenin ince tabaka kromatografisi ve gaz-sıvı kromatografisi kullanarak Arabidopsis thaliana fide polar gliserolipid profilini belirleme yöntemini. Bu basit ve sağlam teknik, bitki lipid metabolizması araştırmalarında değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, ABD Ulusal Bilim Vakfı Christoph Benning bir hibe ile desteklenmektedir.

1. Lipid Ekstraksiyon <ol><li> 30 mg agar üzerinde yetiştirilen bitkiler 4 hafta eski Arabidopsis yaprakları orta ya da toprak katılaşmış ve 1,5 mL polipropilen reaksiyon tüpleri içine transfer hasat tarafından lipid ekstraksiyon başlayın. Taze yaprakları flaş sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C'de saklanabilir. </li><li> Metanol oluşan solvent 300 mcL çıkarma, kloroform ve formik asit (20:10:01, v / v / v) her numune ekleyin. (Bir boya Shaker ya da benzeri kullanarak) 5 dakika çalkalanır. </li><li> 0.2 M fosforik asit (H 3 PO 4), 1 M potasyum klorür (KCl) ve vorteks kısaca 150 mcL ekleyin. </li><li> 1 dakika boyunca oda sıcaklığında 13.000 xg'de santrifüjleyin. Alt kloroform fazında çözünmüş Lipidler TLC plakaları damlatılan olacaktır. </li></ol> 2. İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) 15 <ol><li> Batığın 0.15 M amonyum sülfat ((NH 4) 2 SO 4) solüsyonu içine 30 saniye için şerit yükleme 20cmX20cm ile silika jel kaplı TLC plağı, TLC plakaları hazırlamak için, 30 saniye boyunca daldırarak sonra, en az 2 gün boyunca tabak kuru kapalı bir kapta. Etkinleştirme sırasında diğer glycerolipids ayrılması için gerekli phosphatidylglycerol protonates sülfürik asit, amonyum süblimasyon arkasında bırakır. </li><li> Deney günü etkinleştirmek 120 fırında pişirme tarafından plakaları TLC ° C, 2,5 saat süreyle. </li><li> Oda sıcaklığına kadar aktive edilmiş plakalar Soğuduktan sonra, plaka üzerinde kromatogram kökeni (plaka kenarından 1,5 cm) düz bir çizgi çizmek için bir kalem kullanın. </li><li> Davlumbaz, yavaş yavaş bir akışı altında N 2 200 mcL sarı plastik ipuçları ile 20 mcL pipet kullanarak alt kloroform faz 3 X 20 mcL lipid özü teslim. Bu amaçla, bir Tygon Boru N 2 tank, regülatör bağlıdır. Spot çapı 1 cm'den daha küçük tutunuz. Her plaka 10 örnek (sonraki GLC analiz planlanan olduğunda) kadar tutabilir. </li><li> Lipid davlumbaz tamamen kuru noktalar gibi, aseton, toluen, su (30 ml: 7.5 ml 91 ml) oluşan gelişmekte olan solvent hazırlar. Ortam bağıl nem yüksek ise, ayrılık etkilenebilir. Bu durumda istenen ayırım elde (7.0 ml: 30 ml 91 ml) su vermek azaltılmalıdır. </li><li> 80 ml çözücü gelişmekte olan ve aşağı bakacak şekilde örnek sonuna tankına plaka odası (H: W = 27.0: 26.5 7.0 cm / cm / cm L) gelişmekte olan bir yapışmalı, TLC içine dökün. Tank kelepçe kullanarak Seal. Solvent plaka yükselmek ve lipidler ayrılacaktır. Geliştirme zamanını, oda sıcaklığında yaklaşık 50 dakika mesafededir. </li><li> Çözücü ön plaka üstten 1 cm ulaştığında, dikkatlice plaka tanktan çıkarın ve yaklaşık 10 dakika için davlumbaz tamamen kuru. </li><li> TLC ayrılmış Lipidler kantitatif analiz ya da sülfürik asit veya α-naftol geri dönüşümsüz lekeli iyot ile ya da geri dönüşümlü kısaca lekeli olabilir. <ol><li> Sülfürik asit yanmaları:% 50 sülfürik asit, davlumbaz ve fırında 120 ° C'de 15 dakika (Şekil 2A) spreyli cam bir şişede su spreyi plaka. </li><li> glikolipitler için α-naftol boyama:% 2.4 (w / v)% 10 α-naftol (v / v), sülfürik asit,% 80 (v / v) etanol ve fırında 120 ° C plaka uygulaması için 3-5 glikolipid bantları kadar dakika (Şekil 2B), pembe veya mor lekeli. Aşırıtedavi reaktif sülfürik asit varlığı nedeniyle tüm lipidler yanmaları için yol açacaktır. </li><li> İyot boyaması: davlumbaz plaka, iyot kristalleri ile kapalı bir TLC (lipidler görünür olana kadar iyot buharı ile atmosferin doygunluk önde gelen altındaki bir tepsi) tankı içine yerleştirin. Iyot iyot kovalent çoklu doymamış yağ asitleri (Şekil 2C) değiştirebilir gibi çok uzun plaka maruz bırakmayın. Alternatif olarak, örnek şeritli serpiştirilmiş sadece standart şerit N 2 ayrı standart şerit üzerinde üflenir iyot kristalleri ile Pasteur pipeti takılı bir cam yünü kullanılarak boyandı olmalıdır, lipidlerin herhangi bir oksidasyon önlemek için. </li></ol></li></ol> 3. Yağ Asil metilester (FAME) Reaksiyon 16 <ol><li> Bir jilet ile TLC plağı silika çevreleyen lipit noktalar tespit çıkarın. Lipit içeren silika kazıyın ve Teflon (PTFE) kaplı vidalı kapaklı cam tüp içine bir huni kullanarak silis tozu aktarımı. </li><li> Cam pipet ile her bir örnek susuz metanol 1 ml 1 N hidroklorik asit (HCl) ekleyin. </li><li> 200 mcL sarı plastik ucu ile 200 mcL pipet kullanarak iç standart olarak her numune için 200 mcL pipet kullanarak 100 mcL 50 mg mL -1 pentadecanoic asit (15:00) ekleyin. Bir tüp kontrol olarak sadece pentadecenoic metanol HCl asit ile tutun. Cam tüpler Teflon kaplı kapakları sıkıca kapatın. </li><li> Inkübe gl25 dakika boyunca 80 ° C su banyosu göt tüpleri. Solvent buharlaşma olmaz böylece Tüpler mühürlü olması gerekir. </li><li> Tüpler soğutulduktan sonra, şiddetle 1 ml hekzan ve vorteks 1 ml% 0.9 sodyum klorür ekleyin. 