Name: HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Öğrenin, HIV-1 tropizmini V3 bölgesi dizileme ve iç içe RT-PCR kullanarak genotipik olarak çıkarın. Bu biyoinformatik yöntem, CCR5 antagonist tedavi yanıtını hızlı ve ekonomik şekilde belirler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu testin geliştirilmesi Viiv Sağlık ve Sağlık Araştırması (CIHR) Kanada Enstitüleri ve GlaxoSmithKline / CIHR Başkanı Dr Harrigan Klinik Viroloji ile desteklenmiştir. Pfizer ve ViiV Sağlık sağlanan destekler.

<ol><li>Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+cofactor%3A+functional+cDNA+cloning+of+a+seven+transmembrane%2C+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor.</a> Science. 272, 872-877 (1996).</li>
<li>Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+into+CD4%2B+cells+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+CC-CKR-5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5.</a> Nature. 381, 667-673 (1996).</li>
<li>Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+%28UK-427%2C857%29%2C+a+potent%2C+orally+bioavailable%2C+and+selective+small-molecule+inhibitor+of+chemokine+receptor+CCR5+with+broad-spectrum+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).</li>
<li>Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+for+previously+treated+patients+with+R5+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection.</a> N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).</li>
<li>Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+versus+efavirenz%2C+both+in+combination+with+zidovudine%2Flamivudine%2C+for+the+treatment+of+antiretroviral-na%C3%ADve+subjects+with+CCR5-tropic+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1.</a> J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).</li>
<li>Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trofile+HIV+co-receptor+usage+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Med.+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Trofile HIV co-receptor usage assay.</a> Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).</li>
<li>Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+HIV+co-receptor+usage+based+on+genetic+and+clinical+covariates%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Ther%22%5BJournal%5D)">Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates.</a> Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).</li>
<li>Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 5th International AIDS Society Conference, 2009 19-22 July, Cape Town, South Africa, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 12th European AIDS Conference, 2009 11-14 Nov, Cologne, Germany, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Swenson, L. C., McGovern, R. A. 47th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, 2009 Oct 29 - Nov 1, Philadelphia, PA, USA, , (2009).</li>
<li>Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. 49th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 12-15 Sept, San Francisco, CA, , (2009).</li>
<li>Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Detection+of+CXCR4-Using+HIV+by+V3+Genotyping%3A+Application+of+Population-based+and+%27Deep%27+Sequencing+to+Plasma+RNA+and+Proviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Acquired+Immune+Deficiency+Syndromes%22%5BJournal%5D)">Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).</li>
<li>Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+determination+of+HIV-1+tropism+in+the+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Therapy%22%5BJournal%5D)">Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting.</a> HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).</li>
</ol>

P. Richard Harrigan ViiV Sağlık, Virco, Merck, Abbott, ve Görev çıkar çatışmaları vardır. Bu video-makale ViiV Sağlık tarafından desteklenmektedir.

