Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Bu prosedürün genel amacı, çok sayıda insan NK hücresini hızla çoğaltmaktır. Ex vivo aşamaya, buffy coat veya tam kan örneğinden p BMC'lerin veya NK hücrelerinin izole edilmesiyle başlanır. Ardından, NK hücresi ekspansiyonunda pbmc'ler yapay antijen sunan hücrelerle birlikte kültürlenir.

Haftalık aPCs stimülasyonları ile NK hücre kültürleri üç hafta boyunca IL-2 takviyeli besiyerinde, NK hücre sayısının mililitre başına 1×10⁶'nın altında tutulmasına dikkat edilerek sürdürülür. Genişletilen NK hücrelerinin fonksiyonel etkinliği, radyoaktif olmayan bir sitotoksisite testi kullanılarak doğrulanır. Bu genişletme şemasıyla elde edilen tipik bir NK hücresi verimi, 21 günün sonunda, kalsiyum salınım testi ile belirlendiği üzere çeşitli tümörlere karşı yüksek sitotoksisiteye sahip NK hücrelerinin medyan 21.000 kat genişlemesiyle sonuçlanır.

NK hücrelerinin büyük miktarlarda elde edilmesi tarihsel olarak çok zor olduğu için, bu tıbbi yöntem NK hücresi biyolojisi alanındaki temel bir sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin, insan kanserinin immünoterapisi üzerinde etkileri vardır çünkü bu tür bir terapi için yeterli NK hücresi üretmek tarihsel olarak çok zordur. Bu tekniği, laboratuvarımın kıdemli araştırma asistanı Cecily, sağlıklı donörlerden kan yoluyla PBMC'leri elde ederek gösterecektir.

Genellikle kaynak olarak kan bankası Buffy coat kullanılır. İlk olarak, Buffy coat hacmini 140 mililitreye ayarlamak için PBS ekleyin. Ardından, gradiyent ayırma santrifüjü için 15 mililitre fial PA üzerine 35 mililitre numune katmanı ekleyip 400 G'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin.

Kırma işlemi yapmadan. P BMC'lerini Fial PA plazma ara yüzeyinden dikkatlice geri kazanın ve RBC tüpünü daha sonra kullanmak üzere kenara ayırın. P BMC'lerini, her seferinde 10 dakika boyunca 400 G'de santrifüj ederek PBS ile üç kez yıkayın.

NK hücre ekspansiyonu için P BMC'lerin bu fraksiyonunu kullanın. Şimdi gradyan tüpüne geri dönün. Üst fazı aspire ederek uzaklaştırın.

RBC'leri iki adet 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve 50 mililitre işaretine kadar PBS ekleyerek yıkayın. Santrifüjden sonra, RBC tabakasının üzerinden sıyırma yöntemiyle süpernatantı aspire edin. Bu işlem granülositleri uzaklaştırmak içindir.

Üç kez yıkama işlemi gerçekleştirin, ardından RBC'leri eşit hacimde else çözeltisi içinde yeniden süspande edin ve dört santigrat derecede bir aya kadar saklayın. Bu RBC fraksiyonu, iki haftalık ekspansiyonun sonunda NK hücrelerinin roset SEP saflaştırması için kullanılabilir. Fonksiyonel NK hücrelerini ex vivo ortamda verimli bir şekilde ekspande etmek için, bundan sonra K 5 62 olarak adlandırılacak olan, membranla bağlı IL 21 içeren K 5 62 klon dokuz hücreleri kullanılır.

Yapay bir antijen sunan hücre olarak K562 klon dokuz IL-21 hücreleri kullanılır; önce PBMC'leri sayın ve her bir NK hücresi ekspansiyonu için ekilecek 5 × 10⁶ hücreye karşılık gelen hacmi hesaplayın. 5 × 10⁶ PBMC sayımı için 10 × 10⁶ K562 klon dokuz IL-21 hücresini ışınlayın. Gamma ışınlayıcı kullanarak 100 Gy dozunda ışınlanan hücreler, gelecekte kullanmak üzere dondurulabilir. Şimdi, önceden ışınlanmış hücreleri PBS ile yıkayın ve NK hücresi ekspansiyon medyumunda yeniden süspande edin.

Şimdi, 40 ml NK hücresi ekspansiyon medyumunda, ışınlanmış hücreler ile pbmc'leri ikiye bir oranında ekleyin ve T 75 flaskını 37 °C ve %5 CO2 sıcaklığındaki bir inkübatöre dik konumda yerleştirin. Üçüncü günde, stimüle edilmiş hücreleri 400 ×g'de beş dakika santrifüj ederek geri kazanın, medyumun yarısını taze NKEM ile değiştirin ve kültüre devam edin. Beşinci günde medyum değişimini tekrarlayın. Bir haftanın sonunda hücre sayısını belirleyin ve akış sitometrisi ile fenotipleme yapmak üzere 5 × 10⁵ hücre ayırın; ikinci stimülasyon için K 5 62 hücrelerini bire bir oranda sayın ve ışınlayın.

