Name: Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Öğrenin, insan NK hücrelerini genişletme ve saflaştırma yöntemini. Yapay antijen sunan hücreler ve IL-2 kullanılarak 21 günde 21.000 kat büyüme sağlanır. Bu teknik, kanser immünoterapisi için fonksiyonel NK hücreleri üretmeyi mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar ilk K562 aAPC ve mIL21 füzyon vektörler oluşturmak Laurence Cooper, Harjeet Singh ve Lenka Hurton çalışmaları için teşekkür etmek istiyorum. UT MD Anderson Doktor Bilim Adamı Programı, St. Baldrick Vakfı ve Friendswood Legends tarafından bu iş için finansman sağlanmıştır.

1. Buffy Coat PBMC'ler izolasyonu Periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) leukapheresis tarafından elde edilen sağlıklı donör buffy coat örnekleri Ficoll-Paque batmaz yoğunluğu santrifüj ile elde edilir. <ol><li> Ficoll Paque santrifüj başına çok küçük değişiklikler yaparak üreticinin protokolü olarak yapılır. </li><li> Son hacim 140 mL (tipik buffy coat hacmi 40-70 ml) bir kan bankası buffy coat normal bir donör PBS ekle. </li><li> Katman buffy coat örnek 35 ml Ficoll-Paque (4 tüpler) 15 ml. </li><li> Frensiz 20 dakika 400g santrifüjleyin. </li><li> Ficoll-Paque PBMC'ler Kurtar: plazma arayüzü, Ficoll-Paque altındaki eritrositlerde atmayın. </li><li> PBMC'ler 400g her zaman 10 dakika boyunca santrifüj, PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> PBMC'ler RosetteSep tarafından izole edilebilir (Bölüm 4) bu aşamada NK hücre genişlemesi veya NK hücreleri için doğrudan kullanılmamalıdır. </li><li> Kalan PBMC'ler sıvı nitrojen içinde% 10 DMSO içeren FBS donmuş olabilir. </li><li> Ficoll aspire ve iki adet 50 ml santrifüj tüpüne adım 5 kırmızı kan hücreleri toplamak, (50 ml işareti eklendi) PBS ile üç defa yıkamak, her defasında RBC tabakasının üst granülositler kaldırmak için supernatant kaymağını aspirat. </li><li> Eritrositlerde hemen NK hücreleri RosetteSep  arıtma (bakınız Bölüm 4) için kullanılan ya da 4 Alsever çözümü eşit hacmi saklanabilir ° C (eritrositler daha sonra kullanmak üzere en fazla 4 hafta bir mağaza olabilir). </li></ol> 2. NK hücre genişletme NK hücre genişleme PBMC'ler kullanarak veya NK hücreleri saflaştırılmış başlatılabilir. Genişlemesi için kullanılan PBMC'ler miktarı, üç hafta genişleme sonunda istenen NK hücreleri miktarına göre değişik olabilir, ayrıntılı bilgi için temsilcisi sonuç bölümüne bakın. (Bkz. Not 1) UYARIM 1 Gün 0 <ol><li> Genişletilecek her 5x10 6 PBMC'ler için, sayım ve 100 Gy gama ışınlama kullanılarak 10x10 6 K562 CL9 mIL21 ışın tedavisi. </li><li> Mesaj ışınlama hücreleri, NK hücre genişlemesi medya (NKEM) PBS ve tekrar süspansiyon ile yıkayın. </li><li> 10x10 6 ışınlanmış K562 CL9 T75 balonuna 40 ml NKEM mIL21 (1:2 oranı) ve 37 ° dik bir kuluçka yerleştirin ° C ve% 5 CO 2 ile Tohum 5x10 6 PBMC'ler </li></ol> Gün 3 ve 5 <ol start="4"><li> 400g az 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri kurtarır ve taze NKEM medya yarısını yerine (tüm medya hacmi için taze IL2 ekleyerek) ve kültür devam ediyor. </li></ol> UYARIM 2 7. Gün <ol><li> Bir hafta sonunda kültür hücrelerinin sayısını sayın. </li><li> Flow sitometri fenotipleme için 5x10 5 hücre (Not 2) bir kenara </li><li> Restimulated her 5x10 6 hücre için, sayım ve 100 Gy gama ışınlama kullanarak 5x10 6 K562 CL9 mIL21 ışın tedavisi. </li><li> (Bkz. Not 3), 2.5x10 5 toplam hücre / ml NKEM ışınlanmış K562 CL9 mIL21 (1:1 oranı) ve tekrar süspansiyon eşit sayıda ekleyin . </li><li> T75 şişeler tohum hücreleri (şişeyi başına maksimum 50 ml). </li></ol> 10 ve 12 Gün <ol start="6"><li> Hücre sayısını. </li><li> (Not 3), hücre sayıları dayalı taze NKEM ile tüm medya değiştirin. </li></ol> 14. Gün <ol start="8"><li> Genişleme iki hafta sonunda kültür hücrelerin sayısını. </li><li> Flow sitometri fenotipleme için 5x10 5 hücre (Not 2) bir kenara </li><li> NK hücreleri, genişleme PBMC'ler başladı genişleme RosetteSep arıtma protokolü (bakınız Bölüm IV) kullanarak bu aşamada arındırılmalıdır. Stimülasyon 