Subkutan Enfeksiyon Metisiline Dirençli Stafilokok Aureus (MRSA)

Aşağıdaki deneyin genel amacı, metisilin dirençli staphylococcus aureus veya MRSA'nın sağkalımını ve yayılımının yanı sıra enfeksiyon bölgelerindeki kemokin ve sitokin seviyelerini incelemektir. Bu, gözlem için net bir alan oluşturmak amacıyla farelerin sırtındaki tüylerin temizlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak.

Süspansiyon halindeki MRSA, enfeksiyondan üç gün sonra farelere deri altına uygulanacaktır; enfeksiyon patolojileri ve bakteri sayıları, doku homojenatlarından agar plaklarında koloni oluşturan birim sayısının belirlenmesiyle değerlendirilebilir. Merhaba, nasılsınız? Benim adım De Lordon.

Ben bir doktora sonrası araştırmacısıyım. Merhaba, benim adım Mariel Sanchez. Ben bir PhD öğrencisiyim ve ben de Andrea Huda.

Ben bir araştırma görevlisiyim, Cedar-Sinai Tıp Merkezi pediatri bölümündeki George Lee'nin laboratuvarında görev yapıyoruz. Bu yöntem; miyozit, polimiyozit ve nekrotizan fasiyitis dahil olmak üzere şiddetli enfeksiyonların modellenmesi gibi tıp alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem şiddetli acil enfeksiyonlar hakkında bilgi sağlayabilse de, A grubu streptokoklar ve diğer organizmalar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Ek olarak, miyozit ve polimiyozite neden olan diğer organizmaların fonksiyonlarını ve patogenezini inceleyebiliriz. Genel olarak, bu prosedürde yeni olan kişiler zorluk yaşayabilir çünkü caucus alanlarının global düzenleyicilerinden biri oldukça değişkendir. Önlem alınmazsa, toplanan verilerde önemli varyasyonlar oluşabilir ve bu durum verilerin yorumlanmasını zorlaştırabilir.

Hadi başlayalım. BSL 2 tesisinde, TSA bazlı bir koyun kanlı agar plakası ve dondurulmuş blok kullanarak steril bir öze hazırlayın. Stok Mercer kültürünü -80 °C saklama alanından çıkarın.

Ardından, steril öze kullanarak stok kültürden küçük bir buz parçası koparıp plakaya aktarın. Mercer stok kültüründen küçük bir parça aldıktan sonra, tekrarlanan dondurma ve çözme işlemleri stok kültüre zarar vereceğinden, çözünmesini önlemek için stok kültürü derhal tekrar dondurucuya yerleştirin. Bireysel Mercer kolonilerinin büyümesini sağlamak için agar yüzeyine öze ile ekim yapın.

Plakayı, CO2 takviyesi olmadan 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, yeni bir kanlı agar plakası, bir TSA plakası ve üç mililitre THB içeren 15 mililitrelik kapaklı bir tüp hazırlayıp etiketleyin.

Gece boyu kültüre edilen M SSA plağını geri alın ve kolonilerin hemolitik fenotipini inceleyin. Steril bir öze yardımıyla, önceki deney kolonileriyle tutarlı bir fenotipe sahip olan bir koloni seçin. Seçilen koloniyle, aynı öze ekim yöntemi kullanılarak THB'ye inokülasyon yapın.

Plaka, THB çözeltisi ile 37 °C'de, dakikada 220 devir hızında çalkalanarak gece boyunca inkübe edilir. Bu bakteriler, sonraki adımlarda farelerin deri altı enfeksiyonu için kültürü inoküle etmek amacıyla kullanılacaktır. Kanlı agar plağını da inkübatöre yerleştirin.

Plaka, ertesi sabah THB solüsyonundaki bakterilerin hemolitik fenotipinin başlangıçta seçilen koloni ile eşleştiğini doğrulamak için kullanılacaktır. Hemoliz fenotipi orijinal klon ile tutarlı değilse, deneye başlamayın. Fareyi bir platforma aktarın ve sırtındaki tüyleri tıraş edin.

Hayvan aşırı agresifse, izofluran ile sedasyon gerekebilir. Tıraş edilmiş bölgeye NA gibi bir tüy dökücü kremden yaklaşık beş kübik milimetre uygulayın. NA, yerel eczanelerden satın alınabilir.

