Isı Şoku Yöntemiyle E. coli içine Plazmid DNA Dönüşüm

Merhaba, ben Alex Hoge. University of California Irvine Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'ndeki Gym Hall Laboratuvarı'nda çalışıyorum. Bugün size, elektroporasyon yöntemiyle elektriksel olarak kompetan e coli transformasyonunun nasıl yapılacağını göstereceğim.

Bugün, zebrafishlerde bütün montaj hibridizasyonu yapmak için hazırladığım ligasyon ürünümle bir E. coli transformasyonu gerçekleştireceğim. Tamam, transformasyon işlemine başlıyoruz. Öncelikle, su banyonuzun veya kuru banyonuzun 42 °C'ye ayarlanmış olması gerekir.

Ana stoktan yeni çıkardığınız bakterilerin buz üzerinde olması gerekir. Bugün, buz üzerindeki elektrokompetan hücreleri ve DNA'nızı kullanacağız. Ayrıca, oda sıcaklığında veya 37 °C'de bir tüp SOC besiyerine ve antibiyotikli LV plaklarınıza ihtiyacınız olacaktır.

Şimdi DNA'yı bakterilerle birleştireceğim. Bakterileri kontamine etmemek için alevin yanında çalışıyorum. Böylece bakterilerin bulunduğu solüsyonu ekliyorum.

50 µL bakteri ekleyin ve ardından hemen tekrar buza yerleştirin; bakterileri ve DNA'nızı karıştırmak için tüpleri hafifçe sallayabilirsiniz ve 15 dakikaya kadar buzda bekletin. Şimdi 15 dakika geçti ve bakterileri 42 °C'de 45 saniye boyunca tutacağımız ısı şoku işlemini gerçekleştirmeye hazırız. Bu nedenle tüpleri buzdan çıkarıp doğrudan 42 °C'ye yerleştiriyorum, zamanlayıcıyı 45 saniyeye kuruyorum ve ardından tüpleri çok hızlı bir şekilde tekrar buza, yani 42 °C'den doğrudan buzun üzerine koyuyorum.

Ardından iki dakika bekliyoruz. Şimdi bakterilere SOC besiyeri ekleyeceğim ve onları 30 dakika boyunca 37 °C'de tutacağım. Böylece 500 µL SOC besiyerini bakterilere ekleyip onları hazırladığım küçük düzeneğe yerleştiriyorum.

Bu nedenle, inkübatörünüz için eend tüpleri ve derme çatma bir hazne kullanacaksanız, tüpleri yatay olarak yerleştirdiğinizden emin olun; çünkü bu şekilde çok daha iyi çalkalanacaklardır. Artık tüpleri çalkalayıcıya yerleştirmeye hazırız. Bu yüzden tüpleri 37 °C'de 30 dakika boyunca bu küçük hazneye koyuyoruz.

Artık 37 °C'deki inkübasyon işlemini tamamladık ve bakterileri LB artı antibiyotik içeren plaklara ekeceğiz. Benim durumumda bu antibiyotik kloramfenikoldür. Her örnekten 50 µL alıp plağa ekliyorum.

Kalan 500 µL hacmi, bakterileri çöktürmek için küçük bir masaüstü santrifüjde döndürüyorsunuz. Santrifüjleme sonrası güzel bir pelet elde ediyoruz ve şimdi yapacağımız işlem, SOC besiyerinin neredeyse tamamını uzaklaştırıp sadece 50 µL bırakmak; böylece bu 50 µL'lik konsantre bakteriyi ekim yapabiliriz. Bu nedenle yaklaşık 450 µL'yi dışarı aktardım.

Sadece bu kadarı kalsın. Şimdi pellet'i geriye kalan 50 µL SOC besiyerinde süspanse edeceğim. Ardından bu 50 µL'yi başka bir plakaya ekebilirim.

Ardından her bir paleti temizliyorum, ardından onu aktarıyor ve plakaya ekiyorum. Böylece sonuçta örnek başına iki plaka olacak. Şimdi bakterileri LB plakasına yaymamız gerekiyor.

Otoklavlanmış cam boncuklar kullanacağım ancak isterseniz bir pipet ucunu şu şekilde yayma çubuğu formuna getirerek de kullanabilirsiniz. Petri kabına birkaç boncuk yerleştiriyorum. Ben bu yöntemi tercih ediyorum.

Pekala, 10 15. Boncukları ekledikten sonra, tüm plakalarınızı bu şekilde bir yığın haline getirip, boncukların bakterileri plakaların her yerine eşit şekilde yayması için onları nazikçe sallayın. Ardından, plakalar kuruyana kadar onları hareket ettirmeye devam edin.

Yani, boncuklarla birlikte hareket ettiğinizde büyük sıvı izleri görmemeniz gerekir. Örneğin, şu plakada boncuklar birbirine yapışma eğilimindedir ve çok fazla iz görülmektedir. Şuradaki ise terlemiş olanıdır, boncuklar serbestçe hareket eder; şu ise kurudur.

Plakalar kuruduğu için artık boncukları atabiliriz. Geri dönüştürülebilmeleri için onları bu şekilde çekiyorum. Şimdi plağı gece boyunca 37 °C'de inkübatöre yerleştireceğiz; plakaları ters şekilde koymalısınız. 37 °C'de 12 saatlik inkübasyonun ardından plağı inkübatörden çıkarıyoruz.

Gördüğümüz gibi, 50 microliter ektiğim plakta, geri kalanını ektiğim plakta olduğundan daha az koloni var. Bakterileri transforme ederken önemli olan, plağınızda doğru miktarda koloniye, yani doğru yoğunluğa sahip olmanızdır. Burada çok az koloni var, ancak daha fazla koloni istiyorsanız, tam olarak doğru yoğunluğun olduğu, plak başına yaklaşık 100 koloni içeren şu plak iyi bir örnektir.

Bu plaka kötü bir örnektir çünkü çok fazla koloni vardır ve tekil kolonileri seçemezsiniz. Bu yüzden size her bir transformasyonla e coli'nin nasıl transforme edileceğini gösterdim. Bu tekniğin çok önemli olan yönü, şoklama öncesinde her şeyi buz üzerinde soğuk tutmaktır.

Ardından 45 saniye normal, daha fazlası 42 derecede ve sonra tekrar buzda bekletilir. Ve ardından diğer her şey ılık bir sıcaklıkta veya 37 derecede olmalıdır. Şimdi kolonilerimi PCR taraması ile tarayacağım.

Dolayısıyla amaçlardan biri de iki plaka kullanmaktır. Böylece birinde çok sayıda koloni, diğerinde ise daha az koloni oluşmasını bekleriz. Burada önemli olan, boncuklar veya pipet yardımıyla plakaların iyice kurutulmasıdır.

İzlediğiniz için teşekkürler, onaylama işlemlerinizde başarılar dileriz.