Name: Karşı Monoklonal Antikorlar Pasif Yönetim H. capsulatum Ve Diğerleri Fungal Patojenler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Öğrenin Histoplasma capsulatum'a karşı monoklonal antikorların koruyucu etkinliğini fare modelinde nasıl değerlendirirsiniz. Bu yöntem humoral bağışıklık ve fungal patogenez araştırmalarında önemli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. H. Büyüme Capsulatum <ol><li> 20 dakika UV ışını ile% 10 çamaşır suyu ile temizlik kabine mantar ile çalışmak için bir biyogüvenlik kabini hazırlayın. H. maya aşamasında kalıp formu BSLIII gerektirir capsulatum, Biyogüvenlik düzeyi (BSL) II uygulamaları gerektirir. Maya formu aşağıdaki adımları kullanın. </li><li> Sonraki 5 ml PBS ile 15 ml konik tüp hazırlamak. Hasat bir koloni H. capsulatum BHI kan agar plaka [şekeri 10 g / L sistein 0,1 g / L, penisilin-streptomisin,% 1 ve koyun kırmızı kan hücreleri 50 ml / L (Colorado Serum Co, Colorado, ABD) (suşu Hc ATCC G217B ) 37 ° C'de ekili veya -80 ° C'de dondurulmuş maya stoku bir kısım almak ve PBS ekleyin. Vorteks şiddetle hücreleri ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1100 xg santrifüj. Pellet bozmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın ve taze PBS 10 ml ekleyin. Bu işlemi üç kez tekrarlayın. PBS ve tranfer 50 ml konik tüp 5ml hücrelerin askıya alınması. </li><li> Toplu hücreleri bozmak için, 10 ml şırınga bir Biyogüvenlik kabini (yüz koruması kullanarak) 5 kez şarkı yoluyla maya hücre süspansiyonu 26 G1 / 2 iğne u geçmektedir. Küçük, düzgün ölçekli maya izole etmek için, oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 55 xg'de hücreler santrifüj ve sonra 1 ml kaldırmak. </li><li> 16g / L glikoz, 1g / L glutamik asit 8.4mg / L, sistin 6g / L, glutamik asit ve daha sonra 37 ° hücrelerin büyümesi ile desteklenmiş HAM F12 orta 100 ml (Gibco) içeren bir steril erlen hücre süspansiyonu ° C de 48 saat ile bir kuluçka 150rpm sallayarak. </li></ol> 2. Monoklonal Antikorlar Hibridoma Büyüme ve Arıtma <ol><li> % 10 fetal buzağı serumu,% 10 NCTC,% 1 non-esansiyel amino asitler ve% 1 Penisilin-Streptomisin içeren DMEM orta seçilen hybridomas aktarın. 37 5-7 gün için bir hücre kültürü şişesi (Becton Dickenson) hücrelerin büyümesine ° C /% 5 CO 2. </li><li> Daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika için 1100 xg'de santrifüj ve orta Peletlerin bozmadan tüm süpernatantı toplamak. </li><li> Sonra, bir protein FPLC A / G reçine kullanılarak hücre süpernatant arındırmak. </li><li> MAb konsantrasyonu sonra standart olarak IgG izotip kontrol (Şekil 1B) kullanarak bir yakalama ELISA (1) ile hesaplanabilir. </li></ol> 3 Histoplasma capsulatum İnokulum Hazırlık <ol><li> HAM F-12 orta yetişen 48 saat Histoplasma capsulatum (suşu Hc ATCC G217B) maya faz kültür atın. </li><li> 10 dakika 1100 xg'de hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve taze PBS ekleyin. </li><li> 3.2 işlemi 3 kez tekrarlayın. </li><li> Maya hücre süspansiyonu 5 kez bir şırınga kullanarak 26G1 / 2 iğne yoluyla iletin. </li><li> Süspansiyon pelet kalan hücre kümeleri için 1 dakika için 55 xg'de santrifüjleyin. Yeni bir tüp tek hücre süspansiyonu içeren süpernatant aktarın. </li><li> Hematocytometer kullanarak tek bir hücre süspansiyonu numaralandırılamıyor. </li><li> 1.25 x 10 7 maya (hayatta kalma) veya 5.0 x 10 6 (CFU, sitokinler ve histoloji) suspention &lt;50 mcL (Şekil 2) elde etmek için hücre konsantrasyonu ayarlayın. </li></ol> 4. Mablar intraperitoneal İdaresi <ol><li> Fare kuyruğu ve boynun ense (Şekil 3A) Pick up. Ense, boyun, mümkün olduğunca theears (Şekil 3B ve 3C fare işleme kişi ısırmaya başını cannotturn böylece yeterli cilt aldığınızdan emin olun) yakın olarak fare hareketsiz. </li><li> (Şekil 3B) elin avuç içi hafifçe bastırılır kuyruk withthe küçük parmak sabitleyin. </li><li> Swab, iğne ve enjekte önce kan aramak için aspire yerleştirmeden önce% 70 etanol ile enjeksiyon alanında. </li><li> 26G1 / 2 kullanın, mAb çözüm 500μg (PBS, izotip kontrol antikor veya mAb 1 mL PBS içinde seyreltilmesi, test edilmesi) içeren thelower sol veya sağ alt karın kadranda (intraperitoneal kavite) içine enjekte etmek için cilt ve abdominalmuscles piercethe konum aşağı baş hayvan, iç organlar diyafram andother (Şekil 3E) özen. </li><li> Needleto sızıntı olasılığını azaltmak çekilme öncesinde kısa bir süre bekleyin. </li><li> Bir sonraki adıma geçmeden önce en az bir iki saat bekleyin. </li></ol> 5. Fare Anestezi ve intranazal Enfeksiyonlar <ol><li> 100 mg / Kg ve 10 mg / kg, sırasıyla anestezi ketamin ve ksilizin kullanarak hazırlayın. Intraperitoneal PBS yönetim, izotip kontrol antikoru, ya da eşlik eden yazılı bir protokol açıklandığı gibi deneysel antikor gerçekleştirin. MAb enjeksiyondan sonra fare anestezi ve intranazal enfeksiyon geçmeden önce iki saat bekleyin. 