3 geçin NK hücreleri saflaştırılmış genişleme başladı. </li><li> NK hücreleri (Adım 8) saflığını doğrulamak için flow sitometri fenotipleme için arıtma kenara 5x10 5 hücre ayarladıktan sonra. </li><li> Uyarım 3 arıtılmış NK hücreleri (Not 4) ile devam edin. </li></ol> UYARIM 3 <ol><li> NK hücreleri, hücre sayıları dayalı NKEM ışınlanmış K562 CL9 mIL21 (1:1 oranı) (Not 3) ile yeniden süspanse. </li></ol> 17 ve 19 Gün <ol start="2"><li> Hücre sayısını. </li><li> (Not 3) hücre sayıları dayalı taze NKEM ortam değiştirin. </li></ol> 21. gün <ol start="4"><li> Genişleme üç hafta sonunda kültür hücrelerin sayısını. </li><li> Recover tam NK hücre fenotipleme antikor panel için flow sitometri analizi için 1x10 6 hücre (Bakınız Tablo 1). </li><li> Ileride kullanmak üzere flakon başına 5x10 7 hücre maksimum yoğunluğu% 10 DMSO içeren FBS hücrelerin dondurun. </li></ol> 3. NK Hücre Sitotoksisite Testi <ol><li> NKEM NK hücreleri ve tohum bir flakon, pe önce bir gün Çözülmekurtarma izin sitotoksisite testinde rforming. </li><li> (Not 5) tek bir hedef hücre hattı, 6x10 5. NK hücreleri ve 3x10 5 hedef hücreleri kullanarak her NK hücre sitotoksisite testi için gereklidir. </li><li> NKEM Calcein-AM (1 DMSO mg / ml stok) (Not 6) seyreltilmesi CAM-Media hazırlayın. </li><li> (Bakınız Not 7) CAM-medya 1 ml 10 6 hedef hücreleri tekrar </li><li> Arada sırada sallayarak, 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. </li><li> Yeniden süspanse NK, 1x10 6 hücre / mL hücre ve NK hücre süspansiyonu her bir U-bottom 3 kuyu 200uL eklemek 96-plaka ilgili to10: 1 D: Şekil 1'de gösterildiği gibi T oranı . (Not 8) </li><li> "Maksimum" dışında kalan tüm kuyular tam bir medya 100uL ekleyin. </li><li> "Maksimum" 100uL 2% Triton X-100 ekleyin. </li><li> 5 sonraki E NK hücreleri seri dilüsyonları yapın: her seferinde hücre 100uL aktararak T oranları, iyice karıştırın. Son kuyuları (0.3125:1, T oranı E) 100uL atın. </li><li> Calcein yükleme 1 saat sonra, 1200 rpm'de 5 dakika için santrifüj, iki kez NKEM hedef hücreleri yıkayın. (Not 9) </li><li> 1x10 5 hücre / mL hedef hücreleri ve tekrar süspansiyon yeniden saymak. </li><li> (1x10 4 / iyi) her bir kuyu için hedef hücrelerin 100 mcL ekleyin. Hücre temas başlatmak için 100g az 1 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> 37 ° ° C'de ve% 5 CO 2 4 saat. </li><li> Kültür düzgün yayımlanan Calcein askıya için 100 mcL pipetter pipetleme hafifçe karıştırın, pelet hücreleri 5 dakika 100g plaka aşağı spin ve kabarcıkları önlemek için özen yeni bir plaka süpernatantı 100 mcL transfer. Ince bir iğne kullanarak formu herhangi bir kabarcıklar pop. </li><li> Floresan plaka okuyucu (eksitasyon filtresi 485 nm, emisyon filtresi 530 nm) kullanarak plaka okuyun. Alt okumanız önerilir. </li><li> X 100 - [/ (test sürüm spontan sürümü) (kendiliğinden serbest maksimum sürüm)] formülü göre hesaplayın Yüzde Özel Lizis. </li></ol> 4. RosetteSep tarafından NK Hücre Arıtma <ol><li> (RBC: PBMC 100:1) 50 ml tüp içine PBMC veya genişletilmiş hücreleri ile eritrositlerde 100 kat daha fazla alın. </li><li> Kullanarak taze eritrosit doğrudan bir sonraki adıma devam edin veya 1200 rpm santrifüj, eritrositlerde Alsever s çözümü saklanır olsaydı sayıda eritrosit sayımı ve PBS ile üç kez% 2 FBS ile takviye eritrosit miktarı (100 kat daha fazla) uygun yıkama 10 dakika her zaman için. </li><li> Adım 1.7 veya PBS içinde adım 2.10 genişletilmiş hücreleri PBMC'ler ile eritrositlerde birleştirin +% 2 FBS nihai hacmi PBMC'ler veya genişletilmiş hücreleri 5x10 7 kişi başına 1 ml . </li><li> RosetteSep, 1μL PBMC'ler veya genişletilmiş hücreleri 1x10 6 kişi başına  İnsan NK Hücre Zenginleştirme Kokteyl ekleyin . </li><li> İyice karıştırın ve her 5 dakikada bir karıştırarak yumuşak 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> PBS +% 2 FBS karışımı hafifçe eşit hacim ve Ficoll-Paque üst katman ekleyin. </li><li> (Bölüm I) hücre izolasyonu için açıklanan Ficoll Paque santrifüj adımları tekrarlayın. </li><li> Arıtma