Burada sunulan yöntem tropizm test uygulanan standart bir sıralama yöntemi. Geç sınırlı kadar viral tropizm tahmin sıralama HIV zarf V3 döngü klinik uygulama vardır. Bu yöntem, en az eşit klinik kullanılan diğer valide deneyleri ile karşılaştırıldığında viral tropizm tahmin etmek mümkün Maraviroc (ViiV Sağlık) klinik çalışmalarda retrospektif analizler gösterilir olmuştur. Tropizm tahmini için V3 döngü genotipik analizi yapan pek çok faydaları vardır. Birincisi ve en önemlisi, bu yordamı erişilebilirliğini önemli ölçüde artan ve tropizm test dönüş süresini azaltmak, operasyonel sıralama ekipmanları ile herhangi bir tesiste olabilir. Buna karşılık, tropizm test etmek için altın standart olarak hizmet vermiştir fenotipik Geliştirilmiş Hassasiyet Trofile Assay (ESTA) (Monogram Biosciences), Güney Kaliforniya&#39;da tek bir merkezden yapılır. Ek faydaları daha az başlangıç ​​materyali ve 500copies/mL gerekli minimum plazma viral yük ihtiyacını. Yanı sıra, genotipik analiz çalışan operasyonel maliyetlerini fenotipik bir testin kıyasla nispeten düşük. Özellikle hatırlama yazılımı kullanımı genotip analizleri emek yoğun bir parçası olma eğilimindedir manuel sıra eleştiri, gereksinimini ortadan kaldırır. Burada sunulan yöntem, belirli bir adım önemi başka bir outweighing oldukça basittir. Biz, örnek bir viral nüfus içinde azınlık türlerin yakalama oran artırmak için üç nüsha olarak PCR ve sıralama çalıştırmanızı öneririz. Üçten çoğaltır daha büyük yapılabilir ancak biz bulduk, hem verimli ve güvenilir olması için triplicates. Ayrıca, yüksek duyarlılık ve özgüllük korurken aynı tepki olarak RT-PCR ve ilk tur PCR gerçekleştiren One-Step Reverse Transcriptase PCR kiti (Qiagen) kullanmanızı öneririz.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;NucliSens easyMAG versiyon 1.0 kullanılarak RNA ekstraksiyonu&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Manyetik Silika</td><td>bioMerieux</td><td>kat. # 280133</td><td>(48 x 0.6 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Lizis Tamponu</td><td>bioMerieux</td><td>kat. # 280134</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Ekstraksiyon Tamponu 1</td><td>bioMerieux</td><td>kat. # 280130</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Ekstraksiyon Tamponu 2</td><td>bioMerieux</td><td>kat. # 280131</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Ekstraksiyon Tamponu 3</td><td>bioMerieux</td><td>kat. # 280132</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG versiyon 1.0</td><td>bioMerieux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sınıf II A2 biyolojik güvenlik kabini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tek Adımlı Ters Transkriptaz PCR ve İkinci Tur PCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DEPC ile işlem görmüş su</td><td>Ambion</td><td>kat. # 9922</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq High Fidelity ile SuperScrip III Tek Adımlı RT-PCR Sistemi</td><td>Invitrogen</td><td>kat#12574-035</td><td>Kullanılan kit bileşenleri:&lt;br/&gt;- SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelity Enzim Karışımı&lt;br/&gt;- 2X Reaksiyon Karışımı (her bir dNTP'den 0.4mM ve 2.4mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; içeren bir tampon)</td></tr><tr><td>Expand High Fidelity PCR Sistemi</td><td>Roche Group</td><td>kat. # 1 759 078</td><td>Kullanılan kit bileşenleri:- 15 mM MgCl2 içeren 10X konsantrasyonlu Expand High Fidelity Tamponu (kapakları 2 olarak işaretlenmiş)- Expand HF PCR Enzim Karışımı (3.5U/&amp;#x03BC;l)- MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Stok Çözeltisi (25mM) (kapakları 4 olarak işaretlenmiş)</td></tr><tr><td>dNTP'ler: dATP, dGTP, dCTP, dTTP</td><td>Roche Group</td><td>kat. # 11969064001</td><td>(100 mM)</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>kat. # S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>kat.# B5525</td><td></td></tr><tr><td>Krezol Kırmızısı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>kat.# 114472-5G</td><td>indikatör sınıfı</td></tr><tr><td>Termosiklet cihazı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Jel Elektroforezi&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50X TAE tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>kat. # 24710030</td><td>(1000 ml)</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA jel boyası</td><td>Invitrogen</td><td>kat. # S33102</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz (ultra saf)</td><td>Invitrogen</td><td>kat. # 15510-027</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel Düşük Aralıklı Kantitatif DNA Merdiveni</td><td>Invitrogen</td><td>kat. # 12373-031</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif Sınıfı Tip II su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jel düzeneği</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sekanslama&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABI PRISM BigDye Terminator Döngü Sekanslama Kiti</td><td>Applied Biosciences</td><td>kat. # 4337458</td><td>(25000 reaksiyon)</td></tr><tr><td>Hi-Di Formamid</td><td>Applied Biosciences</td><td>kat. # 4311320</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Asetat (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>kat. # S-2889</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kat.# 03690-100ML</td><td>0.5M, pH=8.0</td></tr><tr><td>TRIZMA Hidroklorür Tampon Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>kat. # T-2819</td><td>1 M, pH 9.0</td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>kat. # M-1028</td><td>1 M</td></tr><tr><td>%95 Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA içeren Koşu Tamponu (10X)</td><td>Applied Biosystems</td><td>kat. # 4335613</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Polimer Pop-7 (25mL) veya Polimer Pop-7 (10mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>kat. # 44363929 veya kat. # 4352759</td><td></td></tr><tr><td>3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sekanslama Standart Kiti</td><td>Applied Biosciences</td><td>Kat# 4336943</td><td></td></tr><tr><td>Termosiklet cihazı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaka tutuculu santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3730xl DNA Analizörü</td><td>Applied Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hiv-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak nüfus tabanlı sıralama v3

