Tavuk İşitsel Beyin Sapı Dilimleri hazırlanması ve Kültür

Bu prosedürün genel amacı, in vitro tam hücre fizyolojisi veya uzun süreli organotipik kültürler için kullanılmak üzere tavuk, işitsel beyin sapı dilimleri hazırlamaktır. Bu, önce embriyonun yumurtadan çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, beyni kafatasından ayırmak ve işitsel beyin sapı bölgesini izole etmektir.

İşlemin üçüncü adımı, beyin sapı bölgesinden dilimler halinde bir viome üzerinde hazırlanmaktır. Prosedürün son adımı, beyin sapı dilimlerini fizyoloji kayıtları için bir odaya veya kültürleme için Millipore plakalarına yerleştirmektir. Sonuç olarak, fizyolojik kayıtlar veya uzun süreli organotipik kültürler yoluyla tavuk embriyolarından sağlıklı işitsel beyin sapı dilimlerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, benim adım Armand Sidle. Bu yöntemin her ikisi de kuşların işitsel gelişimi hakkında fikir verebilir. Bu binaural işitsel devrenin benzersiz yapısı ve işlevi nedeniyle topografik ekzon rejenerasyonu, dendrit dinamikleri ve ayrıca içsel ve sinaptik özellikleri incelemek için de kullanılabilir.

Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler mücadele edecektir. Fizyolojik ve kültürel yaklaşımlar için uygun örneklere sahip olmak için dokunun hızlı bir şekilde diseke edilmesi, dilimlenmesi ve saklanması gerekir. İlk olarak, mililitre damıtılmış suya 40 miligram agar ekleyerek %4'lük bir agar çözeltisi hazırlayın ve kaynayana kadar mikrodalgada ısıtın.

Sıcak agar solüsyonunu bir Petri kabına dökün ve katılaştıktan sonra sertleşene kadar soğumaya bırakın. Agarın küçük bir bloğunu kesin ve vibrato aşamasına yapıştırın. Daha sonra, daha sonra 500 ila 1000 mililitre yapay beyin omurilik sıvısı veya A BOS hazırlayın.

%95 oksijen, %5 karbondioksit pH aralığı, 7,2 ila 7,4 ve litre başına 295 ila 310 mili ozmolarite karışımı ile sürekli köpürterek vibrato sahne odasında kullanın. A BOS köpürürken, diseksiyonu kültür alanlarına, Vibram ve bıçağa %70 etanol ile temizleyin. Vibram bıçağını damıtılmış suyla durulayın ve kurumaya bırakın, diseksiyon alanına temiz bir sıvı emme pedi yerleştirin ve genellikle bir neşter, makas, cımbız, tıraş bıçağı, pim, petri kabı ve steril bir doku kültürü başlığının altına bir spatuladan oluşan uygun diseksiyon aletlerini yerleştirin

Bir mililitre kültür, orta ve 35 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edilen kuyu plakası. Gerektiği kadar çok kültür zarı eki hazırlayın ve bunları daha sonra kullanmak üzere başlıkta saklayın. Diseksiyon pedi üzerinde kullanın.

Tipik olarak yumurtanın büyük tarafı olan embriyonun hava dolu boşluğunu bulmak için bir ışık kaynağının altına bir yumurta yerleştirin. Spatulanın düz ucunu kullanarak yumurtanın büyük tarafını kırın ve zar torbasını açığa çıkarın. Neşter veya makasla zar kesesinde bir dilim yapın ve spatula ile tavuk embriyosunun başını nazikçe çıkarın.

Makas kullanarak. Embriyonun başını hızla dekapite edin. Bir tıraş bıçağının ucunu gözlerin ortasına hafifçe yerleştirin ve kafatasından orta hat kesisini yapmak için bir rostral yapın.

Genç embriyolar için hafif baskı uygulamak. Daha yaşlı embriyolar için daha az basınç uygulayın. Kesi yapıldığına göre daha fazlasını kullanın.

Yaşlı hayvanların kafatasını ortaya çıkarması ve orta hattı doğrulaması için cildi ve tüyleri nazikçe bir kenara itin. Kesmek. Güçlü bir basınç kullanarak, bir jiletle dilimleyerek kafatasının rostral kısmını bloke edin. Bıçağı gözlerin arkasına yerleştirin ve tüm kafatası ve beyin dokusunu hızla kesin.

