Subkutan Enfeksiyon Metisiline Dirençli Stafilokok Aureus (MRSA)

Aşağıdaki deneyin genel amacı, metisiline dirençli staphylococcus aureus veya MA'nın sağkalımı ve yayılımının yanı sıra enfeksiyon bölgelerindeki kemokin ve sitokin seviyelerini incelemektir. Bu, net bir gözlem alanı sağlamak için farelerin sırtlarından kürkün çıkarılmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak.

Bir süspansiyon içindeki MRSA, enfeksiyondan üç gün sonra deri altına farelere uygulanacak, enfeksiyon patolojileri ve bakteri sayıları, agar plakaları üzerindeki doku homojenatlarından koloni oluşturan birimlerin sayısı belirlenerek değerlendirilebilir. Merhaba nasılsın? Benim adım De Lordon.

Ben bir post araştırmacıyım. Merhaba, benim adım Mariel Sanchez. Ben doktora öğrencisiyim ve ben Andrea Huda.

Ben bir araştırma görevlisiyim, Cedar-Sinai Tıp Merkezi'ndeki pediatri bölümünde George Lee'nin laboratuvarının bir parçasıyız. Bu yöntem, miyozit, polimiyozit ve nekrotizan fasiit dahil olmak üzere ciddi enfeksiyonların modellenmesi gibi tıp alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem ciddi acil enfeksiyonlar hakkında bilgi sağlayabilse de, A grubu streptokok ve diğer organizmalar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Ek olarak, miyozit ve polimiyozite neden olan diğer organizmaların işlevini ve patogenezini inceleyebiliriz. Genel olarak, bu prosedüre yeni başlayan kişiler, grup alanları küresel düzenleyicisinin personelinden biri oldukça değişken olduğu için mücadele edebilir. Dikkatli davranılmazsa, toplanan verilerde önemli farklılıklar olabilir ve bu da verilerin yorumlanmasında tarih zorluğuna neden olabilir.

Başlayalım. Bir BSL iki tesisinde, TSA tabanında bir koyun kanı agar plakası ve donmuş bir blok kullanarak steril bir halka hazırlayın. Stok Mercer kültürünü eksi 80 santigrat derece depodan çıkarın.

Daha sonra steril halkayı kullanarak, stok kültüründen küçük bir buz parçasını plakaya kırın. Küçük bir Mercer stok kültürü çipi aldıktan sonra, çözülmeyi önlemek için stok kültürünü hemen dondurucuya geri aktarın çünkü tekrarlanan dondurma ve çözdürme stok kültürüne zarar verecektir. Agarı çizgi oluşturmak için halkayı kullanın ve bireysel Mercer kolonilerinin büyümesini kolaylaştırın.

Plakayı CO2 takviyesi olmadan gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün. Hem yeni bir yaprak kan yumurtası, TSA plakası hem de üç mililitre THB içeren 15 mililitrelik bir geçmeli kapak tüpü hazırlayın ve etiketleyin.

Gece boyunca kültürlenmiş M SSA plakasını alın ve kolonilerin hemolitik fenotipini inceleyin. Steril bir döngü kullanarak, önceki deneysel kolonilerle tutarlı bir fenotipe sahip bir koloni seçin. Aynı ilmek çizgisini kullanarak THB'yi seçilen koloni ile aşılayın.

Plaka, THB çözeltisini gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe eder ve dakikada 220 dönüşte çalkalar. Bu bakteriler, daha sonraki adımlarda farelerin deri altı enfeksiyonu için kültürü aşılamak için kullanılacaktır. Kan agar plakasını da inkübatöre yerleştirin.

Plaka, ertesi sabah, THB çözeltisindeki bakterilerin hemolitik fenotipinin, başlangıçta seçilen kolonininkiyle eşleştiğini doğrulamak için kullanılacaktır. Hemoliz fenotipi orijinal klon ile tutarlı değilse, deneyi başlatmayın. Fareyi bir platforma aktarın ve sırtındaki kürkü tıraş edin.

