Hızlı Aktarım ve Lyme Hastalığı Patojenler lokalizasyonu için işaretleyin Gut içinde Yöntemleri

Bu prosedürün genel amacı, borrelia berg de ferry hücrelerini kene bağırsağına mikroenjeksiyonla aktarmak ve yerleştirmektir. Bu işlem, öncelikle cam kapiler iğnelerin hazırlanması ve bunların beberg de ferry hücreleri ile doldurulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, beberg defer hücreleri mikroenjeksiyon yoluyla kene bağırsağına aktarılır.

Ardından kene diseke edilir ve bağırsak dokuları çıkarılır. Son olarak, kene bağırsağındaki beberg defer'in immünofloresan işaretlemesi gerçekleştirilir. Nihayetinde, konfokal mikroskopi kullanılarak beberg'in kene bağırsağındaki ferry'ye lokalizasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Maryland Üniversitesi Veteriner Tıp Bölümü'nden Dr. Ruth Paul. Bugün laboratuvar ekibimden doktora sonrası araştırmacı Toro Cairo ve lisansüstü öğrencisi Adam Coleman, laboratuvarımızda rutin olarak gerçekleştirdiğimiz mikroenjeksiyon yoluyla kenelerin yapay olarak enfekte edilmesi prosedürünü size gösterecekler. Mikroenjeksiyondan sonra, keneyi diseke edeceğiz ve konfokal CE mikroskobu kullanarak kenenin bağırsağındaki bakterileri görüntüleyeceğiz.

Doğal yolla enfekte olmuş bir kene neslinin mikroenjeksiyonunun temel avantajı, prosedürün süresidir. Doğal beslenme süreciyle enfekte keneler üretmek için yaklaşık beş hafta gerektiğinden, mikroenjeksiyon tüm prosedürü haftalardan saatlere indirir. Bu teknik, RNAi için çift zincirli RNA veya spesifik antikor interferansı için antisera gibi diğer faydalı reaktiflerin kene içine enjekte edilmesine de uyarlanabilir.

Başlamak için, bir cam mikropipet çekme cihazında bir milimetrelik cam kapiler tüpleri ısıtıp çekerek birkaç mikroenjeksiyon iğnesi hazırlayın. Hassas kapiler tüpleri dikkatlice çıkarın. Toplanan iğneleri, uçları yukarı bakacak şekilde bir Petri kabı içindeki yapışkan bant üzerinde saklayın.

Ardından, BSK kültüründe B. bergdeferri üretin. Ortamda yaklaşık 10⁷ hücre/mL konsantrasyona ulaşıldığında, B. bergdeferri hücrelerini oda sıcaklığında, 3000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün. Süpernatantı uzaklaştırın ve pelletlemi hücreleri, 200 µL'lik steril bir mikropipet ucuyla nazikçe geçirmek suretiyle BSK ortamında 10⁹ hücre/mL nihai konsantrasyona ulaşana kadar tamamen resüspande edin.

Hücreler yüksek hücre yoğunluğunda yeniden süspande edildiğinden ve topaklanabileceği için, hücre süspansiyonu mikroenjeksiyon için derhal kullanılmalıdır; keneleri hazırlamak için, yapışkan bir mat üzerinde çalışarak bir lam üzerine şeffaf çift taraflı yapışkan bant yerleştirin, keneleri kaptan dikkatlice çıkarın, küçük bir fırça kullanarak enjekte edilecek gerekli sayıda keneyi, ventral tarafları yukarı bakacak ve aynı yöne dönecek şekilde yapışkan bant üzerine yerleştirin. Havuzlanmış kapiler iğneye beş µL Bebergaria ferrari kültürü yükleyin. 20 µL'lik bir mikro yükleme pipet ucu kullanarak iğneyi hapsolmuş hava kabarcıkları açısından kontrol edin ve iğneye bakteri kültürünü yeniden yükleyin.