100 mg / Kg ve 10 mg / Kg, sırasıyla (7) anestezi ile ketamin ve ksilizin hazırlayın. </li><li> 2 saat bekleme süresi sırasında, eşlik eden yazılı bir protokol açıklandığı gibi Histoplasma capsulum inokulum hazırlamak. </li><li> 5.5, itens 5.1 göre devam edin. Toe ve refleks yokluğu doğrulamak ve anestezi çalıştı onaylamak için bir cımbız ile hayvanların tutam Anestezi sonra, bir naylon veya pamuk dize hafifçe ön dişleri fare askıya. Hayvanlar askıya almak için dizeleri bağlamak için 2 sütun standları kullanın. </li><li> Mikropipet kullanarak bir farenin solunum hızı yakından izlerken nve içine yavaşça yaklaşık 50 ul inokulum yönetmek. Fare hayvan akciğerlerine (Şekil 3F) maya birikimi kolaylaştırmak için intranazal enfeksiyondan sonra 2-5 dakika bu pozisyonda kalan izin verin. </li><li> Fare enfekte edildikten sonra, gerekirse anestezi kurtarır kadar dikkatle izlenen, sıcak bir ortam (25 ve 37 ° C arasındaki sıcaklık), bir ısı lambası kullanarak, fare korumak. Fare uyanır, yiyecek ve su ad libitum erişim ile temiz bir kafes dönün. Kafeslerde hayvan tesis döndü ve temiz bir hayvan odası (BLSI) tutulur. </li></ol> 6. Survival Çalışmaları <ol><li> , Taşipne, letarji, obtundation, kilo kaybı için, klinik olarak enfekte ve enfekte sahte hayvanların değerlendirin. Hayvanlar laboratuar üyeleri ve Hayvan Bakıcılar tarafından günlük olarak günde iki kez kontrol edilmelidir. </li><li> Fare histoplasmosis, ömrünün sonuna yakın kadar, solunum hızı hafif bir artış dışında enfeksiyon genellikle hiçbir belirgin belirtileri vardır. Ilerlemiş hastalık, genellikle 10-11 gün olur, farelerin, belirgin tachypneic hale gelir ve azalmış aktivite var . Tipik olarak hızla can çekişmekte ve sona erecek. </li><li> Sıkıntılı hayvanlar, özel bir odasında CO 2 uygun ötenazi olmalı, Merhum hayvanların günlük numaralandırılan olmalıdır . </li></ol> 7. CFU Çalışmalar, Histoloji ve Sitokinler Çalışmaları <ol><li> 15 ml konik tüpler tahsil edilecek her organ için 10 ml PBS ile hazırlayın. </li><li> Daha önce gösterildiği gibi bir subletal inuculum (5.0 x 10 6) ile 7 ve 14 gün sonra enfeksiyon hayvanlar Euthanize ve akciğer, dalak ve karaciğer hemen çıkarın. </li><li> Değerlendirilmek üzere organın bir parçasını çıkarın ve formalin gecede fiksasyonu gerçekleştirmek. Bölümleri patolojik değerlendirme için mikroskop altında incelenecektir. </li><li> 5ml PBS ile 50 ml konik tüpler hazırlayın homojenize edilecek her organ için 70 mikron hücre süzgeçler ile tepesinde. Steril 5 ml'lik şırınga pistonunu kullanarak 50 ml tüpler içine organların her biri ayrı ayrı kalan kısmını ıslatarak yumuşatmak. </li><li> Sonraki seri BHI kan agar plakları (2) organ homojenatlarında (1:100, 1:1000 ve 1:5000) ve her seyreltme plaka 100μL sulandırmak. </li><li> (Roche, Almanya) üreticinin talimatlarına göre homojenatlarında proteaz inhibitörü tabletleri ekleyin. </li><li> , ° C - 14 gün ve numaralandırmak CFU kadar 37 ° plakaları inkübe edin. </li><li> 10 dakika 4000xg organ homojenatlarında Santrifüj ve organı süpernatantlar kaldırmak, whish üreticiye göre standart yöntemlerle yapılan sitokin tayinlerde kullanılan kullanılır. </li></ol> 8. H. Karşı Monoklonal Antikor Koruma Capsulatum Antikor Özgünlük ve İzotip Bağımlı. <ol><li> MAb izotip H. karşı koruma kritik capsulatum, Hsp60 için IgG1 veya IgG2a mAb ile tedavi edilen farelerde IgG2b mAb Hsp60 için bir alan fareler veya izotip kontrol mAb veya PBS (Şekil 4) kontrole göre önemli ölçüde uzun süreli sağkalım var. </li><li> Ayrıca, koruyucu mAbs alan farelerde, akciğer ve dalak CFU 7 gün sayısında anlamlı bir azalma vardı ve günde 14 (Şekil 5) akciğerlerde maya sayılar 2 ve 2,5 günlük birimlerinin azalır. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: H. Büyüme capsulatum ve hybridomas. H. elde edilen tek bir koloni (A) Sıvı HAM F-12 kültür hazırlama capsulatum bir BHI kanlı agar plakaları üzerinde büyüdü. (B), hücre kültürü şişeleri ve protein A / G reçine kullanılarak afinite kromatografisi mAb arıtma Hibridoma büyüme. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: H. intranazal enfeksiyon capsulatum inokulum hazırlanması. H. sonra elde edilen hücre süspansiyonu şırınga ve santrifüj capsulatum agrega bozulması bir hemasitometre sayarak numaralandırılmış. Hücre konsantrasyonu 1.25 ayarlanır x 10 7 (hayatta kalma deneyler) veya 5 x 10 &lt;50 mcL 6 (CFU, sitokinler ve histoloji). upload/2532/2532fig3.jpg "alt =" Şekil 3 "/&gt; Şekil 3: mAb yönetimi sırasında Fare taşıma. (A) fare kuyruğu tarafından aldı ve (B ve C) theears için yakın, boynun ense tutarak immobilize. (D) kuyruk küçük parmak ve avuç arasında yapılır. (E) mAb çözüm 26G1 / 2 iğne ile enjekte edilir. (F) H. capsulatum inokulum nve içine yavaşça hücre süspansiyonu pipetleme intranazal yönetilmektedir. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4: Hsp60 için Mablar histoplazmozis patogenezinde değiştirebilir. IgG1 500 mg, ya da IgG2a mAbs 2 saat önce enfeksiyon önemli ölçüde uzun süreli sağkalım (kontrol grubu ile karşılaştırıldığında p &lt;0.05), ancak bir IgG2b mAb ip enjeksiyonları. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5: farelerin 5x10 6 Hc maya seçilen Hsp60 mAbs veya ilgisiz mAb hayvanların tedavi mAbs IgG1 ve IgG2a mantar yükünde azalma gösterdi tedavi ip ile subletal intranazal meydan sonra CFU 7 akciğerlerde tespitler ve 14 gün. Siyah çubuklar gün 7 CFU ve beyaz çubukları temsil eden 14 gün sonrası enfeksiyon (p &lt;0.001 ve 7 gün 14 gün enfeksiyonu ** p &lt;0,001).