3 dakika için 1000xg numune santrifüjleyin. </li><li> Davlumbaz, Pasteur pipeti ile örnek hekzan / üst tabakayı kaldırmak ve yeni bir 13x100 mm cam tüp içine yerleştirin. </li><li> N 2 yavaş bir akışı tamamen kuruması beklenmeden altında hekzan buharlaşır. </li><li> 60 mcL hekzan çıkan yağ açil methylesters s eritin. Örnekleri otosampler şişeleri ve kapağı sıkıca içine aktarın. Numuneler, kısa vadeli ve -20 ° C ° C bir kaç gün için 4 saklanabilir. </li></ol> 4. Gaz-Sıvı Kromatografi (GLC) 10 <ol><li> GLC başlamadan önce, helyum, hidrojen ve hava tüpleri dolu olduğundan emin olun. </li><li> Yeterli hekzan, solvent rezervuar eklendi olmalı ve atık kabını boş olmalıdır. Yağ açil methylesters ayrılması için, makineyi bir DB-23 sütun ekleyebilirsiniz. </li><li> Otosampler yerleştirmek gözlerdir. Sistemi bilgisayar GLC ChemStation yazılımını başlatın. </li><li> Giriş sıcaklığı 250 ° C helyum akış hızı ve 48.6 mL dak -1 21.93 psi basınç. Ayarlayın Split oranı 30.0: 1. </li><li> Fırın sıcaklığı 140 ° C 'de 2 dakika süreyle başlangıçta ortaya konan ve 160 ° C - 25 ° C min -1 hızında kaldırdı . Ardından 160 artış sıcaklığını ayarlamak ° C ila 250 ° C hızında 8 ° C min -1 ve 250 tutun ° C - 140 azalma takip 4 dk ° C hızında 38 ° C min - 1. Bir vadede yaklaşık 21 dakika sürer. </li><li> Alev iyonizasyon dedektör sıcaklığı 270 ° C ve hidrojen debisi 30.0 mL dak -1, hava debisi 400 mL dak -1 ve helyum debisi 30.0 mL dak -1. </li><li> Şişeleri ve çalışma sıra tabloda örnek isimleri numarasını girin. 10 mcL enjektör, flakon başına 2 mcL örnek enjekte etmek için ayarlayın. </li><li> Cihaz hazır olduğunda, çalışma dizisi başlatmak. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: 4 haftalık Arabidopsis fide TLC ayrılmış lipitlerin geri dönüşü olmayan boyama örnekleri Şekil 2'de gösterilmiştir. Sülfürik asit lekeli lipidler (Şekil 2A) kömürleşmiş ve kahverengi lekeler olarak görünür. α-naftol diğer polar lipid (Şekil 2B) sarı leke α-naftol pembe-mor bir renk taşıyan boyanmış vb Glikolipitler SQDG DGDG gibi MGDG glikolipitler leke tercih edilir. Iyot boyama geri dönüşümlüdür ve lipidler, iyot buharlaşır (Şekil 2C) gibi kısa bir zaman içinde kaybolur sarımsı bir renk verir. Lekesiz lipidler Lipidlerin yıkmak azaltmak için tercih edilir rağmen Kısaca iyot lekeli lipidler GLC analiz tabi tutulabilir. Başarılı bir şekilde yapılırsa, farklı Yağ açil metilester temsil eden ayırt edici sinyaller (Şekil 3) GLC sonra gözlenen olacaktır. Yağ açil metilester kısa karbon zinciri ve daha az çift bağ ile DB-23 sütun kullanarak kısa tutma süresi var. Yağ açil metilester profil değişmiş lipid kompozisyonu ile mutantlar tanımlamak için hassas bir araçtır. Şekil 4'te, vahşi tip 18 ile karşılaştırıldığında tgd4-1 mutant MGDG18: 3 yağ asidi molar oranda azalmıştır. Yağ açil metilester bir lipid sınıf için tüm lipid sınıflarının mol mol bölerek, her lipid molar oranı hesaplanır. Örneğin, MGDG molar oranını hesaplamak için: (MGDG) mol% = Σ [Fames (MGDG)] / Σ [Fames (toplam)] x100% Yabani tip ve mutant her lipid sınıfı molar oranları mukayese edilebilir. Örneğin, tgd4-1 mutant MGDG ve PG göreceli miktarları artmış ama DGDG ve PE (Şekil 5) 18 miktarda azalma var. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Arabidopsis fide kullanarak polar lipit analizi akış şeması. Toplam lipidler, 4 haftalık Arabidopsis fide çıkarılan ve TLC ayrılır . Ayrılmış lipidler GLC analizi ile takip transesterifikasyon TLC plağı kazınmış olabilir. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 TLC plakaları üzerinde lipitlerin ayrılması. 35 mg lipid özleri (taze ağırlık) vahşi tip fide TLC ayrılmış ve sülfürik asit (A), α-naftol (B) veya iyot buharı (C) ile boyanan. Üç tekrarlar, her boyama yöntemi gösterilmiştir. DGDG, digalactosyldiacylglycerol; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; PC, fosfatidilkolin, PE, phosphatidylethanolamine; PG, phosphatidylglycerol; PI, fosfatidilinositol; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Yağ Asitleri Methylesters GLC analizi (Fames) vahşi tip MGDG türetilmiştir. Fames 30 m kılcal sütun üzerinde ayrılır ve alev iyonizasyon tarafından tespit edilir. Pentadecanoic asit (15:00) bir iç standart olarak kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 vahşi tip Süt2 (beyaz sütunlar) ve mutant tgd4-1 (siyah sütunlar) MGDG Yağ asidi profili. Yağ asitleri çift bağların sayısına göre takip karbonlar sayısı olarak sunulmaktadır. Üç tekrarlar ortalama ve standart sapmaları gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 vahşi tip Süt2 (beyaz sütunlar) Polar lipidler kompozisyon ve tgd4-1 mutant (siyah sütunlar). Üç tekrarlar ortalama ve standart sapmalar hata bar gösterilmiştir.