Gerekirse keneyi diseksiyon binoküler mikroskobu altında inceleyin ve kenenin anal açıklık bölgesine odaklanın. Mikroenjeksiyon iğnesini oluşturmak için, çapı kenenin anal açıklığından biraz daha küçük olan tüp kısmını kırmak amacıyla kapiler iğnenin ucuna hafifçe dokunun. Uygun olmayan iğne uçlarıyla kene enjeksiyonu yapma girişimleri yaralanmalara ve olası ölümlere neden olacağı için bu adım kritiktir.

Enjekte edilen kene için; immobilize edilmiş keneleri diseksiyon binoküler mikroskobunun altına yerleştirin ve iki hareketli anal plaka tarafından örtülen anal açıklığa odaklanın. İnce uçlu pens kullanarak, anal açıklığın yakınındaki herhangi bir bölgeye hafifçe dokunun ve çok düşük düzeyde basınç uygulayın.

Bu işlem, anal plakaların ayrılmasını ve bağırsağa bağlanan anal porun açılmasını sağlayacaktır. İğnenin ucunu, anal plakaların zorlanarak açıldığı bölgeden anal açıklığa dikkatlice ve hafifçe yerleştirin. Cam uç, rektuma bağlanan yarı şeffaf arka bağırsağa zarar verebileceği için iğnenin yerleştirilmesi minimum düzeyde tutulmalıdır.

Otomatik ayak kontrolü ile donatılmış bir mikro enjektör kullanarak, aşağıdaki parametrelerle Beberg de Ferry solüsyonunu enjekte edin: 1000 Hector Pascal enjeksiyon basıncı, 0.2 saniye enjeksiyon süresi ve sekiz Hector Pascal kompanzasyon basıncı. Her bir tik, mikroenjeksiyondan sonra tek bir enjeksiyon alır.

Kene, enjeksiyondan öncesine benzer şekilde hareket belirtileri göstermeli veya uyarılara tepki olarak sürünmelidir. İmmünofloresan mikroskopi için keneleri diseke etmek amacıyla, önce diseksiyon için temiz bir cam lam üzerine bir damla fosfat tamponlu salin ve başka bir damla polilizin kaplı bir lam üzerine yerleştirin. Mikroskopi için, çift taraflı yapışkan bantla başka bir cam lam hazırlayın. Ardından, keneyi kaptan çıkarın ve çift taraflı yapışkan bandın üzerine yerleştirin.

Diseksiyon mikroskobu görüşü altında küçük bir fırça kullanarak keneye odaklanın ve ilk ve ikinci bacak çiftleri arasına keskin bir jilet yerleştirin. Keneyi iki parçaya bölerek karnı açığa çıkaracak şekilde kuvvetlice bastırın; karnı açığa çıkarır çıkarmaz ince pensler yardımıyla bir damla PBS içine daldırın. Kesim bölgesinin etrafındaki dorsal ve ventral ekzoskeleti kavrayın.

Sırt kalkanını dikkatlice yukarı ve kene gövdesinden uzağa çekerek kahverengi renkli bağırsak divertiküllerini açığa çıkarın. Diseksiyon yapılan kenelerin her zaman PBS altında tutulduğundan emin olun. Yarı saydam tükürük bezi demetleri, bağırsağın ön bölgesinin her iki yanında yer alır ve istenirse bu aşamada çıkarılabilir.

Kalan ekzoskeleti pensle yerinde tutarak, sindirim sistemini abdomenden dikkatlice çekip çıkarın. Trakea gibi sıkışmış dokuları temizleyerek sindirim sistemini dikkatlice arındırın. İnce uçlu bir pens kullanarak, kene sindirim sistemini hızlıca poli-L-lizin cam lam üzerindeki bir PBS damlacığına aktarın.

Bağırsakları ince uçlu bıçaklar kullanarak veya ince uçlu pensetle nazikçe bastırarak daha küçük parçalara ayırın. Bağırsak dokularının etrafındaki fazla PBS'yi dikkatlice aspire edin. Bağırsak dokularının oda sıcaklığında hava ile kurumasını sağlayın.