sonra kurtarıldı NK hücreleri saymak 5x105 hücreleri ve NK hücre saflık (Adım 8) flow sitometri ile phenotpying için bir kenara koyun. </li></ol> 5. Notlar NOT 1 PBMC'ler gelen NK hücreleri doğrudan genişletilmiş veya RosetteSep  saflaştırılmış NK hücreleri olabilir. Biz benzer bir genişleme verimliliği kaydetti var, ama bazı bağışçılar genişleme önce RosetteSep zorluk arındırıcı çok düşük NK hücre sayıları olabilir. NOT 2: Biz rutin olarak, NK hücreleri, CD3-negatif ve CD16 veya CD56-pozitif olduğu gibi numaralandırma, genişleme sırasında fenotipleme CD56-FITC, CD16-PE, ve CD3-PE- Cy5 kullanabilirsiniz. NOT 3, her ortam değişikliği veya stimülasyon az 2.5 x 10 5 / ml pik genişleme aşamalarında tekrar süspansiyon hücreleri, NK / mL başına ya da 2 milyonun altında PBMC hücre sayıları tutmak için . Bu besinlerin tükenmesi önlemek ve maksimum genişleme ve hayatta kalma elde etmenize yardımcı olacaktır. NOT 4 NK genişleme oranı uyarılara 1 ya da 2 yarı donmuş hücreleri sonunda donör bağımlı ve yarı deneysel ihtiyaç bağlı olarak daha da genişletilmiştir. Biz daha sonra açılımları için donmuş hücreleri kullanarak iyi bir başarı elde ettiler. NOT 5 700 uls NKEM ve sitotoksisite testinde kurmak için NKEM 4 mL yeniden süspanse 4x10 5 Calcein-AM lekeli hedef hücreleri yeniden süspanse 7x10 5 NK hücreleri en az kullanmanızı öneririz hata oda izin için. Eğer hedef hücreler hücreleri yüksek hacimli (6x10 5 ila 6 ml) kullanılan medya havzasının büyüklüğüne göre gerekli olabilir tohumlama için çok kanallı pipet kullanarak. Ayrıca tavsiye edilen NK hücre sayıları, özellikle E: T oranları yüksek E kullanmak için, protokol gösterir: T oranları artırmakbuna göre ml başına NK hücre sayıları (40:1 D için örneğin: T oranı kullanım 4x10 6 hücre / ml) 6 NOT: 1:500, 1:400, aşağıdaki dilüsyonları kullanarak tercih hedef hücre hattı için bir ön Calcein-AM yükleme titrasyon yapmak öneririz. 1:300, 1:200 ve 1:100, maksimum ve spontan sürüm arasındaki optimum bir fark elde etmek. NOT 7, ilk hedef olarak yapışık bir hücre hattı kullanarak enzimatik olmayan hücre disosiasyon tampon kullanarak tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak. CAM-medya ADCC performans varsa, hedef hücreleri yinelenen bir tüp hazırlayın. NOT 8 ADCC performans varsa, aynı NK hücreleri 10:01 e karşılık gelen 3 kuyu ekleyin: T ADCC . Ek donörler için tekrarlayın. Ek hedef hücreler için tekrarlayın. NOT 9 ADCC bir deneyi gerçekleştirmek, Calcein yükleme 45 dakika sonra, hedef hücreleri karşı ADCC inducing için spesifik antikor 10ug ekleyin. 15 dakika daha sonra, 1200 rpm'de 5 dakika için santrifüj iki kez tam bir ortamda hedef hücreleri yıkayın. 1x10 5 hücre / mL yeniden süspanse hücre ve protokolde bir sonraki adıma devam edin . 6. TEMSİLCİSİ SONUÇLAR <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 genişleme düzeni başına yapıldığında, başlangıç ​​materyali, 1x10 9 10 10 hücreleri (donör bağlı değişkenlik) tipik NK hücre verimleri aralığı 5x106 PBMC'ler kullanarak, yukarıda anlatılan. Şekil NK hücre kat genişleme gösterir (n = 19), orijinal ürün bulunan NK hücreleri ile karşılaştırıldığında (medyan + / - dörtte). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 genişletilmiş NK hücreleri, birkaç istisna dışında (CD11b, CD160 ve CD244) ile yorumlanmamış birincil NK hücreleri ile karşılaştırılabilir çeşitli NK hücre reseptörleri ifade . <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 PBMC'ler kurtarma Buffy coat bağımlı donör ve 300x10 6 800x10 6 uzanabilir. PBMC% 18 -% 2 NK hücreleri oluşur. Genişletilmiş hücrelerinin RosetteSep arıtma için,% 40-70 gün saf NK hücreleri 14 aralıkları kurtarma. Genişleme ve saflaştırma önerilen protokol takip ederek,% 99 NK hücre saflığı beklenebilir. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. Genişletilmiş NK hücreleri tümör hücre hatlarının nöroblastom, AML, osteosarkom ve melanom (temsilcisi AML öldürme yüzde lizis olarak gösterilen) de dahil olmak üzere bir dizi karşı sitotoksisite göstermiştir.