<ol><li>Ajjawi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+reverse+genetics+in+Arabidopsis%3A+case+studies+from+the+Chloroplast+2010+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale reverse genetics in Arabidopsis: case studies from the Chloroplast 2010 Project.</a> Plant Physiol. 152, 529-529 (2010).</li>
<li>Andersson, M. X., Kjellberg, J. M., Sandelius, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+cytosolic+lipases+in+converting+phosphatidyl+choline+to+substrate+for+galactolipid+synthesis+in+the+chloroplast+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The involvement of cytosolic lipases in converting phosphatidyl choline to substrate for galactolipid synthesis in the chloroplast envelope.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1684, 46-46 (2004).</li>
<li>Awai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phosphatidic+acid-binding+protein+of+the+chloroplast+inner+envelope+membrane+involved+in+lipid+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A phosphatidic acid-binding protein of the chloroplast inner envelope membrane involved in lipid trafficking.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, e10817-e10817 (2006).</li>
<li>Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+lipid+transport+involved+in+organelle+biogenesis+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of lipid transport involved in organelle biogenesis in plant cells.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 71-71 (2009).</li>
<li>Browse, J., McCourt, P. J., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+leaf+lipids+determined+after+combined+digestion+and+fatty+acid+methyl+ester+formation+from+fresh+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of leaf lipids determined after combined digestion and fatty acid methyl ester formation from fresh tissue.</a> Anal. Biochem. 152, 141-141 (1986).</li>
<li>Dormann, P., Balbo, I., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+galactolipid+biosynthesis+and+lipid+trafficking+mediated+by+DGD1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis galactolipid biosynthesis and lipid trafficking mediated by DGD1.</a> Science. 284, 2181-2181 (1999).</li>
<li>Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+photosystem+II+at+2.9-A+resolution+and+the+role+of+quinones%2C+lipids%2C+channels+and+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial photosystem II at 2.9-A resolution and the role of quinones, lipids, channels and chloride.</a> 16, 334-334 (2009).</li>
<li>Hartel, H., Dormann, P., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGD1-independent+biosynthesis+of+extraplastidic+galactolipids+after+phosphate+deprivation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DGD1-independent biosynthesis of extraplastidic galactolipids after phosphate deprivation in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 10649-10649 (2000).</li>
<li>James, A. T., MARTIN, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-liquid+partition+chromatography%3B+the+separation+and+micro-estimation+of+volatile+fatty+acids+from+formic+acid+to+dodecanoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Gas-liquid partition chromatography; the separation and micro-estimation of volatile fatty acids from formic acid to dodecanoic acid.</a> Biochem. J. 50, 679-679 (1952).</li>
<li>Jordan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution.</a> Nature. 411, 909-909 (2001).</li>
<li>Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-B+monogalactosyldiacylglycerol+synthases+are+involved+in+phosphate+starvation-induced+lipid+remodeling%2C+and+are+crucial+for+low-phosphate+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Type-B monogalactosyldiacylglycerol synthases are involved in phosphate starvation-induced lipid remodeling, and are crucial for low-phosphate adaptation.</a> Plant J. 57, 322-322 (2009).</li>
<li>Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+ATPase+protein+of+Arabidopsis%2C+TGD3%2C+involved+in+chloroplast+lipid+import%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A small ATPase protein of Arabidopsis, TGD3, involved in chloroplast lipid import.</a> J. Biol. Chem. 282, 35945-35945 (2007).</li>
<li>Ohlrogge, J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid biosynthesis.</a> Plant Cell. 7, 957-957 (1995).</li>
<li>Stahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography%3B+methods%2C+influencing+factors+and+an+example+of+its+use%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmazie%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography; methods, influencing factors and an example of its use.</a> Pharmazie. 11, 633-633 (1956).</li>
<li>Stoffel, W., INSULL, W., AHRENS, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-liquid+chromatography+of+highly+unsaturated+fatty+acid+methyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Gas-liquid chromatography of highly unsaturated fatty acid methyl esters.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 99, 238-238 (1958).</li>
<li>Welti, R., Wang, X., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+scan+modes+for+plant+chloroplast+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization tandem mass spectrometry scan modes for plant chloroplast lipids.</a> Anal. Biochem. 314, 149-149 (2003).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+trafficking+between+the+endoplasmic+reticulum+and+the+plastid+in+Arabidopsis+requires+the+extraplastidic+TGD4+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid trafficking between the endoplasmic reticulum and the plastid in Arabidopsis requires the extraplastidic TGD4 protein.</a> Plant Cell. 20, 2190-2190 (2008).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+TGD1+chloroplast+envelope+protein+affects+phosphatidate+metabolism+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Mutation of the TGD1 chloroplast envelope protein affects phosphatidate metabolism in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 17, 3094-3094 (2005).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permease-like+protein+involved+in+ER+to+thylakoid+lipid+transfer+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A permease-like protein involved in ER to thylakoid lipid transfer in Arabidopsis.</a> EMBO J. 22, 2370-2370 (2003).</li>
</ol>

