Sinekler Etanol Hassasiyet Tedbir Basit Yolu

Merhaba, ben Dallas'taki UT Southwestern Tıp Merkezi Psikiyatri Bölümü'nde Dr. Adrian Rothen'in laboratuvarından Thomas Maples. Bugün, sineklerin etanol kaynaklı sedasyona karşı hassasiyetini belirlemek için kullanılan basit bir prosedürü göstereceğim. Bu analiz, sineklerin etanola maruz kaldıktan sonraki yürüme yeteneklerinin ve düzeltme reflekslerinin kaybına dayanmaktadır.

Bu ölçüm, farklı drosophila suşları ve mutantları arasındaki alkol duyarlılığı farklarını belirlemek için kullanılabilir. Ayrıca bu testi, sineklerde tolerans oluşturmak için de kullanabiliriz; tolerans, tekrarlanan maruziyet sonrası alkole verilen tepkinin azalmasıdır. Hadi başlayalım.

Bu deney için aşağıdaki tüplere ihtiyacınız olacak. Bir veya iki gün önce topladığınız sekiz meyve sineği ile. Maruz bırakma işlemlerini erkek veya dişi sineklerle gerçekleştirebilirsiniz.

Ancak, her flakon yalnızca tek bir cins içermelidir. Sinek içermeyen boş bir yem flakonu, bir jilet, pamuk benzeri malzemeden yapılmış iki flakon tıpası. Bu tür tıkaçlarınız yoksa, pamuk topları da kullanabilirsiniz; ayrıca uçlarıyla birlikte 1000 microliter mikro pipet, herhangi bir marketten temin edebileceğiniz gıda boyası içeren 200 proof etanol ve bir zamanlayıcı gereklidir.

İlk olarak, sinekleri etanola maruz bırakacağımız ve hareketliliklerini takip edeceğimiz bir maruziyet odası hazırlamalıyız. Bu odayı oluşturmak için öncelikle, bir vial tıpasını jilet yardımıyla ikiye bölün. Ardından, yarımlardan birini yemi örtecek şekilde vialin tabanına itin.

Bu, sineklerin üzerinde yürüyebileceği düz ve yapışkan olmayan bir yüzey oluşturur. Pamuk topu kullanıyorsanız, pamuğu düzgünce bastırın ve sineklerin pamuk liflerine takılmaması için mümkün olduğunca tüysüz hale getirmeye çalışın. Birden fazla bölme hazırlıyorsanız, yemin ve flakon tıpasının her bölmede aynı miktarda yer kapladığından emin olun.

Bu, her bölmedeki sineklerin aynı hacimde etanola maruz kalmasını sağlar. Pratikle, üç şişe sineği paralel olarak maruz bırakmak kolaydır. Maruz bırakma bölmeleri hazırlandıktan sonra, sinekleri etanola maruz bırakabiliriz.

Öncelikle, sekiz sinek içeren bir flakonu bir maruziyet odasına aktarın ve odayı, sineklerin başlangıçta bulunduğu flakonun tıpasıyla kapatın. Ardından, seçtiğiniz konsantrasyondaki boyalı etanolün 500 µL'sini pamuk benzeri bir flakon tıpasının bir ucuna pipetleyin. Son olarak, maruziyet odasının tıpasını etanol kaplı tıpa ile değiştirin ve etanol kaplı ucu odanın içine yerleştirin.

Etanol kaplı tıpayı maruziyet odasına ekledikten hemen sonra bir zamanlayıcıyı başlatın. Etanoldeki boya, etanolün şişe duvarına değil, maruziyet odasına doğru bakmasını sağlamaya yardımcı olur. Pamuk toplarının herhangi bir tarafı şişeye bakabileceği için, buzz tıpalar yerine pamuk topları kullanıyorsanız bu durum özellikle önemlidir.

Bu maruz bırakma işleminde, sineklerin havadan soluduğu maruz kalma odasına difüze olan %100 alkol kullanıyoruz. Etanol kaplı tıpayı maruz kalma odasına ekledikten sonra her dakika, kaç sineğin hareketsiz kaldığını, yani kendi etraflarında dönemediklerini ve yürüyemediklerini sayacağız. Sinekler ne kadar uzun süre hareketli kalırlarsa, her bir dakikalık aralıkta o kadar dirençli oldukları anlamına gelir.

Hareket edebilen tüm sineklerin hareket ettiğinden emin olmak için hazneyi tezgaha vurarak sinekleri ürkütün. Her bir dakikalık aralıkta, sineklerin hareket etmeye başlamaları veya kendilerini ters çevirmeleri için onlara zaman tanımak amacıyla vurduktan sonra 10 saniye boyunca gözlemleyin. Deneyin başında sekiz sinekten kaçının hareketsiz olduğunu belgeleyin.

Sineklerin çoğu, ürktükten sonra hızla şişe duvarına doğru tırmanacaktır. %100 etanol maruziyetinin yaklaşık altı dakikası sonrasında, 12. dakikaya gelindiğinde uyuşukça ve bazen düzensiz bir şekilde hareket etmeye başlarlar. Sineklerin çoğu, yürüyemedikleri veya sırt üstü yattıklarında kendilerini ters çeviremedikleri için hareketsiz kalacaktır.