Hayvan aşırı agresif ise, flor ile sedasyon gerekli olabilir. Tıraşlı bölgeye NA gibi yaklaşık beş milimetreküp tüy dökücü krem sürün. NA, yerel eczaneden satın alınabilir.

Bebek yağı içeren tüy dökücü kremi satın aldığınızdan emin olun, çünkü bebek yağı içermeyen ürün fareler için çok uyarıcı olacaktır. Tüy dökücü krem kuluçkaya yatırılırken kremin cilt yüzeyinde yaklaşık bir dakika inkübe kalmasına izin verin, bir dakika sonra birkaç kağıt havluyu çift damıtılmış su ile ıslatın. Tıraşlı bölgeyi temizlemek için ıslak kağıt havluları kullanın.

Cildin tüy dökücü kremden arınmış olduğundan emin olun, 50 mililitrelik vidalı kapaklı bir tüpte 10 mililitre THB'yi bir bakteri inkübatörde 37 santigrat derecede dört ila 10 saat önceden ısıtın. Gece boyunca bakteri kültürünün 20 mikrolitresini ön ısıtma THB'ye aktarın. Bu, gece boyunca merc'i seyreltecektir.

Birden 500'e kadar bir süspansiyon. Tüpü, inkübasyon süresinden yaklaşık iki buçuk ila üç saat sonra dakikada 220 dönüşte çalkalanan bir inkübatöre 37 santigrat dereceye yerleştirin. Bakteriyel süspansiyonu bir ila 10'a kadar seyreltmek için daha fazla THB kullanın ve süspansiyonu bir spektrofotometre ile ölçün.

514 nanometrede emicilik ile. Bir ila 10 seyreltilmiş süspansiyon 0,25'e ulaşana kadar dakikada 220 dönüşte çalkalayarak süspansiyonu 37 santigrat derecede yeniden inkübe etmeye devam edin. M er santrifüjünü, 50 mililitrelik tüpü 3, 225 kez yerçekiminde dört santigrat derecede 10 dakika boyunca toplamak için supinat Resus'u atın.

Bakteri paletini 10 mililitre DPBS'de askıya alın ve bu ciddi enfeksiyon modeli için santrifüjleme adımını tekrarlayarak bakterileri tekrar yıkayın. Bakteri peletini yaklaşık bir mililitre DPBS içinde yeniden süspanse edin, bu da mililitre başına yaklaşık bir kez 10 ila 10 koloni oluşturan birim ile sonuçlanır. Koyun kanı A-R-T-S-A plakalarını seri olarak birleştirin, bakterileri DPBS plakasında 10 ila 10 ila sekiz kat seyreltin.

Seri olarak seyreltilmiş bakteri süspansiyonunun 10 mikrolitrelik damlası, üç nüsha halinde bir tabaka kan agar plakasına düşer. Plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Plakaları 16 ila 18 saat inkübe ettikten sonra, inokülerin hemoliz fenotipini gözlemleyin ve kaydedin.

Plakalardaki koloni oluşturan birimleri sayın. Enfeksiyon inoküler, koloni oluşturan birime göre hesaplanacaktır. Plakalardaki numara.

Daha önce hazırlanan DPBS'de 100 mikrolitre bakteri süspansiyonu içeren bir şırınga hazırlayın. Enjeksiyondan önce, fareler solunum hızları saniyede yaklaşık bir olacak şekilde sakinleştirilmelidir. Gösteri amacıyla, bu videoda ötenazi yapılmış bir fare gösterilmektedir.

Enjeksiyondan sonra M ser'i bir tarafa enjekte edin. Fareyi kafesine geri aktarın. Hayvan odasına geri dönmeden önce farenin canlı olduğundan emin olmak için enjeksiyondan sonra hayvanları üç ila beş saat gözlemleyin.

Hayvanlar sakrifiye edildikten sonra hayvanların sırtındaki lezyonları günlük olarak izleyin. Derideki lezyonların boyutunu ve durumunu ölçün ve kaydedin. Hem deri hem de kas lezyon alanları, lezyonun uzunluğu ve genişliği milimetre cinsinden çarpılarak ölçülür.