<ol><li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li>
<li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li>
</ol>

Burada sunulan protokol mAb H. olduğunu gösteriyor capsulatum deneysel fare histoplazmozis değiştirebilirsiniz. Patojenlerin hücre yüzey antijenleri Mablar bir ana ve bir patojen arasındaki etkileşimi sırasında meydana gelen karmaşık dinamiklerini değiştirebilir. Bu çalışmada, intraperitoneal olarak enjekte görünüz mAbs ölümcül histoplazmozis bir fare modeli koruma arabuluculuk kurar ve aşı geliştirilmesi için aday proteinler, H2B, M antijeni (katalaz yüzey) (3) ve Hsp60 olarak önerir. In vivo olarak, ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Malzeme Adı </th><th> Şirket </th></tr><tr><td> Biyolojik güvenlik kabini (BSL2) </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml konik tüpler </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> HAM F-12 orta </td><td> Gibco </td></tr><tr><td> 37 ° C çalkalayıcı </td><td></td></tr><tr><td> Girdap </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml konik tüpler </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> 26G1 / 2 iğne </td><td> BD </td></tr><tr><td> 10 ml şırınga </td><td> BD </td></tr><tr><td> 250 ml şişeler </td><td></td></tr><tr><td> FPLC (Hızlı protein sıvı kromatografisi) sistemi </td><td> GE Helthcare </td></tr><tr><td> ELISA okuyucu </td><td> BioTek </td></tr><tr><td> Anestezi (ketamin ve Xylazine) </td><td></td></tr><tr><td> Sütun duruyor </td><td></td></tr><tr><td> Naylon dize </td><td></td></tr><tr><td> Isı lambası </td><td></td></tr><tr><td> 70μm hücre Strainer&#39;lar </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> BHI agar plakaları </td><td> Gibco </td></tr></tbody></table>