TLC GLC ile birleştiğinde tesislerinde polar lipid kantitatif analiz için sağlam ve hızlı bir araç sağlar. Lipid bileşimi küçük değişiklikler tespit edilebilir, bu nedenle bu yöntem, polar lipid metabolik yollar 1,20 engelli mutantlar büyük ölçekli tarama için kullanılır olmuştur . Bu yöntem ayrıca, substrat olarak polar lipidler kullanan enzimler izleme faaliyetleri için yaygın olarak kullanılır . 2,6,7 Yaprakları yanı sıra, bu kök ve tohumları veya kloroplast ve mitokondri gibi hücre içi fraksiyonları gibi diğer bitki dokularının lipid kompozisyonu da aynı şekilde tespit edilebilir. Burada kullanılan çözücü sistemi (aseton, toluen, su), bitkilerde glikolipitler ve fosfolipidlerin ayrılması için optimize edilmiştir. Ancak, tgd1, 2,3,4 mutantlar ve izole kloroplastların tetragalactosyldiacylglycerol PC ile çalışırken TGDG PE ile birlikte çalışır. Bu durumda, kloroform, metanol, asetik asit ve su (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) ile çözücü sistem 13 kullanılır . Bazen iki farklı çözücü sistemlerini kullanarak iki boyutlu TLC, daha fazla ayrı glikolipitler ve fosfolipitler 19 yapılır . Buna ek olarak, bitki dokularında doğrudan TLC 5 başlangıç ​​ayrımı olmadan toplam yağ asidi profili belirlemek için GLC takip FAME reaksiyon tabi olabilir. Gösterdi TLC GLC sisteminin yanı sıra, lipid profili kullanılan başka bir yöntem, doğrudan elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometresi 17 dayanmaktadır . Bu yöntemde ilk kromatografik ayırma özü lipitlerin atlanır. Ancak, bu yöntem, laboratuvar veya mutant taraması için rutin analizler için daha az kullanışlı hale getirir pahalı ekipman ve deneyimli personel gerektirir.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-naftol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>Metanolik HCl 3N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33050-U</td><td>Metanol ile 1N'e seyreltin</td></tr><tr><td>Si250-PA TLC plakaları</td><td>JT Baker</td><td>7003-04</td><td>Ön emici tabakalı</td></tr><tr><td>TLC tankı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z266000</td><td></td></tr><tr><td>Vidalı kapaklı tüpler</td><td>VWR international</td><td>53283-800</td><td></td></tr><tr><td>Vidalı kapaklar</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td></td></tr><tr><td>PTFE disk</td><td>Sun Sri</td><td>200 608</td><td></td></tr><tr><td>GLC sistemi</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP6890</td><td></td></tr><tr><td>DB-23 kolonu</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>122-2332</td><td></td></tr><tr><td>GLC vialleri</td><td>Sun Sri</td><td>500 132</td><td></td></tr><tr><td>GLC vial kapakları</td><td>Sun Sri</td><td>201 828</td><td></td></tr><tr><td>Chemstation yazılımı</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2070AA</td><td></td></tr></tbody></table>