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Amaç: HIV tedavisi CCR5-antagonist sınıf bir ilaç almak için önce onun viral nüfus hücresel giriş için alternatif bir coreceptor CCR5 coreceptor kullanır ve bu onaylamak için, bir hastanın HIV tropizm testi geçmesi gerekir. Tropizm test edilmesine yönelik bir yaklaşım coreceptor etkileşim HIV zarf, V3 bölgenin sırasını incelemek için. Yöntemleri: viral RNA kan plazmasından elde edilir. V3 bölge, iç içe geçmiş bir ters transkriptaz-PCR ile üç nüsha olarak yükseltilir. Ilâvelerle sonra sıralı ve yazılım, RE_Call kullanılarak analiz edilmektedir. Diziler sonra V3 bölge viral tropizm anlaması için böyle geno2pheno gibi bir biyoinformatik algoritmasına sunulur. Diziler geno2pheno yanlış pozitiflik oranı% 5.75 altına düşerse non-R5 anlaşılmaktadır. Bir örneklem üzerinden üç dizileri herhangi bir non-R5 anlaşılmaktadır ise, hastanın bir CCR5-antagonist yanıt vermek olası değildir.

HIV tropizm viral zarf V3 bölge anlaşılmaktadır. V3 PCR, iç içe geçmiş RT-PCR, sıralı kullanarak üç nüsha olarak amplifiye ve biyoinformatik yazılımı kullanılarak yorumlanır. Örnekleri dizisi G2P puanları düşük olan 1 veya daha fazla (ler) ile non-R5 virüsü olarak sınıflandırılır.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Arka Plan: HIV tedavisinde CCR5-antagonisti sınıfından bir ilaç almadan önce, hastanın ... olduğunu onaylamak için bir HIV tropizm testine tabi tutulması gerekir.