karşı monoklonal antikorlar pasif yönetim h. capsulatum ve diğerleri fungal patojenler

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Bu metodoloji kullanım amacı bireyleri korumak için mantar Histoplasma capsulatum ve 2) tedavi için hedef olarak virülans faktörleri rol incelemek için neden histoplazmozis önlemek veya tedavi etmek için antikor ya da aşı ile kapasitesini ilerletmek için 1). MAb oluşturmak için, fareler aşı, bağışıklık yanıtlarını laboratuvarda geliştirilen bir katı faz ELISA sistemi kullanılarak değerlendirilir ve en iyi cevaplayıcı fareler hibridoma hücreleri ile füzyon için splenositlerin izolasyonu için seçilir. C57BL / 6 farelerin yoğun H. incelemek için kullanılan capsulatum patogenezi ve gerekli verileri elde etmek için en iyi modeli sağlamak. Enfeksiyon mAbs rolünü değerlendirmek amacıyla, fareler H. mAb ya intraperitoneal yolla capsulatum veya izotip ya intravenöz (iv), intraperitoneal (ip), ya da burun içi (in) yolları kontrolü mAb eşlemeli ve daha sonra enfekte . Bilimsel literatürde, farelerde mantar enfeksiyonları için mAbs etkinliği önceki zaman noktalarında koloni formin birim (CFU) değerlendirmeler ile birlikte, bir uç nokta olarak mortalite üzerine dayanır. En iyi insan hastalığı temsil Survival (ölüm) çalışmaları gereklidir. Böylece, bizim müdahale etkinliği yeterince sağkalım eğrileri olmadan kurulacak olmaz. Bu aşının etkinliği veya virülans için mutantlar test kurulması için de geçerlidir. Histoplazmozis, fareler genellikle birkaç saat içinde ölü enerjik olmak gidin. MAb idaresi gibi bir müdahale kapasitesi başlangıçta bir hayvan hastalığı korumak olabilir, ancak hastalığın nüks kısa CFU deneyler gerçekleştirilecek olmaz hangi. Hayatta kalma ve fungal yük testleri yanı sıra, enfeksiyon (histoloji, hücresel işe alım, sitokin yanıtları) inflamatuar yanıtları inceleyin. Farelerin hayatta kalma / ölüm deneylere zaman için, morbidite belirtileri için günde en az iki kez enfekte olan ve takip edilmektedir. Fungal yükü, histopatoloji ve sitokin yanıtları değerlendirmek için, farelerin enfeksiyondan sonra çeşitli zamanlarda ötenazi. Hayvan deneyleri Albert Einstein College of Medicine Hayvan Araştırmaları Enstitüsü&#39;nün kurallarına göre yapılır.

