HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Bu prosedürün genel amacı, HIV ile enfekte bir hastada, hastanın kan plazmasından H-I-V-R-N-A'yı çıkarmaya başlamak için viral zarf geninin V üç bölgesini dizileyerek viral tropizmi çıkarmaktır. Daha sonra, iç içe geçmiş R-T-P-C-R kullanarak HIV GP one 20'nin V üç bölgesini yükseltin. Daha sonra jel elektroforezi kullanarak ürünün varlığını tanımlayın, ardından amplifiye V üç ürününün popülasyon tabanlı dizilimi ile devam edin.

Son olarak, temel çağırma yazılımını kullanarak dizileri analiz edin ve genomdan fenoya algoritmasını kullanarak ko-reseptör kullanımını çıkarın. Sonuç olarak, bu sonuçlar, HIVV üç döngüsünün popülasyona dayalı dizilimi yoluyla bir hastanın viral birliğinin R beş mi yoksa R beş mi olmadığını gösterebilir. Bu nedenle, bu tekniğin fenotipik hücre bazlı testler gibi mevcut yöntemlere göre bir birlik tahlili olmasının birincil avantajı, daha az başlangıç materyali ile daha kısa sürede daha düşük maliyet için dizileme aparatı ile donatılmış herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirilebilmesidir.

Bu teknik, antiretroviral tedavi ile tedavi ile ilgilidir, çünkü bir hastanın viral popülasyonunun 500 mikrolitre plazmadan bir CCR beş antagonistine yanıt verip vermeyeceğini belirleyebilir. H-I-V-R-N-A'yı çıkarmak için kolay bir mag otomatik çıkarıcı kullanın. Şimdi, viral popülasyonun yeterli örneklemesini sağlamak için R-T-P-C-R'yi kurmak için A PCR temiz odasına geçin.

Bu tek adımlı reaksiyonda her ters transkripsiyon reaksiyonunu üç kopya halinde gerçekleştirmeyi planlayın. CDNA'yı sentezlemek için viral RNA kullanın, özellikle SQV üç F1 ve CO 6 0 2 prime onarımı ile HIVV üç bölgesini amplifiye edin. Reaksiyon başına bileşenlere dayalıdır.

Bir tekrarlayıcı pipet kullanarak yükseltilecek numune sayısı için yeterli bir stok karışım çözeltisi hazırlayın PCR plakasının her bir oyuğuna 36 mikrolitre numune karışımı ekleyin. Şimdi, mikrolitre RNA numune ekstraktını belirlenen kuyucukların her birine dönüştürmek için çok kanallı bir pipete geçin. Her ekleme arasında ipuçlarını değiştirmeye özen gösterin.

Transfer tamamlandıktan sonra, kuyuları PCR şerit kapakları ile kapatın. Ardından PCR plakasını HIVV üç bölgesinin bir adımlı R-T-P-C-R için programlanmış bir termodöngüleyiciye yerleştirin. İç içe PCR için SQV üç F iki ve CD dört R astar onarımını kullanın.

Bir PCR temiz odasında yükseltilecek numune sayısı için gereken reaktif miktarını hesaplayın. İç içe PCR karışımını oluşturun ve ardından temiz bir PCR plakasının oyuğu başına 19 mikrolitre ayırmak için bir tekrarlayıcı pipet kullanın. RTPR'nin tamamlanmasının ardından, bir amplifikasyon sonrası odaya geçin.

R-T-P-C-R şablonunun bir mikrolitresini iç içe PCR karışımına aktarmak için sekiz kanallı çok kanallı bir pipet kullanın. Her ekleme arasında ipuçlarını değiştirin. Kuyuları PCR şerit kapaklarıyla kapatın ve amplifikasyon için plakayı bir termodöngüleyiciye aktarın.

Sıcaklık 25 santigrat dereceye döndükten sonra plakayı termocycler'dan çıkarın. V üç bölgesinin başarılı bir şekilde amplifiye edildiğini doğrulamak için, önce ürünleri jel elektroforezi ile analiz edin. Siber güvenli jel lekesi ile %1.6'lık bir AROS jeli hazırlayın.

10 mikrolitrelik çok kanallı pipet kullanarak. Sekiz mikrolitre PCR örneğini ilgili kuyucuklara aktarın. Ayrıca her sıra için en az bir kuyuya bir DNA merdiveni yükleyin.

Jeli 10 dakika boyunca yaklaşık 100 voltta çalıştırın. Bantları ultraviyole floresan ile görselleştirin ve görüntüyü fotoğrafla belgeleyin. Tüm üçlü amplifikasyonların başarılı olduğu örnekleri not edin.

Gerekirse, üçten az ürün amplifikasyonu olan numuneler için R-T-P-C-R'yi tekrarlayın. Amplifiye edilmiş viral CDNA örnekleri ayrıca DNA dizileme ile doğrulanır, reaksiyonlar V 3 0 2 F ve S QV üç R bir primer kullanılarak gerçekleştirilecektir. Büyük di reaktifi dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün.

Çalıştırılacak numune sayısı için gerekli reaktifleri hesaplayın ve hazırlayın. Beş mikrolitre dizileme reaksiyonu, çok kanallı bir pipet kullanarak uygun plaka kuyucuklarına karıştırılır. Plakayı bir Kim mendiliyle örtün ve bir kenara koyun.

Bu arada, kalan PCR ürününe 180 mikrolitre steril su ekleyerek amplifiye edilmiş PCR ürününün bir ila 15 oranında seyreltilmesini hazırlayın. Seyreltilmiş numunenin bir mikrolitresini uygun plakanın dibine pipetleyin. Kuyular, numune transferi tamamlandığında numuneler arasında her zaman uçları değiştirir.