Bu prosedürün genel amacı, hastanın kan plazmasından HIV RNA ekstraksiyonu yaparak viral zarf geninin V3 bölgesini dizilemek suretiyle HIV enfeksiyonu olan bir hastadaki viral tropizmi belirlemektir. Ardından, iç içe RT-PCR kullanılarak HIV GP120'nin V3 bölgesi amplifiye edilir. Daha sonra, jel elektroforezi kullanılarak ürünün varlığı tespit edilir ve ardından amplifiye edilen V3 ürünlerinin popülasyon tabanlı dizilemesi gerçekleştirilir.Son olarak, sekansları baz çağırma (base calling) yazılımı kullanarak analiz edin ve genome-to-pheno algoritmasını kullanarak ko-reseptör kullanımını belirleyin. Nihayetinde bu sonuçlar, HIV-1 V3 loop'unun popülasyon tabanlı sekanslanması yoluyla, bir hastanın viral tropizminin R5 mi yoksa non-R5 mi olduğunu gösterebilir. Dolayısıyla, bu tropizm analiz tekniğinin fenotipik hücre tabanlı analizler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sekanslama cihazına sahip herhangi bir laboratuvarda, daha düşük maliyetle, daha kısa sürede ve daha az başlangıç materyali ile gerçekleştirilebilmesidir.Bu teknik, 500 µL plazmadan faydalanarak bir hastanın viral popülasyonunun bir CCR5 antagonistine yanıt verme olasılığının belirlenebilmesi nedeniyle antiretroviral terapi tedavisi ile ilgilidir. HIV RNA'yı ekstrakte etmek için EasyMag otomatik ekstraktör kullanın. Viral popülasyonun yeterli örneklemesini sağlamak amacıyla RT-PCR kurulumunu gerçekleştirmek için bir PCR temiz odasına geçin.Bu tek aşamalı reaksiyonda, her bir ters transkripsiyon reaksiyonunu üç paralel (triplikatta) gerçekleştirmeyi planlayın. cDNA sentezlemek için viral RNA kullanın ve özellikle SQV three F1 ve CO 6 0 2 prime repair ile HIVV three bölgesini amplifiye edin. Reaksiyon başına bileşenleri temel alın.Tekrarlayıcı pipet kullanarak, amplifiye edilecek örnek sayısına yetecek miktarda bir stok karışım çözeltisi hazırlayın. PCR plakası kuyucuklarının her birine 36 µL örnek karışımı ekleyin. Ardından, belirlenmiş kuyucukların her birine µL cinsinden RNA örnek ekstraktı aktarmak için çok kanallı pipete geçin. Her ekleme arasında uçları değiştirmeye özen gösterin.Transfer işlemi tamamlandığında, kuyucukların üzerini PCR şerit kapaklarla kapatın. Ardından, PCR plakasını HIVV üç bölgesinin tek basamaklı R-T-P-C-R işlemi için programlanmış bir termosikletöre yerleştirin. Nested PCR için SQV üç F iki ve CD dört R primer çiftini kullanın.Bir PCR temiz odasında amplifiye edilecek örnek sayısı için gerekli reaktif miktarını hesaplayın. İç içe (nested) PCR karışımını hazırlayın ve ardından bir tekrarlayıcı pipet kullanarak temiz bir PCR plakasının her kuyucuğuna 19 µL paylaştırın. R-T-P-C-R işlemi tamamlandığında, amplifikasyon sonrası odaya geçin.R-T-P-C-R kalıbının bir mikrolitresini nested PCR karışımına aktarmak için sekiz kanallı çok kanallı bir pipet kullanın. Her ekleme arasında uçları değiştirin. Kuyucukların üzerini PCR strip kapaklarla kapatın ve amplifikasyon için plakayı bir termosikletere aktarın.Sıcaklık 25 °C'ye döndükten sonra plakayı termosiklerden çıkarın. V3 bölgesinin başarıyla amplifiye edildiğini doğrulamak için öncelikle ürünleri jel elektroforezi ile analiz edin. Cyber safe jel boyası içeren %1,6'lık bir agaroz jel hazırlayın.10 µL'lik çok kanallı bir pipet kullanarak, 8 µL'lik PCR örneklerini ilgili kuyucuklara aktarın. Ayrıca, her satırdaki en az bir kuyucuğa DNA merdiveni yükleyin.Jeli yaklaşık 100 volt değerinde 10 dakika boyunca çalıştırın. Bantları ultraviyole floresans ile görüntüleyin ve görüntüyü fotoğraf çekerek belgeleyin. Tüm triplike amplifikasyonların başarılı olduğu örnekleri not edin.Gerekirse, üçten az ürün amplifikasyonu olan örnekler için R-T-P-C-R işlemini tekrarlayın. Amplifiye edilen viral CDNA örnekleri, V 3 0 2 F ve S QV three R one primerleri kullanılarak gerçekleştirilecek DNA dizileme reaksiyonları ile daha fazla doğrulanacaktır. Big di reaktifini dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün.Çalıştırılacak örnek sayısına göre gerekli reaktifleri hesaplayın ve hazırlayın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, uygun plaka kuyucuklarına beş µL sekanslama reaksiyon karışımı ekleyin. Plakayı bir Kim wipe ile örtün ve kenara ayırın.Bu sırada, kalan PCR ürününe 180 µL steril su ekleyerek amplifiye edilmiş PCR ürününün 1/15'lik dilüsyonunu hazırlayın. Seyreltilmiş numuneden 1 µL'yi uygun plaka kuyucuklarının dibine pipetleyin. Numune transferi tamamlandığında, numuneler arasında her zaman uç değiştirin.Plakayı şerit kapaklarla kapatın ve bir saniye boyunca vorteksleyin. Plakayı santrifüj etmek için hızı 140 5G olarak ayarlayın. Dönüş hızı 140 5G'ye ulaştığında, santrifüjü durdurun.Reaksiyonun gerçekleşmesi için plakayı bir termosikletöre yerleştirin. Her kuyucuğa DNA'yı çöktürmek için dört µL 3 M sodyum asetat ve 40 µL soğutulmuş %95 Ethanol ekleyin, ardından kapakları tekrar kapatın. Plakayı 10 saniye boyunca vorteksleyin ve hava kabarcıklarını gidermek için plakaya hafifçe vurun.Plakaları -20 °C'de 30 dakika ile iki saat arasında bekletin. DNA'yı 2000 ×g'de 20 dakika santrifüj ederek geri kazanın. Şerit kapaklarını çıkarın ve atın.Plakayı atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı dökün. Ters çevrilmiş plakaları bir kağıt havluya bastırarak kalan süpernatantı tamamen temizleyin.Plakayı araya almak için iki kat kağıt havlu katlayın. Plaka yüzü aşağıya gelecek şekilde santrifüje yerleştirin ve 140 5G'de döndürün. Dönme işlemini 140 5G'ye ulaştığında durdurun.Ardından 155 µL %95 etanol ile yıkayın ve üst fazı dökün. Sonra santrifüj işlemini tekrarlayın. Kalan etanolün tamamen buharlaşması için plağı iki ila beş dakika boyunca bekletin.DNA örneklerini denatüre etmek için, boş olanlar da dahil olmak üzere plaktaki tüm kuyucuklara çok kanallı bir pipet kullanarak 10 µL high dye for maide dağıtın. Plağı bir septa ile kapatın ve iki dakika boyunca 90 °C'de bir termosikletöre yerleştirin. Son olarak, örnek plağını bir sekanslama plağına ve ardından sekanslayıcıya yerleştirin.Veri analizi için kabul edilebilir bir yöntem, insan müdahalesi olmadan otomatik baz çağırma işlemi gerçekleştirmek amacıyla Recall yazılımının kullanılmasıdır. Recall, ücretsiz ve özel bir baz çağırma yazılımıdır; sisteme giriş yapın ve gözat seçeneği ile yüklenecek örnek dosyaları seçin. Ham sekanslama veri dosyasını bulun ve 20 megabytes'a kadar yükleme yapın.Ardından, referans diziyi V three olarak ayarlayın. Verileri işle (process data) seçeneğine tıklayın. Örnek listesini görüntülemek için sayfanın sağ tarafındaki sonuç klasörünü seçin.Kırmızı olanlar başarısız olmuştur. Yeşil olanlar ise başarılı olmuştur. Belirli bir örneğe ve görüntüle düğmesine tıklayarak sekansı inceleyebilir, sekans içerisinde gezinmek için sayfanın sağ tarafındaki talimatları takip edebilir ve dosyaları bir zip klasörü olarak indirebilirsiniz.Viral tropizm, geno to pheno ko-reseptör algoritması kullanılarak popülasyon tabanlı sekanslama ile elde edilen dizilerden çıkarılabilir. Önemli ayarlar açılır menüsünden, motivate %2 ve %5.75 FPR klinik veri analizine göre optimize edilmiş olanı seçin. Şimdi analiz için bir dizi yüklemeyi veya yapıştırmayı seçin.FASTA dosyaları kabul edilmektedir. CCR5 antagonistlerine karşı yanıt verme durumunun geno Tono FPRA öngörücüsünü elde etmek için başka işlemler eklemeyin. Oluşturulan G2P raporu, amino asit cinsinden V3 loop sekansını sağlar ve R5 kullanmayan virüslerle ilişkili mutasyonların ilgili konumlarını belirtir.Raporun altında, yalancı pozitiflik oranı verilmiş ve bir CCR five antagonistine verilen yanıt açısından yorumlanmıştır. Bu rapor PDF dosyası olarak indirilebilir. Bir örnekten alınan üç sekanstan herhangi birinin R five olmadığı sonucuna varılırsa, hastanın bir CCR five antagonistine beklenen yanıtı vermesi olası değildir; HIV one V three loop'un RTP CR amplifikasyonlarının jel elektroforezi, tüm klinik örneklerin ürün oluşturmadığını göstermektedir.Amplifiye edilen örneklerden elde edilen diziler, recall tarafından okunan bir kromatogramda görselleştirilebilir. Az sayıda karışımın olduğu temiz bir dizi beklenir. Diziler bazen karmaşık olabilir ve doğru baz atamasına uygun olmayabilir.Bazı hastaların, burada gösterildiği gibi CCR5 kullanan virüs taşımadığının tespit edilmesi mümkündür. Bu hastaların CCR5 antagonist tedavisine yanıt verme olasılığı düşüktür. Ancak, G2P analiz raporunun altındaki yeşil kutuda belirtildiği üzere, hastaların çoğunluğunun CCR5 kullanan virüslerden oluşan bir viral popülasyona sahip olduğu görülmektedir.Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, başlangıçtan sona yaklaşık dört günde uygulanabilir. Bu süre, ekstraksiyondan analize kadar olan süreci kapsar. Bu videoyu izledikten sonra, genome pheno biyoinformatik algoritması ile birlikte popülasyon tabanlı sekanslama yöntemlerini kullanarak viral tropizmin nasıl öngörüleceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.Pekala, her şey bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.