İnce tabaka kromatografisi (tlc) tarafından arabidopsis thaliana polar glycerolipid profil gaz-sıvı kromatografi (glc) ile birleştiğinde

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biyolojik membranlar ayrı hücreler çevreden. Fosfatidilkolin veya phosphatidylethanolamine, hücreleri ve çevreleri arasındaki kimyasal değişimi için hem sınırları ve arayüzleri olarak hareket form bilayeri membranlar gibi çok hücreli bitki ve hayvanlar, glycerolipids, tek bir hücre. Hayvanların aksine, bitki hücreleri fotosentez için özel bir organel kloroplast var. (MGDG) monogalactosyldiacylglycerol digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4: kloroplastın karmaşık membran sistemi yani benzersiz glycerolipids, fosfor eksikliği glikolipitler içerir. Bu lipitlerin rolleri sadece yapısal dışındadır. Bu glikolipitler ve diğer glycerolipids fotosistem I ve II fotosentez 8,11 glycerolipids katılımı gösteren kristal yapıları bulundu. Fosfat açlık sırasında, DGDG fosfolipitler 9,12 kaybını telafi etmek extraplastidic membranlar aktarılır. Bu lipitlerin biyosentezi ve fonksiyon bilgimizin Arabidopsis thaliana 14 ile biyokimyasal ve genetik çalışmalar bir arada elde edilmiştir. Bu çalışmalar sırasında, polar lipid analizi için basit bir prosedür lipid mutantlar tarama ve analiz için gerekli ve detaylı olarak özetlenen olacaktır. Bir yaprak lipid özü ilk ince tabaka kromatografisi (TLC) ile ayrılmış ve glycerolipids iyot buharı ile geri dönüşümlü lekeli. Bireysel lipidler TLC plağı koparılmış ve alev iyonizasyon algılama (FID GLC) (Şekil 1) ile birleştiğinde gaz-sıvı kromatografisi ile analiz edilir yağ açil methylesters (Fames) dönüştürülür. Bu yöntem, mutant tarama için güvenilir bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Örneğin tgd1, 2,3,4 endoplazmik retikulum-plastid lipid kaçakçılığı mutantlar anormal bir galactoglycerolipid birikimine dayalı bulunmuştur: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) ve göreli 18:03 miktarda bir azalma (karbonlar: double bağ) 3,13,18,20 zarı lipidler yağ açil grupları. Bu yöntem ayrıca substrat 6 olarak lipidler kullanarak proteinlerin enzimatik faaliyetleri belirlemek için uygulanabilir.

Polar lipid özler bireysel glycerolipids Kompozisyon ve yağ asidi kompozisyonu basit ve sağlam bir lipid profil deneyde belirlenir. Bu amaçla, glycerolipids ince tabaka kromatografisi ile izole edilir ve onların açil grupları transmethylation tabi. Yağ açil methylesters gaz-sıvı kromatografisi ile sayısallaştırılmış.

İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) tarafından Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profil Gaz-Sıvı Kromatografi (GLC) ile birleştiğinde

Biyolojik membranlar hücreleri çevreden ayırır. Tek bir hücreden çok hücreli bitki ve hayvanlara kadar, ... gibi gliserolipitler,