Tıkalı dokuyu, burun tarafı yukarı bakacak şekilde bir Petri kabına yerleştirin. Dokuyu lateral kas bölgesinden geçirin ve tamamen kabarcıklı ile daldırın. Bir CSF.

Kafatasının kaudal bölgesinde, başın her iki yanındaki görünür boyun kaslarının biraz önünde, küçük bir makasla orta hatta ve yan kesiler yapın. Beyincik ve beyni ortaya çıkarmak için kafatasını ve dokuyu çekin. Artık beyin dokusu açığa çıktığına göre, dokuyu kafatasından çıkarmak için beyincik ve beyin sapını bulun.

Ventral taraftaki beyin sapını çevreleyen bağlı dokuyu kafatası tabanından nazikçe kesmek için küçük bir makas kullanın. Beyin sapı kafatasından çıkarıldıktan sonra, optikadan puro ile dolu bir petri kabına sabitleyin. Daha sonra, dördüncü ventrikülün tabanını açığa çıkararak pedinkülleri küçük bir makasla keserek beyinciği tamamen çıkarın.

Beyin sapının yüzeyinden herhangi bir zar, doku ve kan damarını çıkarmak için cımbız kullanın ve optik teta boyunca yanal kesimler yapın. Beyin sapını serbest bırakmak için, açılı cımbız kullanarak nazikçe ama hızlı bir şekilde agar bloğunun önündeki Vibram sahnesine az miktarda süper yapıştırıcı yerleştirin. Beyin sapını omurilikten kaldırın ve dokuyu rostral tarafı aşağı ve sırt tarafı vibram bıçağına bakacak şekilde süper yapıştırıcının üzerine yerleştirin.

Fazla yapıştırıcıyı bir kağıt mendil veya filtre kağıdı ile alın. Vibram aşamasını yaklaşık 100 mililitre oksijenli A BOS ile nazikçe doldurun. Dilimleme hızlı bir şekilde yapılırsa, hazırlanan oksijenli A BOS'un kullanılmasında bir sakınca yoktur.

İlk bölümden. Vibram bıçağını, Vibram aşamasına göre 20 ila 22 derecelik bir açıda olacak şekilde konumlandırın. Titreşimi maksimum salınım genliğinde başlatın.

Ardından, dokunun üst kısmı bıçağa paralel olacak şekilde sahneyi bıçağın yukarısına doğru hareket ettirin. Dilimlemeden önce. Bıçağı hızlı bir şekilde beyin sapı dokusuna doğru hareket ettirin, ancak bıçağın dokuyla temas etmesinden hemen önce önemli ölçüde yavaşlayın.

Artık bıçak yerine oturduğuna göre, dokuyu mümkün olan en yavaş ileri hareketle dilimlemeye başlayın. Dokunun tüm koronal bölümünden geçtikten sonra, dilimleri bir boya fırçası ile bıçaktan yavaşça uzaklaştırın ve atın. Vibrato aşamasını 300 ila 500 mikrometrelik adımlarla indirin ve dilimleyin.

Yine, beyin sapı dokusunda anatomik imzalar görünene kadar tekrarlayın ve önceki tüm dilimleri atın. Şimdi 200 ila 1000 arasında işitsel yapılar içeren beyin sapı dokusunu dilimleyin ve toplayın. Mikrometre kalınlıkları, kullanılabilir dilimleri dilimleme sırasına göre dikkatlice toplar.

Dilimler, bu videonun daha sonraki bir bölümünde gösterilecek olan in vitro fizyoloji için kullanılacaksa, bu noktada, üstte açık içi boş plastik tüplerden ve alta yapıştırılmış naylon ağdan yapılmış özel odalarda ayrı ayrı saklanmalıdır. Her bir hazne, yaklaşık 350 mililitre A CSF'nin sürekli olarak köpürtüldüğü daha büyük bir depolama haznesine bağlanır. Dilimler organik tipik kültürler için kullanılacaksa, dilim toplamanın hemen ardından bir sonraki bölüme bakın: yaklaşık 500 mililitre A BOS ile dilimleri, bir ucunda kauçuk bir ampul bulunan ateşle parlatılmış bir cam pipet kullanarak buz üzerinde 48 oyuklu bir plakaya aktarın.