genotypic-inference-hiv-1-tropism-using-population-based-sequencing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

HIV-1 RNA düzeyi, plazma ve sıralama miktarının tek HIV-1 viral yük saptama sınırının altında (50-75 kopya / ml) bireylerin genomların zordur. Burada özü ve güvenilir bir şekilde HIV-1 RNA 0.3 kopya / ml tedbirler ve çok düşük viral yük örnekleri, tek bir genom sıralama viral genomların yükseltmek için nasıl bir gerçek zamanlı PCR kullanarak plazma viral RNA miktarını nasıl açıklar.

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

HIV-1 coreceptor kullanımının tahmin antiretroviral ilaçlara, örneğin coreceptor antagonistlerinin yeni bir sınıfını idaresi için gereklidir. Bu, bir dizi analizi ile...

Bir Genotipik Yöntemi&#39;ne Dizi Analizi ile HIV-1 coreceptor Kullanımı (tropizm) Tahmin

Antiretroviral tedavisi (ART) başarısız HIV-1 enfekte bireyler için ilaç direnci test gelecekteki tedaviler rehberlik ve tedavi sonuçlarını artırabilir. HIV yaygınlığının yüksek ama kaynak sınırlı ayarları optimize bireysel ve nüfus sağlık çıktıları sonuçta uygun fiyatlı ve erişilebilir ilaç direnci genotiplendirmesi ve yorumlama yöntemlerini gerektirir.