Bu prosedürün genel amacı, arabidopsis fidelerinin polar lipid kompozisyonunu belirlemektir. Bu işlem, öncelikle fidelerden lipidlerin ekstrakte edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra polar lipidler, ince tabaka kromatografisi ile ayrıştırılır.Ardından, ince tabaka plakadan spesifik lipid lekeleri izole edilir ve transesterifikasyon yoluyla yağ asidi metil esterlerine dönüştürülür. Prosedürün son adımı, yağ asidi metil esterlerinin bileşiminin gaz-sıvı kromatografisi ile nicelendirilmesidir. Nihayetinde, yabanıl tip ve mutanttaki her bir polar lipidin molar oranını ve yağ asidi profilini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, benim adım Christophe Benning. Birçoğunuz polar lipidlerin kantitatif analizinin nasıl yapılacağını bize sordunuz. Model bitki Arabidopsis thaliana veya RG kilometer motors'daki mutantların geniş ölçekli taramaları sırasında bize büyük fayda sağlayan, oldukça basit ve güvenilir bir yöntem kullanıyoruz.Kütle spektrometrisi tabanlı lipid profilleme gibi diğer mükemmel yöntemler, pahalı ekipmanların yanı sıra yoğun deneyim ve eğitim gerektirir. Biz, mutantların izolasyonunu takiben basit ince tabaka kromatografisinin yağ asidi metil esterlerinin kantifikasyonu ile birleştirildiği iki aşamalı bir prosedür kullanıyoruz. Genellikle daha kantitatif bir analiz gereklidir.Bu işlem, ince tabaka plakasından membran lipidlerinin izole edilmesi ve sıvı gaz kromatografisi ile miktar tayini yapılan yağ asidi metil esterlerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Yöntem yüksek düzeyde tekrarlanabilirdir ve sonuçlar, prosedürün uygulanabilirliğini kanıtlayacak şekilde daha karmaşık kütle spektrometrisi tabanlı tekniklerle karşılaştırılabilir düzeydedir. Laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Zen Wang, agar katılaştırılmış ortamda veya toprakta yetiştirilen dört haftalık Arabidopsis yapraklarından 30 miligram hasat ederek lipid ekstraksiyonuna başlayacaktır. Yaprakları 1,5 mililitrelik propilen reaksiyon tüplerine aktarın.Her bir örneğe metanol, kloroform ve formik asitten oluşan 300 µL ekstraksiyon çözücüsü ekleyin. Örnekleri beş dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın. Ardından, 150 µL 0.2 M fosforik asit ve 1 M potasyum klorür ekleyip vorteksleyin.Numuneyi 13,000 ×g hızında bir dakika boyunca kısa süreli santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, alt kloroform fazında çözünmüş olan lipidler ince tabaka kromatografisi plaklarına damlatılacaktır. TLC plaklarını hazırlamak için, yükleme şeritli 20 by 20 santimetre boyutundaki silika jel kaplı bir TLC plağını 0.15 M amonyum sülfat çözeltisine daldırın.30 saniye boyunca daldırdıktan sonra, plakayı kapalı bir kapta en az iki gün boyunca kurutun. Aktivasyon sırasında, amonyumun süblimasyonu, fosfatın ve diğer gliserol lipidlerinden ayrılması için gerekli olan gliserolün protonlanmasını sağlayan sülfürik asit bırakır. Deney günü, TLC plakalarını 120 °C'deki bir fırında iki buçuk saat boyunca pişirerek aktive edin.Aktive edilmiş plakalar oda sıcaklığına soğutulduktan sonra, kromatogramın başlangıç noktasına bir kurşun kalemle düz bir çizgi çizilir. Çeker ocak içerisinde, azot tankının regülatörüne bağlı tigon borular kullanılarak bir azot gazı akışı sağlanır ve alt kloroform fazındaki lipid ekstraktından üç kez 20 µL, yavaş bir azot gazı akışı altında 200 µL'lik sarı plastik uçlu bir pipet yardımıyla 20 µL'lik dozlar halinde plakaya aktarılır. Lekeyi bir santimetreden daha küçük tutmak için her seferinde 20 µL uygulanır.Lipid lekeleri tamamen kururken, her plaka 10 örneğe kadar taşıyabilir. Çeker ocakta aseton, toluen ve sudan oluşan geliştirme çözücüsünü hazırlayın. Kapatılabilir bir TLC geliştirme haznesine 80 milliliters geliştirme çözücüsü dökün ve plakayı tankın içine yerleştirin.Tankı, numune ucu aşağı bakacak şekilde kapatın. Klempi kullanarak solventin plakada yükselmesini sağlayın ve lipidleri ayırın. Geliştirme süresi oda sıcaklığında yaklaşık 50 dakikadır.Çözücü cephesi plakanın üst kısmından bir santimetre uzağa ulaştığında, plakayı tanktan dikkatlice çıkarın ve çeker ocak altında 10 dakika boyunca tamamen kurutun. TLC ile ayrılan lipidler, kantitatif analiz için kısa süreliğine iyot ile tersinir şekilde boyanabilir veya sülfürik asit ya da alfa naftol ile tersinmez şekilde boyanabilir. Tersinmez boyama için plakayı sülfürik asit ile kömürleştirerek boyayın.Plakayı, çeker ocak içerisinde cam bir sprey şişesi kullanarak suyla seyreltilmiş %50 sülfürik asit ile püskürtün ve 120 °C'de 15 dakika boyunca pişirin. Buna karşılık, glikolipidler için alfa naftol boyama yapılacaksa, plağı %10 hacimce/hacimce sülfürik asit ve %80 hacimce/hacimce etanol içeren %2,4 ağırlıkça/hacimce alfa naftol çözeltisi ile püskürtün; glikolipit lekeleri pembe veya mor renge boyanana kadar plağı 120 °C'de üç ila beş dakika boyunca pişirin.İyot boyaması gerçekleştirin. Bir çeker ocak içerisinde, tankın tabanındaki bir tepside iyot kristalleri bulunan kapalı bir LC tankı hazırlayarak atmosferin iyot buharı ile doygun hale gelmesini sağlayın. Lipidler görünür olana kadar TLC plakasını tankın içine yerleştirerek iyota maruz bırakın. İyot kovalent bağ kurabileceği için plakayı çok uzun süre iyoda maruz bırakmayın.