C57BL / 6 farelerinde Hc patogenezinde çalışma ve en iyi model sağlamak için kullanılmaktadır. Biz bu mantara karşı sıvısal bağışıklığın potansiyel yararları keşfetmek ve histon H2B ve ısı şoku proteini 60kDa] üretilen çeşitli mAbs intraperitoneal uygulamadan sonra koruyucu etkinlik için test ettiğim.

Karşı Monoklonal Antikorlar Pasif Yönetim H. capsulatum Ve Diğerleri Fungal Patojenler

Bu metodolojinin kullanım amacına şunlar dahildir: 1) ... önlemek veya tedavi etmek amacıyla antikor veya aşı ile bireyleri koruma kapasitemizi geliştirmek...

Bu prosedürün genel amacı, histoplazmozun önlenmesi veya tedavisi için antikorlar veya aşılar ile bireyleri koruma kapasitemizi geliştirmek ve virülans faktörlerinin hastalık patogenezindeki rolünü incelemektir. Bu işlem, öncelikle hedef antijenlere yönelik monoklonal antikorların izole edilmesi ve karakterize edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, seçilen monoklonal antikorların, intranazal enfeksiyondan iki saat önce intraperitoneal olarak uygulanmasıdır.Bu moleküllerin vücuda yayılması için zaman tanımanız amacıyla, prosedürün üçüncü adımı fareleri anestezi altına almak ve istenilen inokulumla intranazal olarak enfekte etmektir. Prosedürün son adımı ise hayvanların sağlık durumunu izlemektir. Hayvanlar, fungal yükleri belirlemek ve inflamatuar yanıtları değerlendirmek için çeşitli aralıklarla ya ötanize edilir ya da sağkalım için takip edilirler.Nihayetinde, ölümcül şekilde enfekte edilmiş farelerin etkilenen organlarında patolojik yanıtların modifikasyonunu ve sağkalım süresinde uzamayı gösteren sonuçlar elde edilebilir. Koruyucu monoklonal antikorların enfeksiyondan önce peritonal yolla uygulanmasıyla gerçekleştirilen bu prosedür, fungal patogenez ve hayvan enfeksiyon modelleri konusunda kapsamlı deneyime sahip bir doktora sonrası araştırmacı olan Ally Emer tarafından gösterilecektir. Bu tekniğin antifungal ilaçlar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, monoklonal antikorların konakçı potansiyel faktörünün etkileşimi yoluyla çalışan spesifik özelliklere sahip moleküller olmasıdır. Hastalığa verilen yanıtın ve bu yöntemin görsel demonstrasyonun kritik önem taşır.Monoklonal antikor uygulaması ve intranazal enfeksiyon basamakları, hayvanların idaresinde uzmanlık gerektirdiği için öğrenilmesi zordur. Mantarın maya formundaki çalışmaları için biyogüvenlik seviyesi iki kabini, önce çamaşır suyu ile temizleyip ardından UV ışınlaması yaparak hazırlayın. 5 mL PBS içeren 15 mililitrelik konik bir tüp hazırlayın.-80 °C'de dondurulmuş stok alikotundan bir H caps AUM kolonisi hasat edin ve PBS vorteksine ekleyin. Hücreleri kuvvetlice vorteksleyin ve 1100 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, peleti rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve en az 10 mL taze PBS ekleyin.Son yıkamadan sonra bu prosedürü üç kez tekrarlayın. Hücreleri beş mililitre PBS içinde yeniden süspande edin. Tüm yıkama işlemleri oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. Agregat oluşturmuş hücreleri dağıtmak için, maya hücrelerini 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak 26 gauge yarım iğneden beş kez geçirin ve maya hücrelerini 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın.Küçük ve tek tip boyutta maya izole etmek için, hücreleri 55 ×g hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından üstteki 1 mL kısmı alın. Hücre süspansiyonunu 100 mL ham, F 12 besiyeri içeren steril 250 mL'lik cam erlenmeyer flaskına ekleyin ve ardından hücreleri oda karbondioksit konsantrasyonunda, çalkalamalı bir inkübatörde 37 °C'de 48 saat boyunca büyütün. Bu kültür, inokülüm hazırlamak için kullanılacak ve bir sonraki adımda üretilen monoklonal antikorların etkinliği değerlendirilecektir.Seçilen hibridomaları beş ila yedi günlük inkübasyondan sonra DMEM içinde büyütün. Hücre kültürü balonundaki tüm medyumları toplayarak antikorları hasat edin ve ardından medyumu 1100 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Maya hücrelerinde olduğu gibi, antikorlar oda sıcaklığında yıkanabilir.Peletleri bozmadan süpernatantı toplayın. Ardından, hücre içermeyen süpernatantı, F-P-L-C-A yakalama yöntemiyle bir protein AG reçinesi kullanarak saflaştırın. Saflaştırılan antikorun