Name: Isı Şoku Yöntemiyle E. coli içine Plazmid DNA Dönüşüm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Öğrenin, ısı şoku yöntemiyle E. coli'ye plazmid DNA dönüşümünü nasıl gerçekleştireceğinizi. Bu teknik, moleküler biyoloji ve genetik mühendisliği çalışmalarında temel bir yöntemdir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

isı Şoku yöntemiyle e. coli içine plazmid dna dönüşüm

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Dönüşüm ısı şok yöntemi kullanılarak E. coli içine plazmid DNA moleküler biyolojinin temel bir tekniktir. Bu bakteri yabancı bir plazmid veya ligasyonu ürün ekleme oluşur. Bu video protokolü Genlantis piyasada bulunan kimyasal yetkili bakteri kullanarak dönüşüm geleneksel yöntem açıklanır. Buz kısa bir inkübasyondan sonra, 45 saniye boyunca 42 ° C&#39;de kimyasal yetkili bakteri ve DNA karışımı konur (ısı şok) ve ardından buz geri yerleştirilir. SOC medya eklenir ve dönüştürülmüş hücreleri ile 37 ° C de 30 dakika süreyle ajitasyon inkübe edilir. Dönüşüm verimliliği bağımsız koloniler izole emin olmak için, iki miktarlarda dönüştürülmüş bakteri kaplanmıştır. Bu geleneksel protokol ticari olarak satılan birçok yetkili bakterileri dönüştürmek için başarıyla kullanılabilir. Genlantis turbocells bir roman 3 dakika dönüşüm protokolü, kullanım kılavuzunda açıklanan de kullanılabilir.

Isı Şoku Yöntemiyle E. coli içine Plazmid DNA Dönüşüm

Isı şoku yöntemi kullanılarak plazmit DNA'nın E. coli'ye transformasyonu, moleküler biyolojinin temel bir tekniğidir. Bu işlem, yabancı bir...