Çoklu doymamış yağ asitlerini modifiye edin. TLC plakasında belirlenen lipid lekelerini çevreleyen silikayı jiletle çıkarın ve lipid içeren silikayı kazıyın. Bir huni kullanarak, silika tozunu Teflon kaplı vidalı kapaklı bir cam tüpe aktarın.Cam pipet kullanarak her örneğe, susuz metanol içinde bir molar hidroklorik asitten 1 mL ekleyin. Ardından, 200 µL'lik sarı plastik uçlu bir pipet yardımıyla, iç standart olarak her örneğe 50 µg/mL pentadekanoik asitten 100 µL ekleyin. Ayrıca, kontrol olarak sadece metanolik hidroklorik asit içinde pentadekanoik asit içeren bir tüp hazırlayın.Cam tüpleri Teflon kaplı kapaklarla sıkıca kapatın. Cam tüpleri 80 °C sıcaklıktaki bir su banyosunda 25 dakika boyunca inkübe edin. Tüpler soğuduktan sonra çözücünün buharlaşmaması için sızdırmaz şekilde kapatılmış olmalıdır.Bir mililitre %0.9 sodyum klorür ve ardından bir mililitre heksan ekleyin, ardından numuneleri güçlü bir şekilde vorteksleyin ve 1000 ×g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüj işleminin ardından, numunenin üst kısmındaki heksan tabakasını çekerle çekerle çekerle çekerle (pastur pipeti ile) çeker ocak altında alın ve yeni bir 13 x 100 mm'lik cam tüpe yerleştirin. Heksanı, tamamen kurutmadan yavaş bir nitrojen akımı altında uçurun ve oluşan yağ asidi metil esterlerini 60 µL heksan içerisinde çözün. Numuneleri otomatik örnekleyici şişelerine aktarın ve ardından sıkıca kapatın.Numuneler, kısa süreli olarak 4 °C'de ve GLC işlemine başlamadan önce birkaç gün boyunca -20 °C'de saklanabilir. Helyum, hidrojen ve hava tüplerinin dolu olduğundan; yağ asidi metil ester ayrımı için çözücü rezervuarına yeterli heksan eklendiğinden ve atık kabının boş olduğundan emin olun. Cihaza bir DB 23 kolonu bağlayın.Viyalleri otomatik örnekleyiciye yerleştirin. Sistem bilgisayarında GLC için chem station yazılımını başlatın. Giriş sıcaklığını 250 °C, helyum akış hızını 48.6 mL/dk ve basıncı 21.93 PSI olarak ayarlayın.Bölünme oranı 30'a birdir. Fırın sıcaklığı başlangıçta iki dakika boyunca 140 °C olarak ayarlanır ve dakikada 25 °C hızla 160 °C'ye yükseltilir. Ardından sıcaklığın dakikada 8 °C hızla 160 °C'den 250 °C'ye çıkması sağlanır; sıcaklık dört dakika boyunca 250 °C'de sabit tutulur ve sonrasında dakikada 38 °C hızla 140 °C'ye düşürülür.Bu sıcaklık profili kullanılarak, bir analiz yaklaşık 21 dakika sürer. Alev iyonizasyon dedektörünün sıcaklığı, 30 milliliters per minute hidrojen akış hızı ile 270 degrees Celsius'dir. Hava akış hızı 400 milliliters per minute ve helyum akış hızı 30 milliliters per minute'dir.Çalıştırma dizisi tablosuna flakon sayısını ve numune isimlerini girin. 10 µL'lik enjektörü, flakon başına iki µL numune enjekte edecek şekilde ayarlayın. Cihaz hazır olduğunda çalıştırma dizisini başlatın.Dört haftalık Arabidopsis fidelerinden TLC ile ayrıştırılmış lipidlerin boyama örnekleri burada gösterilmiştir. Sülfürik asit ile boyanmış lipidler kömürleşmiş olup kahverengi lekeler şeklinde görülür. M-G-D-G-D-G-D-G ve SQ dg gibi glikolipidleri boyamak için alfa natal tercih edilir.Alfa natal ile boyanan glikolipitler pembe mor bir renk alırken diğer polar lipitler sarıya boyanır. İyot boyaması geri dönüşümlüdür ve lipitlere, iyot buharlaştıkça kısa bir süre içinde kaybolacak sarımsı bir renk verir. Kısaca, iyotla boyanmış lipitler GLC analizine tabi tutulabilir; ancak başarılı bir şekilde gerçekleştirildiği takdirde, lipitlerin parçalanmasını azaltmak için boyanmamış lipitler tercih edilir.DB 23 kolon kullanılarak yapılan GLC işlemi sonrası, farklı yağ asidi metil esterlerini temsil eden belirgin sinyaller gözlemlenecektir; daha kısa karbon zincirlerine ve daha az çift bağa sahip olan yağ asidi metil esterleri daha kısa alıkonma süresine sahiptir. Yağ asidi metil esteri profillemesi, lipid kompozisyonu değişmiş mutantları belirlemek için hassas bir araçtır.MGDG 18 üç yağ asidi molar oranı, bir lipid sınıfı için yağ asidi metil ester mollerinin toplam yağ asidi metil ester mollerine bölünmesiyle, vahşi tip ile karşılaştırıldığında TGD four dash one mutantında azalmıştır. Tüm lipid sınıfları için her bir lipidin molar oranları hesaplanmış olup, hem vahşi tip hem de mutanttan elde edilen lipid sınıflarının molar oranları burada karşılaştırılabilir. TGD four dash one mutantının, MGDG ve pg'nin bağıl miktarlarının arttığı, ancak D-G-D-G-N-P-E miktarlarının azaldığı açıkça görülmektedir. İnce tabaka kromatografisi, birçok örneğin paralel olarak incelenmesine olanak tanır ve lipid profillerindeki temel farklılıkların görsel olarak incelenmesine imkan verir.Ayrıca, TLC'ye baktığınızda, aslında lipidlerin sentezi için gerekli olan ve dolayısıyla lipid profilini belirleyen birçok enzimi ve geni inceliyorsunuz. Bu videoyu izledikten sonra, polar lipidlerin kompozisyonunun TOC ve GOC ile nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Videoyu izlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