Bebek yağı içeren tüy alma kremini satın aldığınızdan emin olun; çünkü bebek yağı içermeyen ürün fareler için çok uyarıcı olacaktır. Kremin cilt yüzeyinde yaklaşık bir dakika boyunca bekletilmesini sağlayın; tüy alma kremi beklerken birkaç kağıt havluyu çift distile su ile ıslatın. Bir dakika sonra, tıraş edilen bölgeyi temizlemek için ıslak kağıt havluları kullanın.

Cildin tüy alma kreminden arındırıldığından emin olun; 50 mL'lik vidalı kapaklı bir tüpte 10 mL THB'yi, bir bakteri inkübatöründe 37 °C'de dört ila 10 saat boyunca ön ısıtmaya tabi tutun. Gece boyunca bekletilen bakteri kültüründen 20 µL'yi ön ısıtılmış THB'ye aktarın. Bu işlem, gece boyu bekletilen merc kültürünü seyreltecektir.

1:500 oranında bir süspansiyon hazırlayın. İnkübasyon süresinin ardından tüpü, 37 °C'de, dakikada 220 devirle çalışan çalkalamalı bir inkübatöre yaklaşık iki buçuk ila üç saat süreyle yerleştirin. Bakteriyel süspansiyonu 1:10 oranına kadar daha fazla seyreltmek için daha fazla THB kullanın ve süspansiyonu bir spektrofotometre ile ölçün.

514 nanometredeki absorbans ile. 1/10 dilüsyonlu süspansiyon 0,25 değerine ulaşana kadar, süspansiyonu 37 °C'de, dakikada 220 devirle çalkalayarak inkübe etmeye devam edin. M'yi toplamak için 50 ml'lik tüpü 4 °C'de 10 dakika boyunca 3.225 ×g kuvvetinde santrifüj edin, süpernatanı atın ve yeniden süspanse edin.

Bakteri pelletini 10 mililitre DPBS içinde süspande edin ve bu şiddetli enfeksiyon modeli için santrifügasyon adımını tekrarlayarak bakterileri yeniden yıkayın. Bakteri pelletini yaklaşık bir mililitre DPBS içinde yeniden süspande ederek mililitre başına yaklaşık 1 × 10¹⁰ koloni oluşturan birim elde edin. Koyun kanlı agar plaklarını hazırlayın ve bakterileri DPBS içinde 10¹'den 10⁸'e kadar seri olarak dilüe edip plaklara ekleyin.

Seri seyreltilmiş bakteriyel süspansiyondan 10 µL'lik damlaları bir kan agar plağına üç tekrarlı olarak damlatın. Plakları 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Plakları 16 ila 18 saat inkübe ettikten sonra, inokülasyonun hemoliz fenotipini gözlemleyin ve kaydedin.

Plakalardaki koloni oluşturan birim sayısını belirleyin. Enfeksiyon inokülumu, plakalardaki koloni oluşturan birim sayısına göre hesaplanacaktır.

Daha önce hazırlanan DPBS içindeki bakteriyel süspansiyondan 100 µL içeren bir şırınga hazırlayın. Enjeksiyondan önce, farelerin solunum hızının saniyede yaklaşık bir kez olacağı şekilde sedate edilmeleri gerekir. Demonstrasyon amacıyla, bu videoda ötanize edilmiş bir fare gösterilmektedir.

Enjeksiyondan sonra M ser'i bir yan bölgeye enjekte edin. Fareyi kafesine geri transfer edin. Fareyi hayvan odasına geri transfer etmeden önce hayatta olduğundan emin olmak için, enjeksiyondan sonra hayvanları üç ila beş saat boyunca gözlemleyin.

Hayvanlar sakrifiye edildikten sonra, hayvanların sırtlarındaki lezyonları günlük olarak izleyin. Cilt üzerindeki lezyonların boyutunu ve durumunu ölçün ve kaydedin. Hem cilt hem de kas lezyon alanları, lezyonun milimetre cinsinden uzunluğu ve genişliği çarpılarakle hesaplanır.