Kaynak Sınırlı Ayarlar için uygun bir HIV-1 İlaç Direnci İzleme Yöntemi

HIV-1 patogenezi hem viral özellikler hem de konak genetik faktörleri ile tanımlanır. Burada, gag gen dizisi varyasyonunun virüsün in vitro replikasyon kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için tekrarlanabilir ölçümlere izin veren sağlam bir yöntemi açıklıyoruz.

Bir Kısıtlama Enzim Temelli Klonlama Yöntemi değerlendirin<em&gt; In vitro</em&gt; HIV-1 Tipi C Gag-MJ4 Kimerik Virüslerin Çoğaltma Kapasitesi

Neredeyse izojenik virüsler arasındaki büyüme rekabeti, göreceli replikasyon uygunluğunu belirlemek için hassas bir ölçüm sağlar. Burada açıklanan protokoller, rekombinant HIV-1 klonlarının oluşturulmasını, virüs yayılımını ve büyüme rekabetini ve hassas ve tutarlı sonuçlar elde etmek için optimize edilmiş analiz yöntemlerini içerir.

İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

Enfekte hücrelerin genomik DNA'sından retroviral entegrasyon bölgelerini amplifiye etmek, amplifiye edilmiş virüs-konak bağlantılarını dizilemek ve daha sonra bu dizileri bir referans genoma eşlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, BEDTools kullanarak çeşitli genomik açıklamalara göre entegrasyon bölgelerinin dağılımını ölçmek için teknikler de açıklıyoruz.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Bu el yazması, aynı anda yukarı akış ve aşağı akış vektör-konakçı bağlantı DNA'sını analiz edebilen çift yönlü bir entegrasyon alanı tahlilinin deneysel prosedürünü ve yazılım analizini anlatmaktadır. Çift yönlü PCR ürünleri, herhangi bir aşağı akım sıralama platformu için kullanılabilir. Ortaya çıkan veriler, entegre DNA hedeflerinin yüksek verimli, niceliksel bir karşılaştırması için kullanışlıdır.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Açıklanan 96 genlerin ifade quantitate için bir metodoloji olduğunu ve 18 yüzey proteinler tarafından tek hücreleri ex vivodifferentially tanımlanması için izin, genler ve proteinler kandan hücrelere göre virüs enfeksiyonlu hücrelerdeki dile getirdi. Yaklaşım+ T çalışma SIV-enfekte CD4 için uyguladığımız rhesus makak izole hücreler.

Tek hücreli Nefelometri mRNA ve yüzey Protein Simian virüs, immün yetmezlik enfekte CD4 ifadede+ T hücreleri izole Rhesus makak üzerinden

Tam uzunlukta bireysel proviral sıralama (döndürür) amplifikasyon ve sıralama tek, tam uzunlukta (sağlam ve arızalı) HIV-1 proviruses yakınındaki bir verimli ve yüksek işlem hacmi yöntemi sağlar ve potansiyellerini belirlenmesi için izin verir çoğaltma-yetkinlik. DÖNDÜRÜR önceki deneyleri gizli HIV-1 rezervuar sıralamak için tasarlanmış sınırlamalar üstesinden gelir.

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

Burada yeni doğmakta olan 3'-termini tarafsız bir belirlenmesi yanı sıra tek iplikçikli DNA moleküllerinin mutational profilleri sağlar bir derin sıralama yaklaşım mevcut. Ana uygulama doğmakta olan retroviral tamamlayıcı DNA'lar (cDNAs), retroviral Ters transkripsiyon işlemi sırasında oluşturulan ara ürün karakterizasyonudur.

Ters transkripsiyon enfekte hücreleri içinde belirleyici 3'-Termini ve HIV-1 sırasında doğmakta olan tek iplikçikli Viral DNA moleküllerinin dizileri

Öğrenin, HIV-1 tropizmini V3 bölgesi dizileme ve iç içe RT-PCR kullanarak genotipik olarak çıkarın. Bu biyoinformatik yöntem, CCR5 antagonist tedavi yanıtını hızlı ve ekonomik şekilde belirler.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Daha fazla video keşfet