Hücreleri genişletmek için dokuz IL 21 hücresini klonlayın ve ardından hücreleri, mililitrede toplam 2.5 × 10⁵ hücre olacak şekilde NK hücresi genişletme medyumunda birleştirin. Hücreleri T 75 flasklarda inkübe edin ve kültürlemeye devam edin; 10. ve 12. günlerde hücreleri, mililitrede 2.5 × 10⁵ hücre olacak şekilde NK hücresi genişletme medyumunda pasajlayın. Genişletmenin 14. gününde hücreleri tekrar sayın ve bir örneğin fenotiplemesini akış sitometrisi ile gerçekleştirin.

PBMC kaynaklı bu hücre ekspansiyonunu rozet SEP saflaştırma protokolünü kullanarak saflaştırın ve NK hücrelerinin saflığını akış sitometrisi fenotiplendirmesi ile doğrulayın. Saflaştırılmış NK hücreleri üzerinde, ışınlanmış K 5 62 klon dokuz IL 21 hücreleri ile bire bir oranında üçüncü bir stimülasyon gerçekleştirin. Son olarak 21. günde, amplifiye edilmiş NK hücrelerini tam bir fenotiplendirme antikor paneli kullanarak akış sitometrisi ile analiz edin.

Hücre stoklarını, %10 DMSO içeren FBS içinde, flakon başına maksimum 5x10⁷ hücre yoğunluğunda dondurun. Sitotoksisite testi için taze veya dondurulmuş NK hücreleri kullanın. Dondurulmuş NK hücreleri kullanılıyorsa, önce NK hücresi flakonunu çözün ve hücrelerin toparlanması için test gününde 24 saat boyunca NKEM içerisinde ekim yapın; 10⁶ hedef hücreyi, kalsiyum am içeren 1 ml NKEM içinde yeniden süspande edin ve ara ara çalkalayarak 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin; U-tabanlı 96 kuyucuklu plakaya, 1x10⁶ hücre/ml yoğunluğunda süspande edilmiş NK hücrelerinden üç tekrarlı olarak 200 µL ekleyin ve hücrelerin seri dilüsyonunu belirtildiği şekilde gerçekleştirin.

Bir saatlik kalsiyum yüklemesinin ardından, hedef hücreleri NK hücresi ekspansiyon besiyerinde iki kez 400 G'de beş dakika santrifüj ederek yıkayın. Şimdi hedef hücreleri yeniden sayın ve mililitre başına 1 × 10⁵ hücre olacak şekilde resüspande edin. 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 100 µL hedef hücre ekleyin ve hücre temasını başlatmak için 100 G'de bir dakika santrifüjleyin; ardından 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında dört saat inkübe edin.

Salınan kalsiyumu homojen şekilde süspande etmek için, pellet hücreleri beş dakika boyunca 100 G'de pipetleme yöntemiyle nazikçe karıştırın ve süpernatantın 100 microliters kısmını yeni bir düz tabanlı 96 kuyucuklu plakaya aktarın; bunu yaparken hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin ve gerekirse oluşan kabarcıkları ince bir iğne yardımıyla patlatın. Plakayı, eksitasyon filtresi 485 nanometers ve emisyon filtresi 530 nanometers olarak ayarlanmış bir floresan plaka okuyucu kullanarak okuyun.

Yüzde spesifik lizis değerini hesaplayın. Tipik olarak, buffy coat'tan izole edilen 5x10⁶ PBMC'nin ekspansiyonu, 1x10⁹ ile 10¹⁰ arasında NK hücresi sağlar; ekspande edilen NK hücreleri, buffy coat'taki ekspande edilmemiş primer NK hücreleri ile karşılaştırılabilir düzeyde çeşitli NK hücresi reseptörleri eksprese eder.

14. günde NK hücreleri, pbmc'nin %2 ila %18'ini oluşturabilir. Genişletilmiş hücrelerin Rozet SEP saflaştırması, CD3 negatif CD56 pozitif hücreler ile %99'luk bir NK hücresi saflığında, kültürde bulunan NK hücrelerinin %40 ila %70'ini geri kazanabilir. Genişletilmiş NK hücreleri; nöroblastoma, AML, osteosarkom ve melanoma dahil olmak üzere bir dizi tümör hücre hattına karşı sitotoksisite göstermiştir.

Burada temsili A ML öldürmesi, yüzde spesifik lizis olarak gösterilmiştir. Canlı BIOT videosu, kalsiyum am ile yüklenmiş nöroblastoma hücre hattı CHP 1 34'ün NK hücreleri tarafından öldürülmesini göstermektedir. Bu prosedürden sonra, NK hücrelerinin fonksiyonlarına ilişkin ek soruları yanıtlamak için NK hücreleri tarafından sitokin üretimi analizi ve hayvan tümör modellerinde adaptif transfer gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, çok sayıda NK hücresinin nasıl genişletileceği ve saflaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu işlem, doğrudan periferik kan mononükleer hücrelerinden gerçekleştirilip ardından NK hücreleri saflaştırılabileceği gibi, rozet yöntemiyle saflaştırılmış NK hücreleri kullanılarak da başlatılabilir. Başlangıçta, tipik bir buffy coat 15 ila 40 milyon arasında NK hücresi sağlayacaktır ve bunların tamamı, bu yöntemde açıklanan şema kullanılarak çok yüksek sayıda NK hücresi genişletmek için kullanılabilir.