Isı Şoku Yöntemiyle E. coli içine Plazmid DNA Dönüşüm

Merhaba, ben Alex Hoge. California Irvine Üniversitesi Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'ndeki Gym Hall Lab'da çalışıyorum. Ve bugün size elektriksel olarak yetkin e coli'yi her bir şokun yöntemiyle nasıl dönüştüreceğinizi göstereceğim.

Bu yüzden bugün bu tekniği lasyon ürünümle bir koliyi dönüştürmek için kullanıyorum çünkü zebra balıklarında tam bir montaj işlemi yapmak için bir prob yapıyorum. Tamam, dönüşümü yapmaya başlayacağız. Bu yüzden önce su banyonuzu veya kuru otobüsünüzü 42 derecede yapmanız gerekir.

Ana şehirden yeni çıkardığınız bakterilerinizi buzda tutmanız gerekiyor. Bugün, ITY'lerden gelen elektriksel yeterlilik hücrelerini ve ayrıca buzdaki DNA'nızı kullanıyoruz. Ayrıca ev sıcaklığında veya 37 °C sıcaklığında SOC medya tüpüne ve LV artı antibiyotik medya plakalarınıza ihtiyacınız var.

Şimdi bakterilerle birlikte DNA'yı ekleyeceğim. Bu yüzden bakterileri kirletmemek için alevin yanında çalışıyorum. Bu yüzden bakterilerle birlikte lasyon ekliyorum.

50 mikrolitre bakteri ve hemen buzun içine geri döndüğünüzde, bakterileri ve DNA'nızı karıştırmak için biraz hafifçe vurabilir ve 15 dakikaya kadar buzda bırakabilirsiniz. Şimdi 15 dakika geçti ve bakterileri 45 saniye boyunca 42 dereceye getirmek olan ısı şokunu yapmaya hazırız. Bu yüzden tüpleri doğrudan 42 derecelik ayarda, 30 zamanlayıcıda 45 saniyede buzdan çıkarıyorum, ve sonra onları çok hızlı bir şekilde tekrar buza koyacağım ve 42'den doğrudan buzun üzerine koyacağım.

Ve sonra iki dakika bekliyoruz. Şimdi SOC ortamını bakterilerin içine ekleyeceğim ve onları 30 dakika boyunca 37'ye koyacağım. Bu yüzden 500 mikrolitre SOC ortamını buharlaştırıyorum ve bakterilerin içine koyuyorum ve onları küçük derme çatma odama koyuyorum.

Bu nedenle, kuluçka makineniz için eend tüpleri ve derme çatma hazne kullanacaksanız, eend tüplerinizi yatay olarak koyduğunuzdan emin olun çünkü bu şekilde çok daha iyi sallanacaklardır. Şimdi tüpleri çalkalayıcıya koymaya hazırız. İşte bu yüzden 30 dakika boyunca 37 derecede bu küçük odamız var.

Şimdi 37 derecede inkübasyonu tamamladık ve bakterileri lb artı antibiyotiklerle plakaya koyacağız. Yani benim durumumda kloral. Yani her numuneden 50 mikrolitre ve tabağa koyun.

Kalan 500 mikrolitre ile onları küçük bir masanın içinde döndürüyorsunuz, bazıları bakterileri soymak için reddediyor. Ifikasyondan sonra güzel bir pelet elde ediyoruz ve şimdi yapacağımız şey neredeyse tüm SOC ortamını çıkarmak, sadece 50 mikrolitre bırakmak ve sonra bu 50 mikrolitre konsantre bakteriyi plakalayabiliriz. Bu yüzden yaklaşık 450 mikrolitre ödedim.

Sadece bu kadarını bırakıyorum. Bu yüzden şimdi paleti SOC ortamının 50 mikrolitrelik solunda askıya alacağım. Ve ondan sonra bu 50 mikrolitreyi başka bir tabağa koyabilirim.

Bu yüzden her palete direniyorum, sonra onu kuklasa ediyorum ve plakalıyorum. Yani sonunda numune başına iki plaka olacaktır. Şimdi bakterileri LB plakasına yaymamız gerekiyor.

Bu yüzden bazı otoklav cam boncuklar kullanacağım, ama aynı zamanda bu şekilde yayıcı haline getirdiğiniz bir boru geçmişi de kullanabilirsiniz. Bu yüzden Petri kabına birkaç boncuk koyacağım. Hoşuma gidiyor.

Peki, 10 15. Boncukları ekledikten sonra, tüm tabaklarınızı bu şekilde bir yığına koyarsınız ve boncukların bakterileri tabakların her yerine eşit şekilde yayması için hafifçe sallarsınız. Bu yüzden plakaları kuruyana kadar hareket ettirirken.

Bu, boncuklarla hareket ettiğinizde büyük sıvı çizgileri görmemeniz gerektiği anlamına gelir. Örneğin, bu plakada, boncuklar birlikte çökme ve çok fazla çizgi görme eğilimindedir. Biri ter, boncuklar serbestçe hareket ediyor, bu kuru.

Artık plakalar kuru, böylece boncukları atabiliriz. Bu yüzden onları geri dönüştürebilmeniz için bu şekilde çekmeye devam ediyorum. Şimdi plakayı gece boyunca 37'de inkübatöre koyacağız ve siz plakaları 37'de 12 saatlik inkübatörden sonra ters çevirdiniz, plakayı inkübatörden çıkarıyoruz.

Ve gördüğümüz gibi, 50 mikrolitre ile kapladığım plakada, geri kalanını kapladığım plakadan daha az koloni var. Bakterileri dönüştürürken önemli olan, tabağınızda doğru miktarda, doğru yoğunlukta koloni bulundurmaktır. Yani bu yerde çok az koloniniz var, ama daha fazla koloni istiyorsanız, tam olarak doğru yoğunlukta olan bu plakada iyi bir örnek alabilirsiniz, plaka başına yaklaşık 100 koloni.

Bu plaka kötü bir örnek çünkü çok fazla koloni var ve tek tek kolonileri seçemezsiniz. Bu yüzden size her dönüşümde e coli'yi nasıl dönüştüreceğinizi gösterdim. Bu yüzden bu tekniğin en önemli yönü, şoktan önce her şeyi veya buz gibi soğuk tutmaktır.

Sonra 45 saniye normal, buzda 42 derece daha fazla. Ve sonra diğer her şeyin ılık bir sıcaklıkta veya 37 derecede olması gerekir. Şimdi kolonilerimi PCR taraması ile tarayacağım.

Yani önemli olan şeylerden biri de iki tabağa sahip olmaktır. Birincisi, çok sayıda koloniye sahip olmayı ve daha az koloni olmasını bekliyoruz. Ve önemli olan, boncuk veya pipo geçmişi kullanarak tabaklarınızın çok kuru olmasıdır.

İzlediğiniz için teşekkürler ve onayınızla iyi şanslar.