Merhaba, ben Alex Hoge. University of California Irvine Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'ndeki Gym Hall Laboratuvarı'nda çalışıyorum. Bugün size, elektroporasyon yöntemiyle elektriksel olarak kompetan e coli transformasyonunun nasıl yapılacağını göstereceğim.Bugün, zebrafishlerde bütün montaj hibridizasyonu yapmak için hazırladığım ligasyon ürünümle bir E. coli transformasyonu gerçekleştireceğim. Tamam, transformasyon işlemine başlıyoruz. Öncelikle, su banyonuzun veya kuru banyonuzun 42 °C'ye ayarlanmış olması gerekir.Ana stoktan yeni çıkardığınız bakterilerin buz üzerinde olması gerekir. Bugün, buz üzerindeki elektrokompetan hücreleri ve DNA'nızı kullanacağız. Ayrıca, oda sıcaklığında veya 37 °C'de bir tüp SOC besiyerine ve antibiyotikli LV plaklarınıza ihtiyacınız olacaktır.Şimdi DNA'yı bakterilerle birleştireceğim. Bakterileri kontamine etmemek için alevin yanında çalışıyorum. Böylece bakterilerin bulunduğu solüsyonu ekliyorum.50 µL bakteri ekleyin ve ardından hemen tekrar buza yerleştirin; bakterileri ve DNA'nızı karıştırmak için tüpleri hafifçe sallayabilirsiniz ve 15 dakikaya kadar buzda bekletin. Şimdi 15 dakika geçti ve bakterileri 42 °C'de 45 saniye boyunca tutacağımız ısı şoku işlemini gerçekleştirmeye hazırız. Bu nedenle tüpleri buzdan çıkarıp doğrudan 42 °C'ye yerleştiriyorum, zamanlayıcıyı 45 saniyeye kuruyorum ve ardından tüpleri çok hızlı bir şekilde tekrar buza, yani 42 °C'den doğrudan buzun üzerine koyuyorum.Ardından iki dakika bekliyoruz. Şimdi bakterilere SOC besiyeri ekleyeceğim ve onları 30 dakika boyunca 37 °C'de tutacağım. Böylece 500 µL SOC besiyerini bakterilere ekleyip onları hazırladığım küçük düzeneğe yerleştiriyorum.Bu nedenle, inkübatörünüz için eend tüpleri ve derme çatma bir hazne kullanacaksanız, tüpleri yatay olarak yerleştirdiğinizden emin olun; çünkü bu şekilde çok daha iyi çalkalanacaklardır. Artık tüpleri çalkalayıcıya yerleştirmeye hazırız. Bu yüzden tüpleri 37 °C'de 30 dakika boyunca bu küçük hazneye koyuyoruz.Artık 37 °C'deki inkübasyon işlemini tamamladık ve bakterileri LB artı antibiyotik içeren plaklara ekeceğiz. Benim durumumda bu antibiyotik kloramfenikoldür. Her örnekten 50 µL alıp plağa ekliyorum.Kalan 500 µL hacmi, bakterileri çöktürmek için küçük bir masaüstü santrifüjde döndürüyorsunuz. Santrifüjleme sonrası güzel bir pelet elde ediyoruz ve şimdi yapacağımız işlem, SOC besiyerinin neredeyse tamamını uzaklaştırıp sadece 50 µL bırakmak; böylece bu 50 µL'lik konsantre bakteriyi ekim yapabiliriz. Bu nedenle yaklaşık 450 µL'yi dışarı aktardım.Sadece bu kadarı kalsın. Şimdi pellet'i geriye kalan 50 µL SOC besiyerinde süspanse edeceğim. Ardından bu 50 µL'yi başka bir plakaya ekebilirim.Ardından her bir paleti temizliyorum, ardından onu aktarıyor ve plakaya ekiyorum. Böylece sonuçta örnek başına iki plaka olacak. Şimdi bakterileri LB plakasına yaymamız gerekiyor.Otoklavlanmış cam boncuklar kullanacağım ancak isterseniz bir pipet ucunu şu şekilde yayma çubuğu formuna getirerek de kullanabilirsiniz. Petri kabına birkaç boncuk yerleştiriyorum. Ben bu yöntemi tercih ediyorum.Pekala, 10 15. Boncukları ekledikten sonra, tüm plakalarınızı bu şekilde bir yığın haline getirip, boncukların bakterileri plakaların her yerine eşit şekilde yayması için onları nazikçe sallayın. Ardından, plakalar kuruyana kadar onları hareket ettirmeye devam edin.Yani, boncuklarla birlikte hareket ettiğinizde büyük sıvı izleri görmemeniz gerekir. Örneğin, şu plakada boncuklar birbirine yapışma eğilimindedir ve çok fazla iz görülmektedir. Şuradaki ise terlemiş olanıdır, boncuklar serbestçe hareket eder; şu ise kurudur.Plakalar kuruduğu için artık boncukları atabiliriz. Geri dönüştürülebilmeleri için onları bu şekilde çekiyorum. Şimdi plağı gece boyunca 37 °C'de inkübatöre yerleştireceğiz; plakaları ters şekilde koymalısınız. 37 °C'de 12 saatlik inkübasyonun ardından plağı inkübatörden çıkarıyoruz.Gördüğümüz gibi, 50 microliter ektiğim plakta, geri kalanını ektiğim plakta olduğundan daha az koloni var. Bakterileri transforme ederken önemli olan, plağınızda doğru miktarda koloniye, yani doğru yoğunluğa sahip olmanızdır. Burada çok az koloni var, ancak daha fazla koloni istiyorsanız, tam olarak doğru yoğunluğun olduğu, plak başına yaklaşık 100 koloni içeren şu plak iyi bir örnektir.Bu plaka kötü bir örnektir çünkü çok fazla koloni vardır ve tekil kolonileri seçemezsiniz. Bu yüzden size her bir transformasyonla e coli'nin nasıl transforme edileceğini gösterdim. Bu tekniğin çok önemli olan yönü, şoklama öncesinde her şeyi buz üzerinde soğuk tutmaktır.Ardından 45 saniye normal, daha fazlası 42 derecede ve sonra tekrar buzda bekletilir. Ve ardından diğer her şey ılık bir sıcaklıkta veya 37 derecede olmalıdır. Şimdi kolonilerimi PCR taraması ile tarayacağım.Dolayısıyla amaçlardan biri de iki plaka kullanmaktır. Böylece birinde çok sayıda koloni, diğerinde ise daha az koloni oluşmasını bekleriz. Burada önemli olan, boncuklar veya pipet yardımıyla plakaların iyice kurutulmasıdır.İzlediğiniz için teşekkürler, onaylama işlemlerinizde başarılar dileriz.