Düzensiz şekilli lezyonlar daha küçük simetrik parçalara ayrılmalı ve her parça aynı yöntemle ölçülmelidir. Doku toplama işlemi için 100 µL DPBS içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. Cildi steril bir jiletle hafifçe kesin ve lezyonu steril bir makas yardımıyla çıkarın.

Lezyonu çıkarırken, bölgeyi çevreleyen yaklaşık iki ila beş milimetrelik sağlıklı derinin de çıkarıldığından emin olun. Kas lezyonlarını analiz etmek için lezyonu doku toplama tüplerine yerleştirin. Kas dokusu üzerindeki lezyonun boyutunu ölçmek ve durumunu kaydetmek için deriyi dikkatlice soyun.

Dalak ve böbrekleri toplayın. Bu dokuları kendi ayrı toplama tüplerine yerleştirin. Dokuları, bir mililitrelik şırıngayla yaklaşık 30 saniye boyunca çalkalayarak homojenize edin.

Her tüpe 900 µL DPBS ekleyin. THA plaklarını hazırlayın ve homojenize edilmiş doku örneklerini beş dakika boyunca vorteksleyin. Örneği seri olarak seyreltin.

Süspansiyonlar 10¹ ile 10⁶ kat arasında seyreltilir. 96 kuyucuklu plakalara, seri dilüsyonu yapılmış her süspansiyondan 10 µL dispense edin. Plakaları 37 °C'lik bir bakteri inkübatöründe gece boyunca inkübe edin.

Ertesi sabah, plakalardaki koloni oluşturan birimleri sayın ve dilüsyon faktörlerine dayanarak koloni oluşturan birim sayısını hesaplayın. Enfeksiyon işlemi doğru yapıldıysa, deri altına enjeksiyonun hemen ardından deri yüzeyinde bir kabarıklık gözlemlenecektir. Eğer herhangi bir kabarıklık gözlemlenmezse, enjeksiyon çok derin yapılmış olabilir ve bu durum enfeksiyon sonucunu etkileyebilir.

Lezyon boyutu ve bakteriyel sağkalım, MSA ile enfeksiyondan sonra çeşitli zaman noktalarında değerlendirilebilir. Aşağıdaki cilt lezyonları, enfeksiyon sonrası üçüncü günde incelenmiş olup, tek taraflı olarak 1 × 10⁷ koloni oluşturan birim ile enfekte edilmiş bir CD-1 faresindeki lezyon örnekleridir. Kas lezyonları tipik olarak cilt lezyonlarının altındaki dokuda bulunur.

Aşağıdakiler, daha önce gösterilen deri lezyonu fotoğraflarıyla örtüşen kas yüzeyi lezyonlarının örnekleridir. Bunlar, 1 × 10⁷ koloni oluşturan birim ile enfekte edilmiş bir farede, enfeksiyon sonrası üçüncü günde gözlemlenen kas lezyonlarıdır. Lezyon alanı, milimetre cinsinden ölçülen lezyon uzunluğu çarpı genişliği olarak belirlenir ve derideki doku hasarını değerlendirmek için ölçülebilir.

Enfeksiyon bölgesinde yerleşmiş bakterilerin koloni oluşturan birim sayısı, eksize edilen lezyonlar üzerinde belirlenebilir. Koloni oluşturan birim sayısı, bir virülans faktörünün MSA'ya bir sağkalım avantajı sağlayıp sağlamadığını gösterebilir. Bu prosedürü uygularken, iğne kullanımı ve yüksek derecede patojenik mikroplarla çalışılması nedeniyle standart güvenlik önlemlerinin alınması gerektiğini unutmamak önemlidir.

Absse modeli olarak son aşamada, modelimizde kullandığımıza kıyasla 1.000 kat daha düşük bir inokülum, kalıcı RSA enfeksiyonunu teşvik eden S faktörleri nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Mars A ile doldurulmuş şırıngalarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve şırınganın doğrudan kesici/delici atık kutusuna atılması gibi önlemlerin, iğne ile meydana gelebilecek kazara batmaları önlemek için önemli olduğunu unutmayın. Ayrıca, bu deney için çalışma alanının uygun şekilde dezenfekte edilmesini sağlamak amacıyla standart BSO2 protokollerine uymak önemlidir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler. Merhaba. Merhaba, hoşça kalın.