Yalnızca düzeltip ayağa kalkabilen ve yürüyebilen sinekler hareketli olarak sayılmalıdır; yalnızca bacaklarını veya kanatlarını oldukları yerde hareket ettiren sinekler sabit olarak sayılmalıdır; tüm gözlem süresi boyunca sırt üstü kalan sinekler de, kendilerini düzeltememeleri intoksikasyon belirtisi olduğu için sabit olarak sayılmalıdır. Tüm on saniyelik gözlem süresi boyunca kanatlarını şiddetli bir şekilde titreten sinekler, yer değiştirseler bile aynı şekilde sabit olarak sayılmalıdır. Bu sineklerin büyük çoğunluğu, hızlı kanat hareketleri arasındaki sürelerde sabittir.

Özetle, kendi başlarına ters dönebilen ve yürüyebilen sinekler mobil; ters dönemeyen, bacaklarını ve kanatlarını oldukları yerde hareket ettiren veya kanatlarını hızla titreştiren sinekler ise stasyonerdir. Bu kuralları uyguladığımızda, etanol buharlarına maruz kalma süresi (dakika cinsinden) arttıkça daha fazla yabani tip sineğin stasyoner hale geldiğini görürüz. Bu deneyde etanol duyarlılığını nicelendirmek için kullanılan değer, medyan sedasyon süresi veya MST'dir.

MST'yi, maruziyet odasındaki sekiz sinekten dördünün hareketsiz hale gelmesi için gereken etanol maruziyet dakikaları olarak tanımlıyoruz. Eğer belirli bir gözlem süresinde tam olarak dört sinek hareketsizse bu değer kolayca belirlenir. Örneğin, 11 dakikalık maruziyetten sonra tam olarak dört sinek hareketsizse, MST 11'dir.

Eğer 11 dakikalık maruziyetten sonra tam olarak dört sinek hareketsizse ve 12. dakikada da durum aynıysa, sineklerin ilk kez ST'lerine ulaştığı süre olduğu için ilk değer baz alınır. Belirli bir gözlem süresinde dört sinek hareketsiz değilse, dört sineğin hareketsiz hale geldiği sürenin lineer interpolasyonu gereklidir. Örneğin, dokuz ve 10 dakikalık maruziyet arasında hareketsiz sinek sayısı üçten beşe çıkarsa, MST'nin 9,5 olduğu grafiksel olarak belirlenebilir. Bu analiz kullanılarak toplanan aşağıdaki veriler, bu deneysel tasarımın etanol duyarlılığını ölçmek için doğru bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Aşağıdaki deneylerde, çubuklarda belirtildiği üzere altı ila sekiz şişelik bir N sayısı kullanılmıştır. %100 Ethanol'e maruz kalan erkek yabani tip sineklerin MST'si, düşük bir standart hata ile yaklaşık 11 dakikadır. Günlük değişkenlik düşüktür ve çoğunlukla istatistiksel olarak anlamlı değildir; ancak yine de deney ve kontrol gruplarınızı aynı gün paralel olarak ölçmenizi öneririz.

Ayrıca, A günü ve B günü maruz bırakılan sineklerin aynı bireyler olmadığını unutmayın. Bunlar, aynı genetik stoktan gelen kardeşlerdir; %100 Ethanol'e maruz bırakılan erkek ve dişi sineklerin MST değerlerinde herhangi bir fark görülmemektedir. Yine de tek bir cinsle devam etmenizi öneririz.

Erkek ve dişi sinekleri artan etanol dozlarına maruz bıraktığımızda, artan etanol konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak MST'de istatistiksel olarak anlamlı bir azalma gösteren düzgün bir doz yanıt eğrisi elde ederiz. Bu analiz, daha karmaşık bir etanol buharlaştırma düzeneği ile ölçülen ve daha önce yayınlanmış fenotipleri de yeniden ortaya koymaktadır; right rabbit one mutasyonuna sahip sinekler MST'de anlamlı bir artış göstermiştir. Bu artış, %100'lük etanolün yanı sıra %90'lık etanolde de gözlemlenmiştir.

Bu analiz yöntemini kullanarak, sineklerde etanol toleransını indükleyebilir ve ölçebiliriz. Tolerans, toleransı indüklemek amacıyla alkole ön maruziyetin ardından, alkole verilen yanıttaki azalma olarak tanımlanır. Bir şişe sineği, yaklaşık MST değerlerinin iki katı süre boyunca etanola maruz bırakın.

Örneğin, bu erkek Berlin wild type stoklarını 24 dakika boyunca %100 etanol ile maruz bırakıyoruz. Maruz bırakma işleminin ardından, sekiz sineği nazikçe vuruşlarla besin şişelerine geri aktarın ve burada dört saat boyunca toparlanmalarına izin verin. Dört saatlik toparlanma süresinin ardından sineklerin orijinal MST değerlerini şişelerinin üzerine kaydedin, aynı sinekleri aynı dozda etanole tekrar maruz bırakın ve ikinci MST değerlerini kaydedin.

Bu grafikte görebileceğiniz üzere, etanolün ikinci maruziyetindeki MST, ilk maruziyetin MST'sinden anlamlı derecede yüksektir; bu durum, sineklerin etanolün sedatif etkilerine karşı tolerans geliştirdiğini göstermektedir. Tolerans ölçümü, belirli bir sinek şişesindeki ikinci MST'nin, aynı sineklerin ilk MST'sine bölünmesi ve ardından birden çıkarılmasıyla hesaplanır; elde edilen değer yüzde tolerans olarak ifade edilir ki bizim durumumuzda bu yaklaşık %50'dir. İzlediğiniz için teşekkürler, deneyinizde başarılar dileriz.