transformation-of-plasmid-dna-into-e-coli-using-the-heat-shock-method

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tüm plazmid Site directed mutagenesis özgün bir plazmid biraz farklı varyasyonlarını oluşturmak için basit bir yoludur. Burada temel yerine plazmid kullanarak standart reaktifleri tanıtmak için kolay ve maliyet etkin bir şekilde göstermektedir.

Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez

Kaynak: Stefan, A., ve diğerleri, Escherichia coli'de Protein Birlikte Ekspresyonunun Çok Yönlü Faydaları. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, hücre hazırlama, elektroporasyon, geri kazanım ve transformantların seçimi dahil olmak üzere Escherichia coli'yi antibiyotik direnç geni taşıyan bir plazmit ile dönüştürme prosedürünü göstermektedir.

Yüksek Voltajlı Elektroporasyon Kullanılarak Bakterilerin Hazırlanması ve Dönüşümü

Bu protokol, ısı şoku proteini 70'in (Hsp70) şaperon aktivitesini gösterir. E. coli dnaK756 hücreleri, doğal, işlevsel olarak bozulmuş bir Hsp70 barındırdıkları için test için bir model görevi görür ve bu da onları ısı stresine duyarlı hale getirir. Fonksiyonel Hsp70'in heterolog girişi, hücrelerin büyüme eksikliğini kurtarır.

Isı Şoku Proteininin Şaperon Fonksiyonunu İncelemek için Escherichia coli Bazlı Tamamlama Testi 70

İn vivo montaj, DNA parçalarını homolog rekombinasyon yoluyla birleştirmek için bakterilerdeki içsel DNA onarım enzimlerine dayanan, ligasyondan bağımsız bir klonlama yöntemidir. Bu protokol hem zaman hem de maliyet etkindir, çünkü az sayıda reaktif gereklidir ve klonlama verimliliği %99'a kadar çıkabilir.

Yüksek Verimli Plazmid Yapımı için In Vivo Montaj Kullanımı

Bu makale, bir C41 (DE3) ekspresyon sisteminde toksik bir nükleaz olan rekombinant Nsp15'in aşırı eksprese edilmesi için bir metodolojiyi ve ardından afinite ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak etiketli proteinin saflaştırılmasını açıklamaktadır. Bu protokoller diğer zorlu toksik proteinler için uyarlanabilir.

Escherichia coli'den Toksik Bir Nükleazın Aşırı İfade Edilmesi ve Saflaştırılması

Plazmid DNA Qiagen Miniprep Kit kullanarak Bakteri kolonileri Arındırıcı

Bu çalışma kromozomal düzeyde bir RNA / DNA hibrid formu ve maya hücreleri genomik DNA, RNA genetik bilginin transferi ortaya nasıl gösterir.

RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Biz, iki boyutlu agaroz-jel analizi, UV ışını meydana çoğaltma ara yapısını tanımlamak için kullanılır olabilir bir prosedür sunuyoruz.

UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi

Bu protokol, verimli paralel açıklama ve plazmid DNA arıtma için uygun maliyetli bir...

Prokaryotik Kültürler itibaren Plazmid DNA Aerodinamik Arıtma

Burada, belirli bir hedef dizisi için, rastgele bir mutant kütüphane oluşturmak için basit bir protokol göstermektedir. Escherichia coli, in vivo olarak yapılan bu yöntem, yeni enzimatik faaliyetleri gelişmeye fonksiyonel seçimleri ile birleştiğinde nasıl kullanılabileceğini göstermek.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

Öğrenin, ısı şoku yöntemiyle E. coli'ye plazmid DNA dönüşümünü nasıl gerçekleştireceğinizi. Bu teknik, moleküler biyoloji ve genetik mühendisliği çalışmalarında temel bir yöntemdir.

Isı Şoku Yöntemiyle E. coli içine Plazmid DNA Dönüşüm

Daha fazla video keşfet