<ol><li>McKenna, D. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+manufacturing+practices+production+of+natural+killer+cells+for+immunotherapy%3A+a+six-year+single-institution+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience.</a> Transfusion. 47, 520-520 (2007).</li>
<li>Koehl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ex+vivo+expansion+of+highly+purified+NK+cells+for+immunotherapy+after+haploidentical+stem+cell+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Klinische+Padiatrie%22%5BJournal%5D)">ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children.</a> Klinische Padiatrie. 217, 345-345 (2005).</li>
<li>Klingemann, H. G., Martinson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications.</a> Cytotherapy. 6, 15-15 (2004).</li>
<li>Ayello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cord+blood+natural+killer+and+lymphokine+activated+killer+lymphocytes+following+ex+vivo+cellular+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Characterization of cord blood natural killer and lymphokine activated killer lymphocytes following ex vivo cellular engineering.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 12, 608-608 (2006).</li>
<li>Carlens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+in+vitro+expansion+of+cytotoxic+human+CD3-CD56%2B+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells.</a> Hum Immunol. 62, 1092-1092 (2001).</li>
<li>Boissel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+increase+expansion+of+cord+blood+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord mesenchymal stem cells increase expansion of cord blood natural killer cells.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 14, 1031-1031 (2008).</li>
<li>North, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-primed+human+natural+killer+cells+lyse+NK-resistant+tumor+targets%3A+evidence+of+a+two-stage+process+in+resting+NK+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-primed human natural killer cells lyse NK-resistant tumor targets: evidence of a two-stage process in resting NK cell activation.</a> J Immunol. 178, 85-85 (2007).</li>
<li>Berg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-grade+ex+vivo-expanded+human+natural+killer+cells+up-regulate+activating+receptors+and+death+receptor+ligands+and+have+enhanced+cytolytic+activity+against+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Clinical-grade ex vivo-expanded human natural killer cells up-regulate activating receptors and death receptor ligands and have enhanced cytolytic activity against tumor cells.</a> Cytotherapy. 11, 341-341 (2009).</li>
<li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+highly+cytotoxic+human+natural+killer+cells+for+cancer+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy.</a> Cancer Res. 69, 4010-4010 (2009).</li>
<li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+potential+of+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Replicative potential of human natural killer cells.</a> Br J Haematol. 145, 606-606 (2009).</li>
<li>Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+with+high+cytotoxicity+by+K562+cells+modified+to+co-express+major+histocompatibility+complex+class+I+chain-related+protein+A%2C+4-1BB+ligand%2C+and+interleukin-15%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of natural killer cells with high cytotoxicity by K562 cells modified to co-express major histocompatibility complex class I chain-related protein A, 4-1BB ligand, and interleukin-15.</a> Tissue Antigens. 76, 467-467 (2010).</li>
</ol>