Kuyucuk başına bir dilim yerleştirmek ve dilimleme sırasını korumak. Bittiğinde, bir beynin tüm dilimlerini toplayarak, 48 oyuklu plakayı doku kültürü başlığına getirin. Daha önce hazırlanmış olan altı kuyulu plakayı inkübatörden alın ve davlumbazın üzerine getirin.

Kültür ortamı olan bir kuyucuğa bir membran eki yerleştirin ve altında hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Bir cam pipet kullanarak, bir damla A CSF'de bir dilimi nemli zarın üzerine aktarın. Hala üstte olan fazla A MF'yi bir mikro pipetle yerleştirin ve çıkarın.

Zar başına en fazla dört dilim için tekrarlayın ve dilimleri birbirlerine veya zarın kenarına değmeyecek şekilde konumlandırın. Kültürleri 35 derecelik bir inkübatörde saklayın ve bir doku kültürü başlığı altında haftada üç kez kültür ortamını değiştirerek koruyun. Her dilimi, bir ucunda lastik ampul bulunan ateşle parlatılmış bir cam pipet kullanarak ayrı bir tutma odasına yerleştirin.

Dilimleme sırasını korumaya devam etmek. Tutma haznesi, daha önce hazırlanan A BOS ile doldurulmalı ve fizyoloji deneyleri sırasında tüm zaman boyunca% 95 oksijen,% 5 karbondioksit karışımı ile sürekli olarak köpürtülmelidir. Tutma haznesini yaklaşık bir saat boyunca 35 santigrat derece su banyosuna yerleştirerek dilimlerin dengelenmesine izin verin ve ardından oda sıcaklığında 30 dakika dinlenmeye bırakın.

Dilimler ılık banyodan çıkarıldıktan sonra altı saate kadar kullanılabilir. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, dilimler tutma odasından elektrofizyolojik deneyler için bir mikroskop üzerine monte edilmiş 0,5 mililitrelik bir kayıt odasına aktarılabilir. Tavuk işitsel devresinin temsili bir şematik ve in vitro dilim görüntüleri burada gösterilmektedir.

Dilim görüntüleri işitsel beyin sapı bölgesi için tipiktir ve pratikle kolayca tanımlanabilir. İşitsel sinirden veya bir N projesinden hem çekirdeğe Magno cellis veya NM'ye hem de nucleus angularis veya N na'ya KBB uyarıcı girdiler. NM, beyin sapının her iki tarafındaki çekirdeğe, laminlere veya NL'ye bilateral uyarıcı girdiler yansıtır.

Üstün olivar çekirdeğinden veya SON'dan na, nm ve nl'ye inhibitör bir girdi. Burada, yedi gün sonra bir E 11 tavuğundan alınan koronal bir işitsel beyin sapı dilimi gösterilmektedir. Kültürde.

Nöronlar, somada meydana gelen mikrotübül ile ilişkili protein ikisine karşı bir antikor olan immünohistokimyasal yöntemler kullanılarak etiketlendi ve dendritler nöronları yeşil renkte etiketler. NM nöronları ve aksonlardan oluşan bir küme, bir rin boyasının elektroporasyonu yoluyla kırmızı ile etiketlenir. Beyaz ok uçları ile gösterilen ipsilateral nm akson terminalleri, dorsal NL dendritlerine çıkıntı yaparken görülebilir.

Burada, kültürde dört ve yedi günde akut ve kültürlenmiş dokudan hiperpolarize edici ve depolarize edici akım adımlarına yanıt olarak üst üste binen membran voltaj değişiklikleri gösterilmiştir. Hiperpolarize voltaj sarkmasındaki değişikliklere, dış akımda güçlü azalmaya ve dilim kültürü yaklaşımında benzer şekilde gelişen tek etkili potansiyel ateşlemeye dikkat edin. Yaşa eşdeğer akut doku dinlenme membran potansiyelleri ile karşılaştırıldığında eksi 55 ile eksi 60 milivolt arasındaydı Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik doğru yapılırsa 15 dakikadan daha kısa sürede gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü denerken, uygun steril teknikleri kullanmayı unutmamak önemlidir, Ve bu videoyu izledikten sonra, fizyolojik kayıtlar için kullanılmak veya kültür için kullanılmak üzere tavuk işitsel örgü kök dilimlerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.