Düzensiz şekilli lezyonlar daha küçük simetrik parçalara ayrılmalı ve her parça aynı yöntemle ölçülmelidir. Doku toplama için 100 mikrolitre DPBS içeren 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpleri hazırlayın. Cildi steril bir tıraş bıçağıyla çentikleyin ve lezyonu bir çift steril makasla çıkarın.

Lezyonu eksize ederken, bölgeyi çevreleyen yaklaşık iki ila beş milimetre sağlıklı cildin de eksize edildiğinden emin olun. Kas lezyonlarını analiz etmek için lezyonu doku toplama tüplerine yerleştirin. Boyutunu ölçmek ve kas dokusu üzerindeki lezyonun durumunu kaydetmek için cildi dikkatlice soyun.

Dalak ve böbrekleri toplayın. Bu dokuları kendi ayrı toplama tüplerine yerleştirin. Bir mililitrelik şırınga ile yaklaşık 30 saniye çalkalayarak dokuları homojenize edin.

Her tüpe 900 mikrolitre DPBS ekleyin. THA plakalarını birleştirin, homojenize doku örneklerini beş dakika boyunca vorteksleyin. Numuneyi seri olarak seyreltin.

Süspansiyonlar bir ila 10 ila altı kat arasında değişir. 96'da, kuyucuk plakaları, seri olarak seyreltilmiş her bir süspansiyondan 10 mikrolitreyi plakalara dağıtır. Plakaları gece boyunca 37 santigrat derece bakteri inkübatörde inkübe edin.

Ertesi sabah, plakalardan koloni oluşturan birimleri sayın ve seyreltme faktörlerine göre koloni oluşturan birimlerin sayısını hesaplayın. Enfeksiyon doğru yapılırsa, deri altı enjeksiyonundan hemen sonra cilt yüzeyinde bir kabarcık gözlenecektir. Herhangi bir kabarcık gözlenmezse, enjeksiyon çok derin olabilir ve bu da enfeksiyonun sonucunu etkileyebilir.

Lezyon boyutu ve bakteriyel sağkalım, MSA ile enfeksiyon sonrası çeşitli noktalarda değerlendirilebilir. Aşağıdaki cilt lezyonları enfeksiyondan sonraki üçüncü günde incelenmiştir ve bir CD'deki lezyona örnektir: bir fare, bir yanda enfekte olmuş, bir kez 10 ila yedi koloni oluşturan birim. Kas lezyonları tipik olarak cilt lezyonlarının altındaki dokuda bulunur.

Aşağıdakiler, daha önce gösterilen cilt lezyonu fotoğrafları için çakışan kas yüzeyi lezyonlarına örneklerdir. Bunlar, bir kez 10 ila yedi koloni oluşturan birim ile enfekte olmuş bir farede enfeksiyondan sonraki üçüncü günde gözlenen kas lezyonlarıdır. Lezyon alanı, milimetre cinsinden ölçülen lezyonun uzunluk çarpı genişliği olarak belirlenir ve cildin doku hasarını değerlendirmek için ölçülebilir.

Enfeksiyon bölgesinde lokalize olan bakterilerin koloni oluşturan birim sayısı, eksizyon lezyonlarında ölçülebilir. Koloni oluşturan birim sayısı, bir virülans faktörünün MSA'ya hayatta kalma avantajı sağlayıp sağlamadığını gösterebilir. Bu prosedürü denerken, iğnelerin ve yüksek derecede patojenik mikropların kullanılması nedeniyle standart güvenlik önlemlerini kullanmayı unutmamak önemlidir.

Son olarak, apse modeli olarak kullandığımız modelimize kıyasla 1.000 kat daha düşük inoküler, kalıcı RSA enfeksiyonunu teşvik eden S faktörleri nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Mars A ile doldurulmuş bir şırınga ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve şırınganın doğrudan kesiciye atılması gibi önlemlerin iğne tarafından kazara bıçaklanmasını önlemek önemlidir. Ayrıca, bu deney için, çalışma alanının uygun şekilde dezenfekte edilmesini sağlamak için standart bir BS O2 protokollerini takip etmek önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler. Merhaba, güle güle.