ne kadarının enjekte edilmesi gerektiğini belirlemek amacıyla monoklonal antikor konsantrasyonunu hesaplamak için Eli SA kullanılır.Eşlik eden yazılı protokolde açıklandığı şekilde, PBS İzotip kontrol antikoru veya deneysel antikoru intraperitoneal olarak uygulayın. Monoklonal antikor enjeksiyonundan sonra, fareyi anestezi altına almadan ve intranazal enfeksiyona geçmeden önce iki saat bekleyin; bekleme süresi boyunca intranazal enfeksiyon hazırlıklarını yapın. Eşlik eden yazılı protokolde açıklandığı şekilde histoplasma capsulatum inokulumunu hazırlayın ve iki kolon standı arasına naylon veya pamuklu bir ipi sıkıca bağlayıp ardından ip gergin hale gelene kadar standları ayırarak farenin enfeksiyonu için ip düzeneğini kurun.Anestezi için kilogram başına 100 miligram ketamin ve kilogram başına 10 miligram ksilazin kullanılır. Antikorların yayılması için yeterli süre geçtikten sonra bu hazırlık yapılabilir. Fareyi anesteziye alın ve parmak ucuna verilen uyaranlara yanıt vermediğini kontrol ederek sedasyonu onaylayın.Cımbızla tutun. Fareyi ön dişlerinden nazikçe ipe asın. Bir mikropipet kullanarak hava yoluyla yaklaşık 50 µL inokülümü yavaşça uygulayın.Farelerin solunum hızı yakından izlenirken, intranazal enfeksiyon sonrası mayanın hayvanın akciğerlerine çökelmesini kolaylaştırmak için farelerin bu pozisyonda iki ila beş dakika dinlenmesine izin verin. Fareler anesteziden çıkana kadar, gerekirse bir ısıtıcı lamba kullanarak dikkatli bir şekilde, kontrollü ve sıcak bir ortamda tutun.Fare uyandığında onu temiz bir kafese geri yerleştirin. Yiyecek ve suya serbest erişim (ad libitum) sağlayarak, enfekte ve yalancı enfekte hayvanları klinik olarak değerlendirin. Takipne, letarji düzeyi ve kilo kaybı açısından hayvanlar, laboratuvar üyeleri tarafından günde iki kez ve hayvan bakıcıları tarafından günde bir kez kontrol edilmelidir.Ömrünün sonuna kadar süren kronik histoplazmozda, solunum hızındaki hafif bir artış dışında tipik olarak enfeksiyona dair belirgin bir belirti görülmez. Hastalık ilerledikçe, farelerin kilosunda belirgin bir azalma meydana gelir ve aktiviteleri düşer. Genellikle hızla daha halsiz hale gelirler ve ölürler.Stres altındaki hayvanlar, özel bir hazne içerisinde karbondioksit ile uygun şekilde ötanize edilmelidir. Parmak sıkıştırma yöntemine karşı refleks yanıtının olmamasıyla ölüm onaylanmış ve ötanize edilmiş hayvanlar günlük olarak sayılmalıdır.Toplanacak her organ için 10 mL PBS içeren 15 mL'lik konik tüpler hazırlayın. 5x10⁶ subletal inokülum ile enfekte edilen hayvanları, önceden gösterildiği şekilde ötanize edin ve akciğerleri, dalakları ve karaciğerleri çıkarın; hemen ardından 5 mL PBS içeren 50 mL'lik konik tüpler hazırlayın.Homojenize edilecek her organ için 70 mikron hücre süzgeçleri içeren bir Petri kabı hazırlayın. Her organı beş mililitrelik pistonlarla ayrı ayrı macere edin ve 50 mililitrelik tüplere aktarın. Ardından, organ homojenatını sırasıyla 1:100, 1:1000 ve 1:5.000 oranlarında üç farklı dilüsyonda seyreltin ve BHI üzerine 100 µL ekleyin.Kanlı agar plaklarını, normal oda karbondioksit yüzdesine sahip bir inkübatörde 37 °C'de 14 güne kadar inkübe edin ve monoklonal antikor CFU'larını sayın. İzotip, hcap'lere karşı korumada kritiktir; çünkü HSP 60'a karşı IgG1 veya IgG2a monoklonal antikorlarla tedavi edilen fareler, HSP 60'a karşı IgG2b monoklonal antikor veya bir izotip kontrol monoklonal antikoru ya da PBS alan kontrol farelerine kıyasla anlamlı derecede uzamış bir sağkalım göstermiştir. Ayrıca, koruyucu monoklonal antikorlar alan farelerde, yedinci günde pulmoner ve splenik CFU sayısında anlamlı bir azalma ve 14. günde akciğerlerdeki maya sayılarında 2 ve 2,5 log birimlik düşüşler saptanmıştır. Bu prosedürün ardından, antikorların hastalık modifikasyonuna yönelik etki mekanizmasını tanımlamak gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, koloni oluşturan birimlerin göstergesi olan fungal yükün belirlenmesi, enfeksiyonda rol oynayan sitokinlerin analizi ve topolojinin değerlendirilmesi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Knock-on ile çalışırken biyolojik güvenlik koşullarında çalışmaya ve intranazal enfeksiyonlar için hayvan bakım düzenlemelerine uygun hareket etmeye dikkat etmek önemlidir.