Plakayı şerit kapaklarla kapatın ve bir saniye boyunca girdap yapın. Plakayı santrifüjlemek için hızı 140 5G'ye ayarlayın. Sıkma hızı 140 5G'ye ulaştığında sıkmayı durdurun.

Reaksiyonun devam etmesi için plakayı bir termodöngüleyiciye yerleştirin. Her kuyucukta DNA'yı dört mikrolitre üç molar sodyum asetat ve 40 mikrolitre soğutulmuş% 95 Etanol ile çökeltin, kapakları tekrar kapatın. Plakayı 10 saniye boyunca korteksleyin ve hava kabarcıklarını çıkarmak için plakaya hafifçe vurun.

Plakaları eksi 20 santigrat derecede 30 dakika ile iki saat arasında yerleştirin. 20 dakika boyunca 2000 G'de santrifüjleme ile DNA'yı geri kazanın. Şerit kapakları çıkarın ve atın.

Plakayı atık kabının üzerine ters çevirin ve süper natini boşaltın. Kalan süper natinlerden kurtulun. Ters çevrilmiş plakaları bir kağıt havlu üzerine kurulayarak.

Plakayı sandviçlemek için iki yaprak kağıt havlu katlayın. Plakayı yüzü aşağı bakacak şekilde santrifüje yerleştirin ve 140 5G'de döndürün. 140 5G'ye ulaştığında dönüşü durdurmak.

Daha sonra 155 mikrolitre% 95 etanol ile yıkayın ve boşaltın. Ardından santrifüjleme işlemini tekrarlayın. Son etanolün buharlaşmasına izin vermek için plakayı iki ila beş dakika bekletin.

DNA örneklerini denatüre etmek için, boş olanlar da dahil olmak üzere plakadaki tüm oyuklara 10 mikrolitre yüksek boya dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Plakayı bir septima ile kapatın ve iki dakika boyunca 90 santigrat derecede bir termosiklere yerleştirin. Son olarak, numune plakasını bir sıralama plakasına ve sıralayıcıya yerleştirin.

Veri analizine giden kabul edilebilir bir yol, insan müdahalesi olmadan otomatik temel arama gerçekleştirmek için yazılım geri çağırmanın kullanılmasıdır. Geri çağırma, ücretsiz bir özel tabanlı arama yazılımıdır: oturum açın ve göz atma seçeneğiyle yüklemek için örnek dosyaları seçin. Ham sıralama veri dosyasını bulun ve 20 megabayta kadar karşıya yükleyin.

Ardından, referans sırasını V üçe ayarlayın. İşlem verileri'ne tıklayın. Örneklerin listesini göstermek için sayfanın sağ tarafında ortaya çıkan klasörü seçin.

Kırmızı olanlar başarısız oldu. Yeşil olanlar geçti. Belirli bir örneğe ve görüntüle düğmesine tıklayarak, diziyi gözden geçirebilir, dizide gezinmek için sayfanın sağ tarafındaki talimatları takip edebilir, dosyaları bir zip klasörüne indirebilirsiniz.

Viral tropizm, geno ila feno ko-reseptör algoritması kullanılarak popülasyon tabanlı dizileme ile oluşturulan dizilerden çıkarılabilir. Önemli ayarın açılır menüsünden, motive edici %2 ve %5,75 FPR'den klinik verilerin analizine dayalı olarak optimize edilmiş olanı seçin. Şimdi analiz için bir dizi yüklemeyi veya yapıştırmayı seçin.

FASTA dosyaları kabul edilebilir. CCR beş antagonistine yanıt verme konusunda bir geno Tono FPRA tahmincisi elde etmek için başka bir ilerleme eklemeyin. Oluşturulan G iki P raporu, amino asitlerde V üç döngü dizisini sağlar ve virüs kullanan R beş olmayan ile ilişkili mutasyonlardan ilgili pozisyonları gösterir.

Raporun alt kısmında, yanlış pozitiflik oranı verilmiş ve bir CCR beş antagonistine verilen yanıt açısından yorumlanmıştır. Bu rapor PDF dosyası olarak indirilebilir. Bir numuneden alınan üç diziden herhangi birinin R beş olmadığı sonucuna varılırsa, hastanın beklendiği gibi bir CCR beş antagonistine yanıt vermesi muhtemel değildir RTP CR'nin jel elektroforezi HIV bir V üç döngüsünün amplifikasyonları, tüm klinik numunelerin bir ürün üretmediğini gösterir.

Amplifiye edilmiş numunelerden oluşturulan diziler, geri çağırma yoluyla okunan bir kromatogramda görselleştirilebilir. Birkaç karışım içeren temiz bir dizi beklenir. Bazen diziler dağınık olabilir ve doğru temel atamaya uygun olmayabilir.

Bazı hastalar, burada gösterildiği gibi virüs kullanan CCR beş olmayan olarak tanımlanabilir. Bu hastaların bir CCR beş antagonisti ile tedaviye yanıt vermesi muhtemel değildir. Bununla birlikte, hastaların çoğunluğunun, G two P analiz raporunun altındaki yeşil bir kutu ile belirtildiği gibi, virüs kullanan CCR beşten oluşan bir viral popülasyona sahip olduğu bulunmuştur.

Yani bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik baştan sona yaklaşık dört gün içinde gerçekleştirilebilir. Bu, ekstraksiyondan analize kadar. Bu videoyu izledikten sonra, genom feno biyoinformatik algoritması ile birlikte popülasyon tabanlı dizileme yöntemlerini kullanarak viral tropizmi nasıl tahmin edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Tamam, bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.