Kene bağırsağını 10 dakika boyunca asetonda bekleterek sabitleyin. Oda sıcaklığında havada kurumasını bekleyin; bu aşamada lamlar, hava sızdırmayan bir kapta -20 °C'de aylarca saklanabilir. Bağırsağın immünofloresan işaretlemesi için, sabitlenmiş kene bağırsağının etrafını bir PAP kalem veya diğer hidrofobik bariyer oluşturucu bir araçla çevreleyin.

Bu işlem, sonraki inkübasyon adımları sırasında boyama çözeltilerinin korunmasına yardımcı olacaktır. Kene bağırsağını bir veya birkaç damla bloklama tamponu ile 30 dakika boyunca örtün. Oda sıcaklığında.

Bloklama için kullanılan serum, antikorun konakçı hayvan kaynağına bağlıdır. Bu noktadan itibaren lamın kurumasına izin vermeyin. Bloklama tamponunu yavaşça aspire edin.

Bağırsağı uygun primer ve/veya sekonder antikor solüsyonları ile inkübe edin. Biz, floriseyin izotiyosiyanat veya FXI etiketli anti B berg kullanıyoruz. Antikoru, bloklama tamponu içerisinde 1:100 dilüsyonda bir saat boyunca uygulayın.

Oda sıcaklığında, ışığa maruz kalmayı sınırlamak için kabı alüminyum folyo ile örtün. Antikor çözeltisini nazik bir aspirasyonla uzaklaştırın. Keneyi işaretlemek için bağırsakları DPI veya propidyum iyodür gibi floresan bir boya ile inkübe edin.

Normalde oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBS içinde 20 µg/mL peridinin iyodür kullanır, ardından beş dakika boyunca PBS içinde %0,05 tween 20 ile üç kez yıkarız. Son olarak, lamı Antifa reaktifi içeren tamponlu gliserol ile monte eder ve dikkatlice bir lamla kapatırız. Lamlar bu aşamada hava sızdırmaz bir kapta dört °C'de birkaç ay boyunca saklanabilir ve konfokal mikroskop altında görüntülenip lokalize edilebilir.

Burada, görünürlüğü artırmak için kumasi brilliant blue ile doldurulmuş bir iğne kullanılarak gerçekleştirilen bir kene mikroenjeksiyonu gösterilmektedir. Anal plakların ayrılmasını ve mikroenjeksiyon için anal porun açılmasını sağlamak amacıyla vücuda hafif baskı uygulamak için ince pensler kullanılır. Burada, bağırsak içerisinde beberg ferry bulunan bir bağırsak divertikülümünün anterior bölgesi gösterilmektedir.

Bağırsak çekirdekleri ve spiroketler sırasıyla propidyum iyodür veya fitzy konjuge anti beberg ferry ile işaretlenir. Bu işlemde uzmanlaştığımızda, doğal olarak yüz bin hayatta kalanın bulunduğu ve fer ile enfekte edildiği 10 kenenin mikroenjeksiyon yapılabileceğini gördük. Keneler diğer deneyler için hemen kullanılabilse de, işlemlere devam etmeden önce kenelerin prosedürden sağ çıktığından emin olmak için genellikle bir veya iki gün bekleriz.

Bu videoyu izledikten sonra, konfokal immünofloresan yöntemlerini kullanarak kenelerin bağırsakları içinde mikro ve lokalize bariyer böcekleri ile yapay enfekte kenelerin nasıl üretileceğine dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Kenelerle ve Borrelia burgdorferi gibi insani bir patojenle doldurulmuş ince cam iğnelerle çalışmak, çalışma sırasında tehlikeli olabilir. Kenelerin ve iğnelerin konumlarının bilincinde olun ve her zaman biyogüvenlik seviyesi iki önlemlerini uygulayın.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.