passive-administration-monoclonal-antibodies-against-h-capsulatum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

DA sıçanlarda kronik relapsing deneysel otoimmün ensefalomyelit: Bu video, multipl skleroz bir hayvan modeli indüksiyonu ve klinik skorlama göstermektedir. Tüm sıçan omurilik ve tam Freund adjuvan içeren bir emülsiyon immunizing fareler tarafından uyarılan hastalık, insan hastalığına benzer klinik belirtiler sunar.

İndüksiyon ve Kronik Relaps Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis Klinik Puanlama

Bazı fare suşlar miyelin temel protein olan deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) indüksiyon karşı edebiliyoruz. Burada anlatılan yanıtsızlık tersine çevirir ve birkaç tipik EAE dirençli fare lekeler paralitik hastalığın neden basit bir bağışıklama protokoldür.

Kabul edilmiş Transfer ve antijenik Challenge Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis (EAE) Dayanıklı Fare Suşlarında yanıtsızlık Aşmak

Bu video, bir murin modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyeliti (EAE) indüklemek için bir antijen adjuvan emülsiyonu oluşturmak için etkili bir homojenizasyon tekniğini göstermektedir. Emülsiyon, inaktive edilmiş bir patojenik bakteri içeren sürekli bir yağ fazı ile çevrili su fazında bir otoantijen - miyelin oligodendrosit glikoproteini (MOG) içerir. Emülsiyon, uzun süreli bir bağışıklık tepkisi için sürekli bir antijen salınımı sağlar.

Otoimmün ensefalomiyeliti indüklemek için bir antijen adjuvan emülsiyonunun hazırlanması

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), çoklu skleroz kurulmuş bir hayvan modelidir. C57BL / 6 fareleri, merkezi sinir sistemi otoreaktif bağışıklık hücreleri tarafından neden olduğu artan gevşek felce neden, miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) peptit 35-55 (MOG 35-55) ile immünize edilir. Hastalığın başlama ve izleme için protokoller tartışılacaktır.