NK Hücre Genişleme ve Etkinleştirme Medya (NKEM) <ul><li> 90% RPMI 1640 (Cellgro) </li><li> % 10 fetal sığır serumu (Gibco) </li><li> 1x Penisilin / Streptomisin (Cellgro) </li><li> 1x L-Glutamine (Gibco) <ul><li> Kullanımdan önce sterilize medya Filtresi. </li></ul></li><li> 50 U / ml IL2 (Proleukin, Novartis Aşı ve Teşhis, Inc.) <ul><li> - 200 IU ul / stok sulandırılır. Medya istenilen miktarda IL2 ekle hemen önce her zaman kullanın. </li></ul></li></ul> Hücre ve NK Hücre İzolasyonu <ul><li> Ficoll-Paque (GE Healthcare) </li><li> Alsever çözümü (Sigma) </li><li> RosetteSep İnsan NK Hücre Zenginleştirme Kokteyl (Stemcell Teknolojileri) </li></ul> NK Hücre Sitotoksisite Testi <ul><li> Calcein-AM (Invitrogen) <ul><li> Stok çözelti, 1 mg / ml 50 mcL alikotları donmuş, mağaza. Hücre boyanması için istenen seyreltme ulaşmak için NKEM medya eritin. </li></ul></li></ul> Antikorlar NK hücre fenotipleme için kullanılan antikorların listesi aşağıdaki tabloda listelenmiştir; <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Antikor </td><td> Test başına hacimde </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Tüp 1 </td><td valign="top"> Izotip FITC Izotip FITC Izotip FITC Izotip FITC FACS Tampon Toplam Hacim </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> Tüp 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 FACS Tampon Toplam Hacim </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> Tüp 3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS Tampon Toplam Hacim </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen Ar-Ge Sistemleri Miltenyi Biotec Ar-Ge Sistemleri BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> Tüp 4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS Tampon Toplam Hacim </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> Tüp 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS Tampon Toplam Hacim </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> Tüp 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS Tampon Toplam Hacim </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

genişleme, saflaştırılması, ve İnsan periferik kan nk hücrelerinin fonksiyonel değerlendirme