arabidopsis-thaliana-polar-glycerolipid-profiling-thin-layer

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bitki manikür, suyun korunması birincil bir rol vardır ancak bitkiler üzerindeki patojen mikroorganizma girişine karşı önemli bir bariyer bir balmumu dış kaplama. Bu video, ileri ve geri genetik yaklaşımlar tarafından belirlenen bitki manikür mutant analizi göstermektedir.

Bitki Tırnak biyosentezi keşfedin Arabidopsis eceriferum Mutants

Burada tam 15 N etiketli Arabidopsis thaliana hücre kültürleri etiketlenmemiş bir karışımına dayanan deterjan dayanıklı ve deterjan çözünür membran içine bitki plazma zarlarının parçalanması için ve in vivo güçlü bir yöntem açıklanmaktadır. Prosedür sinyal süreçleri anlamak için karşılaştırmalı proteomik çalışmalar için uygulanır.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Memeli integument bireysel türlerin kimyasal bileşimleri özelliği sağlayabilir çözücü-ekstrakte lipidler içerir. Bu çalışma, ince tabaka kromatografisi kullanılarak deriye ait dokulardan izole geniş bir lipit sınıfları ayıran ve matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon time-of-flight kütle spektrometresi ile triasilgliseridler profilini belirlemek için rutin bir yöntem sunar.

Hazırlayıcı ince tabaka kromatografisi ve MALDI-TOF kütle spektrometresi ile Bat Örtü Lipidler triasilgliseridler İçeriği profil

Floem sap bileşimi yanı sıra yükleme ve uzun mesafe taşıma mekanizmasının Bilgi bitki gelişimi ve stres / patojen yanıt olarak ve ulaşım asimile uzun mesafe sinyal anlaşılması için gereklidir. Bu el yazması EDTA-kolaylaştırdı yöntemi kullanılarak floem eksuda toplanması açıklar.

Toplanması ve analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floem EDTA-kolaylaştırdı Yöntemi eksuda

Lipid poliesterler, bitki kütikülü ve suberin içeren difüzyon bariyerleri olmak üzere iki hücre duvarı modifikasyonunun yapısal bileşenlerini oluşturur. Bu videoda, bütün delipide edilmiş yapraklardan kütini depolimerize etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, kütin veya suberin biyosentezinde tehlikeye giren mutantların araştırılmasına uygulanabilir.

Bitki Tırnak Lipid Polyester Monomer İzolasyonu ve biçim Analizi

Tahmin edilen birçok (fosfo)lipaz, substrat özgüllükleri ve fizyolojik fonksiyonları açısından zayıf bir şekilde karakterize edilir. Burada enzim aktivitelerini optimize etmek, doğal substratları aramak ve bu enzimler için fizyolojik işlevler önermek için bir protokol sunuyoruz.

Lipaz ve Fosfolipaz Adayları için substrat özellikleri tanımlama

Bir örnek kullanarak biyolojik dokulardan lipidlerin, metabolitlerin ve proteinlerin kapsamlı şekilde ekstraksiyonu için bir protokol sunulmuştur.

Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu

Burada sunulan fosfoproteomik bir yaklaşımdır, yani arabidopsis fosfoproteomun yüksek verimli ve derin kapsamasını sağlayan dur ve git ekstraksiyon ucu bazlı fosfoproteomik. Bu yaklaşım Arabidopsis'te ozmotik stres sinyaline genel bakışı tanımlamaktedir.

Arabidopsis'te Osmotik Stres Sinyali Profili Çıkarmak için Fosfoproteomik Strateji

Burada, nötr lipitlerin ayrılması için ince tabaka kromatografisi ile birleştirilen 14C-asetik asit ile mayanın metabolik etiketlemesi için bir protokol sunulmaktadır.

Metabolik Etiketleme ve İnce Tabaka Kromatografisi ile Saccharomyces serevizisinde Nötr Lipid Sentezinin Analizi

Çeşitli fotosentetik organizmalarla ilişkili plastoglobül lipid damlacıklarının izolasyonu için hızlı ve etkili bir protokol sunulmaktadır. İzole plastoglobüllerin başarılı bir şekilde hazırlanması, proteomik ve lipidomik analizler gibi ayrıntılı moleküler araştırmalardan önce gelen çok önemli bir ilk adımdır.

Plastoglobül Lipid Damlacığı İzolasyonu Bitki Yaprağı Dokusu ve Siyanobakterilerden

Öğrenin ince tabaka kromatografisi ve gaz-sıvı kromatografisi kullanarak Arabidopsis thaliana fide polar gliserolipid profilini belirleme yöntemini. Bu basit ve sağlam teknik, bitki lipid metabolizması araştırmalarında değerli bilgiler sunar.

İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) tarafından Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profil Gaz-Sıvı Kromatografi (GLC) ile birleştiğinde (Video) | JoVE Journal

İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) tarafından Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profil Gaz-Sıvı Kromatografi (GLC) ile birleştiğinde

Daha fazla video keşfet