Miyelin Oligodendrosit Glikoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) C57BL / 6 Farelerde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit (EAE) Bağlı

Hidoma teknolojisine dayalı monoklonal antikorların üretilmesi için optimize edilmiş bir protokol sunulmuştur. Fareler bir immünokonjugat ile aşılandı. Dalak hücreleri, PEG ve ölümsüz miyelom hücreleri ile bir elektrik darbesi ile kaynaştırıldı. Antikor üreten hibridoma hücreleri HAT ve antijene özgü ELISA taraması ile seçildi.

Hibridoma teknolojisi ile murin monoklonal antikorlar üretilmesi

Bu makale hazırlanması ve doğal ürünler kullanmak üzere çeşitli uzun karşı Monoklonal antikor değerlendirilmesi için detaylı bir protokol sağlar. Bu yordam bağışıklama, hücre füzyon, dolaylı rekabet ELISA olumlu klon eleme ve monoklonal Hibridoma hazırlık için içerir. Antikor karakterizasyonu MALDI-TOF-MS ve ELISA analizleri kullanarak spesifikasyonları da temin edilmektedir.

Doğal ürünler karşı monoklonal antikorların üretimi

Bu el yazması farelerde aktif deneysel deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indüklemek için bir protokol sunar. Merkezi sinir sisteminde (CNS) infiltrasyon lenfositlerin izolasyon ve karakterizasyonu için bir yöntem de lenfositler CNS otoimmün hastalığın gelişiminde nasıl rol olduğunu göstermek için sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Merkezi Sinir Sisteminde Lenfosit Infiltrasyonunun Akış Sitometrik Analizi

Bu protokol, farelerde Astarlı Mikobakteriyel Üveit'i (PMU) indükleme adımlarını özetlemektedir. Bu yöntem, fare modeli sisteminde güvenilir ve sağlam oküler inflamasyon üretmeye yardımcı olacak adımları özetlemektedir. Bu protokolü kullanarak, immünolojik, transkriptomik ve proteomik tahlillerle daha ileri değerlendirme için tek hayvanlardan uveitik gözler ve iltihapsız diğer gözler ürettik.

Post-Enfeksiyöz Üveit için Bir Model Olarak Astarlanmış Mikobakteriyel Üveit (PMU)

Multipl sklerozun bir hayvan modeli olan deneysel otoimmün ensefalomiyeliti indüklemek için, fareler bir otoantijen ve Freund'un adjuvanını tamamlayan bir yağda su emülsiyonu ile bağışıklanır. Bu emülsiyonların hazırlanması için çeşitli protokoller mevcut olsa da, emülsiyon hazırlığı için hızlı, basit ve standartlaştırılmış bir homojenizasyon protokolü burada sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyeliti İndüklemek için Antijen/Adjuvan Emülsiyonlar Hazırlamak için Hızlı, Basit ve Standartlaştırılmış Bir Homojenizasyon Yöntemi

Burada, C57BL/6 farelerde deneysel otoimmün ensefalomiyeliti aktif olarak indüklemek için alternatif bir protokol sunuyoruz, ısıyla öldürülen Mycobacterium avium alt türü paratüberkülozu içeren tamamlanmamış Freund adjuvanında asılı duran immünojenik epitop miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG)35-55'i kullanıyoruz.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Otoantijenlerin İmmünojenitesinin Arttırılmasında Mycobacterium Paratuberculosis'in Adjuvan Aktivitesi

Fareler genellikle Mycobacterium abscessus enfeksiyonlarına karşı dirençlidir, bu da akciğer enfeksiyonlarına karşı çok ihtiyaç duyulan antibiyotiklerin keşfedilmesini ve geliştirilmesini zorlaştırır. Burada, immünokompetan farelerde sürekli enfeksiyon sağladığı gösterilen bir aşı hazırlama ve intratrakeal enfeksiyon yöntemini açıklıyoruz.

İmmünkompetan Fareleri İntratrakeal Olarak Aşılamak için Agar Boncuğu Gömülü Mycobacterium abscessus'un Hazırlanması

Öğrenin Histoplasma capsulatum'a karşı monoklonal antikorların koruyucu etkinliğini fare modelinde nasıl değerlendirirsiniz. Bu yöntem humoral bağışıklık ve fungal patogenez araştırmalarında önemli bilgiler sunar.

Karşı Monoklonal Antikorlar Pasif Yönetim H. capsulatum Ve Diğerleri Fungal Patojenler

Daha fazla video keşfet