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells 

Doğal öldürücü (NK) hücreleri, bağışıklık gözetim çeşitli bulaşıcı mikroorganizmaların ve tümörleri karşı önemli bir rol oynamaktadır. NK hücreleri ve in vitro genişletmek için yeteneği sınırlı kullanılabilirlik NK hücre immünoterapi gelişimi kısıtladı. Burada fonksiyonel NK hücrelerinin ex vivo olarak, membrana bağlı IL21 ifade K562 hücreleri kullanarak yapay bir antijen sunan hücre (aAPC) büyük miktarlarda verimli bir şekilde genişletmek için bir yöntem açıklanmaktadır. NK hücre bugüne kadar evlatlık tedaviler, T hücreleri veya NK hücreleri pozitif seçimi tükenmesi takip donör kararlı durum leukapheresis hücre elde edilen bir ürün kullanmış olurlar. Genellikle ürün gecede IL-2 aktive ve sonra ertesi gün 1 yönetilmektedir. Çünkü NK hücreleri periferik kan düşük frekanslı, NK hücreleri nispeten az sayıda klinik çalışmalarda teslim edilmiştir. NK hücreleri in vitro yaymak için yetersizlik, en iyi klinik sonuç için yeterli hücre sayıları üretmek için sınırlayıcı bir faktör olmuştur . NK hücreleri bazı genişleme (1-2 hafta içinde 5-10 kat), yüksek doz IL-2 sadece 2 ile sağlanabilir . Otolog T hücrelerinin aktivasyonu da muhtemelen yerel sitokin 3 sürümü ile, NK hücre genişleme arabuluculuk yapabilirsiniz. Mezenkimal stroma veya yapay antijen sunan hücreler (aAPCs) desteği, hem de periferik kan ve kordon kanı 4 NK hücrelerinin büyümesini desteklemek . Kombine NKp46 ve antikor kaplı boncuklar CD2 aktivasyon henüz 21 gün içerisinde yaklaşık 100 kat genişleme, NK hücre genişleme (Miltenyi Biotec, Auburn CA) için pazarlanmaktadır. NK hücreleri aAPC genişletilebilir veya-aktive kullanarak klinik denemeleri devam etmekte, önemli bir genişleme olmadan lösemik hücre hattı CTV-1 - Başbakan ve aktive NK hücreleri 5 kullanarak bir. 21 gün 6 ortalama 490 kat genişleme sağlanması, NK hücre genişlemesi için ikinci bir deneme EBV-LCL kullanır. Üçüncü bir K562 tabanlı aAPC 21 gün içerisinde 277 kat ortalama NK genişleme elde 4-1BBL (CD137L) ve membrana bağlı IL-15 (MIL-15) 7, transduced kullanır. NK hücreleri, K562-41BBL-mIL15 kullanarak genişletilmiş olmasına rağmen, aAPC in vitro ve in vivo yorumlanmamış NK hücrelerine kıyasla son derece sitotoksik, ve ADCC katılmak, onların çoğalması yaşlanması telomer kısalması 8 atfedilen ile sınırlıdır. Daha yakın bir zamanda 350 kat genişleme NK hücreleri K562 ifade MİKA, 4-1BBL ve IL15 9 kullanarak bildirildi. NK hücre genişleme yöntemi, burada 21 günde bir ortalama 21.000 kat genişleme sağlanması yaşlanması olmadan, NK hücreleri hızla çoğalması üreten nitelendirdi.

Burada genişletmek ve verimli bir şekilde arındırmak çok sayıda insan NK hücre ve kendi fonksiyonunu değerlendirmek için bir metodu tanımlar.

Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Doğal öldürücü (NK) hücreler, çeşitli enfeksiyöz mikroorganizmalara ve tümörlere karşı yürütülen immün sürveyansta önemli bir rol oynamaktadır. ...'nın sınırlı erişilebilirliği

Bu prosedürün genel amacı, çok sayıda insan NK hücresini hızla çoğaltmaktır. Ex vivo aşamaya, buffy coat veya tam kan örneğinden p BMC'lerin veya NK hücrelerinin izole edilmesiyle başlanır. Ardından, NK hücresi ekspansiyonunda pbmc'ler yapay antijen sunan hücrelerle birlikte kültürlenir.Haftalık aPCs stimülasyonları ile NK hücre kültürleri üç hafta boyunca IL-2 takviyeli besiyerinde, NK hücre sayısının mililitre başına 1×10⁶'nın altında tutulmasına dikkat edilerek sürdürülür. Genişletilen NK hücrelerinin fonksiyonel etkinliği, radyoaktif olmayan bir sitotoksisite testi kullanılarak doğrulanır. Bu genişletme şemasıyla elde edilen tipik bir NK hücresi verimi, 21 günün sonunda, kalsiyum salınım testi ile belirlendiği üzere çeşitli tümörlere karşı yüksek sitotoksisiteye sahip NK hücrelerinin medyan 21.000 kat genişlemesiyle sonuçlanır.NK hücrelerinin büyük miktarlarda elde edilmesi tarihsel olarak çok zor olduğu için, bu tıbbi yöntem NK hücresi biyolojisi alanındaki temel bir sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin, insan kanserinin immünoterapisi üzerinde etkileri vardır çünkü bu tür bir terapi için yeterli NK hücresi üretmek tarihsel olarak çok zordur. Bu tekniği, laboratuvarımın kıdemli araştırma asistanı Cecily, sağlıklı donörlerden kan yoluyla PBMC'leri elde ederek gösterecektir.Genellikle kaynak olarak kan bankası Buffy coat kullanılır. İlk olarak, Buffy coat hacmini 140 mililitreye ayarlamak için PBS ekleyin. Ardından, gradiyent ayırma santrifüjü için 15 mililitre fial PA üzerine 35 mililitre numune katmanı ekleyip 400 G'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin.Kırma işlemi yapmadan. P BMC'lerini Fial PA plazma ara yüzeyinden dikkatlice geri kazanın ve RBC tüpünü daha sonra kullanmak üzere kenara ayırın. P BMC'lerini, her seferinde 10 dakika boyunca 400 G'de santrifüj ederek PBS ile üç kez yıkayın.NK hücre ekspansiyonu için P BMC'lerin bu fraksiyonunu kullanın. Şimdi gradyan tüpüne geri dönün. Üst fazı aspire ederek uzaklaştırın.RBC'leri iki adet 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve 50 mililitre işaretine kadar PBS ekleyerek yıkayın. Santrifüjden sonra, RBC tabakasının üzerinden sıyırma yöntemiyle süpernatantı aspire edin. Bu işlem granülositleri uzaklaştırmak içindir.Üç kez yıkama işlemi gerçekleştirin, ardından RBC'leri eşit hacimde else çözeltisi içinde yeniden süspande edin ve dört santigrat derecede bir aya kadar saklayın. Bu RBC fraksiyonu, iki haftalık ekspansiyonun sonunda NK hücrelerinin roset SEP saflaştırması için kullanılabilir. Fonksiyonel NK hücrelerini ex vivo ortamda verimli bir şekilde ekspande etmek için, bundan sonra K 5 62 olarak adlandırılacak olan, membranla bağlı IL 21 içeren K 5 62 klon dokuz hücreleri kullanılır.Yapay bir antijen sunan hücre olarak K562 klon dokuz IL-21 hücreleri kullanılır; önce PBMC'leri sayın ve her bir NK hücresi ekspansiyonu için ekilecek 5 × 10⁶ hücreye karşılık gelen hacmi hesaplayın. 5 × 10⁶ PBMC sayımı için 10 × 10⁶ K562 klon dokuz IL-21 hücresini ışınlayın. Gamma ışınlayıcı kullanarak 100 Gy dozunda ışınlanan hücreler, gelecekte kullanmak üzere dondurulabilir. Şimdi, önceden ışınlanmış hücreleri PBS ile yıkayın ve NK hücresi ekspansiyon medyumunda yeniden süspande edin.Şimdi, 40 ml NK hücresi ekspansiyon medyumunda, ışınlanmış hücreler ile pbmc'leri ikiye bir oranında ekleyin ve T 75 flaskını 37 °C ve %5 CO2 sıcaklığındaki bir inkübatöre dik konumda yerleştirin. Üçüncü günde, stimüle edilmiş hücreleri 400 ×g'de beş dakika santrifüj ederek geri kazanın, medyumun yarısını taze NKEM ile değiştirin ve kültüre devam edin. Beşinci günde medyum değişimini tekrarlayın. Bir haftanın sonunda hücre sayısını belirleyin ve akış sitometrisi ile fenotipleme yapmak üzere 5 × 10⁵ hücre ayırın; ikinci stimülasyon için K 5 62 hücrelerini bire bir oranda sayın ve ışınlayın.Hücreleri genişletmek için dokuz IL 21 hücresini klonlayın ve ardından hücreleri, mililitrede toplam 2.5 × 10⁵ hücre olacak şekilde NK hücresi genişletme medyumunda birleştirin. Hücreleri T 75 flasklarda inkübe edin ve kültürlemeye devam edin; 10. ve 12. günlerde hücreleri, mililitrede 2.5 × 10⁵ hücre olacak şekilde NK hücresi genişletme medyumunda pasajlayın. Genişletmenin 14. gününde hücreleri tekrar sayın ve bir örneğin fenotiplemesini akış sitometrisi ile gerçekleştirin.PBMC kaynaklı bu hücre ekspansiyonunu rozet SEP saflaştırma protokolünü kullanarak saflaştırın ve NK hücrelerinin saflığını akış sitometrisi fenotiplendirmesi ile doğrulayın. Saflaştırılmış NK hücreleri üzerinde, ışınlanmış K 5 62 klon dokuz IL 21 hücreleri ile bire bir oranında üçüncü bir stimülasyon gerçekleştirin. Son olarak 21. günde, amplifiye edilmiş NK hücrelerini tam bir fenotiplendirme antikor paneli kullanarak akış sitometrisi ile analiz edin.Hücre stoklarını, %10 DMSO içeren FBS içinde, flakon başına maksimum 5x10⁷ hücre yoğunluğunda dondurun. Sitotoksisite testi için taze veya dondurulmuş NK hücreleri kullanın. Dondurulmuş NK hücreleri kullanılıyorsa, önce NK hücresi flakonunu çözün ve hücrelerin toparlanması için test gününde 24 saat boyunca NKEM içerisinde ekim yapın; 10⁶ hedef hücreyi, kalsiyum am içeren 1 ml NKEM içinde yeniden süspande edin ve ara ara çalkalayarak 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin; U-tabanlı 96 kuyucuklu plakaya, 1x10⁶ hücre/ml yoğunluğunda süspande edilmiş NK hücrelerinden üç tekrarlı olarak 200 µL ekleyin ve hücrelerin seri dilüsyonunu belirtildiği şekilde gerçekleştirin.Bir saatlik kalsiyum yüklemesinin ardından, hedef hücreleri NK hücresi ekspansiyon besiyerinde iki kez 400 G'de beş dakika santrifüj ederek yıkayın. Şimdi hedef hücreleri yeniden sayın ve mililitre başına 1 × 10⁵ hücre olacak şekilde resüspande edin. 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 100 µL hedef hücre ekleyin ve hücre temasını başlatmak için 100 G'de bir dakika santrifüjleyin; ardından 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında dört saat inkübe edin.Salınan kalsiyumu homojen şekilde süspande etmek için, pellet hücreleri beş dakika boyunca 100 G'de pipetleme yöntemiyle nazikçe karıştırın ve süpernatantın 100 microliters kısmını yeni bir düz tabanlı 96 kuyucuklu plakaya aktarın; bunu yaparken hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin ve gerekirse oluşan kabarcıkları ince bir iğne yardımıyla patlatın. Plakayı, eksitasyon filtresi 485 nanometers ve emisyon filtresi 530 nanometers olarak ayarlanmış bir floresan plaka okuyucu kullanarak okuyun.Yüzde spesifik lizis değerini hesaplayın. Tipik olarak, buffy coat'tan izole edilen 5x10⁶ PBMC'nin ekspansiyonu, 1x10⁹ ile 10¹⁰ arasında NK hücresi sağlar; ekspande edilen NK hücreleri, buffy coat'taki ekspande edilmemiş primer NK hücreleri ile karşılaştırılabilir düzeyde çeşitli NK hücresi reseptörleri eksprese eder.14. günde NK hücreleri, pbmc'nin %2 ila %18'ini oluşturabilir. Genişletilmiş hücrelerin Rozet SEP saflaştırması, CD3 negatif CD56 pozitif hücreler ile %99'luk bir NK hücresi saflığında, kültürde bulunan NK hücrelerinin %40 ila %70'ini geri kazanabilir. Genişletilmiş NK hücreleri; nöroblastoma, AML, osteosarkom ve melanoma dahil olmak üzere bir dizi tümör hücre hattına karşı sitotoksisite göstermiştir.Burada temsili A ML öldürmesi, yüzde spesifik lizis olarak gösterilmiştir. Canlı BIOT videosu, kalsiyum am ile yüklenmiş nöroblastoma hücre hattı CHP 1 34'ün NK hücreleri tarafından öldürülmesini göstermektedir. Bu prosedürden sonra, NK hücrelerinin fonksiyonlarına ilişkin ek soruları yanıtlamak için NK hücreleri tarafından sitokin üretimi analizi ve hayvan tümör modellerinde adaptif transfer gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, çok sayıda NK hücresinin nasıl genişletileceği ve saflaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu işlem, doğrudan periferik kan mononükleer hücrelerinden gerçekleştirilip ardından NK hücreleri saflaştırılabileceği gibi, rozet yöntemiyle saflaştırılmış NK hücreleri kullanılarak da başlatılabilir. Başlangıçta, tipik bir buffy coat 15 ila 40 milyon arasında NK hücresi sağlayacaktır ve bunların tamamı, bu yöntemde açıklanan şema kullanılarak çok yüksek sayıda NK hücresi genişletmek için kullanılabilir.

expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada yapay antijen sunan hücreler (AAPC) kullanarak toplu T hücre popülasyonlarının insan NKT hücreleri aktive ve genişletilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. CD1d bazlı AAPC kullanılması, fonksiyonel NKT hücrelerinin yüksek sayılar için bir standart bir yöntem sağlar.

Yapay Antijen Hücre (AAPC) Aracılı Aktivasyon ve Doğal Öldürücü T hücreleri genişletilmesi Presenting

Bu videoda, doğal öldürücü (NK) hücrelerin bir besleyici hücre hattı kullanılarak doğrudan periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) genişletilmesi için bir teknik gösterilmektedir. PBMC'ler, zara bağlı interlökin-21 (mIL-21) eksprese eden genetik olarak modifiye edilmiş lenfoblastoid besleyici hücrelerle birlikte kültürlenir ve kültür, interlökin-2 (IL-2) ve interlökin-15 (IL-15) sitokinleri ile desteklenir. Birlikte, bu ligand kokteyli, NK hücrelerinin yüksek saflıkta uzun süreli...

Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden Doğal Öldürücü Hücrelerin Ex Vivo Genişlemesi

Bu protokol, geliştirme, genişleme ve hESC ve iPSCs türetilen NK hücreleri, in vivo görüntüleme açıklar.

Geliştirme, Genişleme ve<em&gt; In vivo</em&gt; İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) den İnsan NK Hücrelerinin İzleme ve ve Bağlı Pluripotent Kök Hücre (iPSCs)

Burada, fare dalağından çok sayıda murin değişmez doğal öldürücü T hücresi oluşturmak için kullanılabilecek uyarlanmış bir protokol sunuyoruz. Protokol, splenik iNKT hücrelerinin sınırlı sayıda hayvan ve reaktif kullanılarak in vitro olarak zenginleştirilebileceği, izole edilebileceği ve genişletilebileceği bir yaklaşımı özetlemektedir.

Fare Dalak Değişmeyen Doğal Öldürücü T Hücreleri İzolasyon ve Yaygınlaştırılması için optimize Yöntemi

Basit ve güvenilir bir yöntem, örneğin, farklı NK hücresi alt-gruplar içinde degranülasyonu, sitokin ve kemokin üretimi gibi NK hücresi fonksiyonlarının bir dizi analiz için tarif edilmektedir.

Akış NK Hücre Fonksiyonları İzleme Testi Sitometri tabanlı

Kantitatif insan doğal katil hücrelerin sitotoksik etkinliğini belirlemek için Akış Sitometresi tabanlı yöntemi burada gösterilir.

Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

İnsan doğal öldürücü hücrelerindeki terapötik antikorlar tarafından FcφRIIIa güdümlü olayları incelemek için bir protokol burada açıklanmıştır. Bu yapay stimülasyon platformu, degranülasyon, kemokin/sitokin üretimi gibi aşağı akış efektör fonksiyonlarının ve bağlamada yer alan antikorların FcφRIIIa ve Fc bölümlerinin aracılık ettiği sinyal yollarının sorgulenmesine izin verir.

Terapötik Antikorların Varlığında FcφRIIIa Katılımı tarafından Yönlendirilen İnsan Doğal Öldürücü Hücre Olaylarının Değerlendirilmesi

Değişmez doğal öldürücü T (iNKT) hücrelerini fare dalağını zenginleştirmek ve in vitro ve in vivo çalışmalar için uygun sayılara genişletmek için hızlı ve sağlam bir protokol açıklıyoruz.

In vitro ve in vivo Çalışmalar için Fare Değişmez Doğal Öldürücü T Hücrelerinin Saflaştırılması ve Genişlemesi

Burada, periferik kan doğal öldürücü (PBNK), karaciğer dokularından NK hücreleri ve periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) veya kordon kanından (CB) türetilen kimerik antijen reseptörü (CAR)-NK hücrelerini genişletmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, genişlemiş NK hücrelerinin optimize edilmiş saflığına ek olarak, 221-mIL-21 besleyici hücreler kullanılarak NK ve CAR-NK hücrelerinin genişlemesini göstermektedir.

Doğal Öldürücü (NK) ve Membran Bound-IL-21-Modifiye B Hücre Hattı Kullanarak CAR-NK Hücre Genleşme Yöntemi

Mevcut protokol, hafif sitotoksisiteye sahip CD3-/CD45+CD56+ hücrelerinin, hem 3D hem de 2D kültür koşulları altında insan genişlemiş potansiyel kök hücrelerinden (hEPSC'ler) nasıl ayırt edileceğini göstermektedir. Bu, karmaşık mikro çevrenin tahrip edilmeden rutin fenotipik doğrulamaya izin verir.

İnsan Genişletilmiş Potansiyel Kök Hücrelerden Doğal Öldürücü Hücrelerin Üretilmesi

Öğrenin, insan NK hücrelerini genişletme ve saflaştırma yöntemini. Yapay antijen sunan hücreler ve IL-2 kullanılarak 21 günde 21.000 kat büyüme sağlanır. Bu teknik, kanser immünoterapisi için fonksiyonel NK hücreleri üretmeyi mümkün kılar.

Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Daha fazla video keşfet