Hızlı Aktarım ve Lyme Hastalığı Patojenler lokalizasyonu için işaretleyin Gut içinde Yöntemleri

Bu prosedürün genel amacı, kene bağırsağında borrelia berg de ferry hücrelerini mikro enjekte etmek ve lokalize etmektir. Bu, önce cam kılcal iğnelerin hazırlanması ve bunların beberg de ferry hücreleri ile doldurulmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, beberg erteleme hücreleri mikroenjeksiyon yoluyla kene bağırsağına aktarılır.

Kene daha sonra diseke edilir ve bağırsak dokuları çıkarılır. Son olarak, kene bağırsağında beberg ertelemenin immünofloresan etiketlemesi yapılır. Sonuç olarak, konfokal mikroskopi kullanılarak kene bağırsağında beberg'in feribota lokalizasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Dr.Ruth Paul Paul, Maryland Üniversitesi Veterinerlik Bölümü'nde yardımcı doçentim. Bugün, doktora sonrası bir araştırmacı olan laboratuvar üyem Toro Cairo ve bir yüksek lisans öğrencisi olan Adam Coleman, laboratuvarda rutin olarak yaptığımız mikroenjeksiyon yoluyla kenelerin yapay enfeksiyonu prosedürünü gösterecek. Mikroenjeksiyondan sonra, keneyi inceleyeceğiz ve konfokal CE mikroskobu kullanarak kene bağırsağındaki bakterileri görüntüleyeceğiz.

Doğal enfekte kenelerin bir neslinin kene mikroenjeksiyonunun ana avantajı, prosedürün süresidir. Mikroenjeksiyon, doğal beslenme süreci ile enfekte kenelerin oluşması için yaklaşık beş hafta gerektiğinden, tüm prosedürü haftalarca kısaltır. Bu teknik aynı zamanda, RNAi için çift sarmallı RNA veya kene içindeki spesifik antikor girişimi için antiserumlar gibi diğer yararlı reaktifleri enjekte etmek için de uyarlanabilir.

Başlamak için, bir cam mikropipet çekme cihazında bir milimetre cam kılcal tüpleri ısıtıp çekerek birkaç mikroenjeksiyon iğnesi üretin. Kırılgan kılcal boruları dikkatlice çıkarın. Havuzlanmış iğneleri, ucu yukarı bakacak şekilde bir Petri kabında yapışkan bant üzerinde saklayın.

Ardından, BSK kültüründe b berg de ferry'yi büyütün. 10 dakika boyunca 3000 kez G'de santrifüjleme ile mililitre pelet başına yaklaşık 10 ila yedi hücre arasında bir konsantrasyona kadar. Oda sıcaklığında, snat'ı çıkarın ve 200 mikrolitrelik steril bir mikro uçtan mililitre başına 10 ila dokuz hücrelik bir nihai konsantrasyona nazikçe geçirerek peleti BSK ortamında tamamen yeniden süspanse edin.

Hücreler yüksek hücre yoğunluğunda yeniden süspanse edildiğinden ve bir araya toplanabildiğinden, hücre süspansiyonu keneleri hazırlamak için mikroenjeksiyon için hemen kullanılmalı, yapışkan bir mat üzerinde çalışan bir cam slayt üzerine şeffaf çift taraflı yapışkan bant yerleştirin, keneleri dikkatlice çıkarın Küçük bir fırça kullanarak, enjekte edilecek gerekli sayıda keneyi ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yapışkan bant üzerine yerleştirin. Beberg de ferry kültüründen beş mikrolitreyi havuzlanmış kılcal iğneye yükleyin. 20 mikrolitrelik mikro pipet ucu kullanarak, iğnede sıkışmış hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin ve iğneyi bakteri kültürü ile yeniden yükleyin.

Gerekirse, keneyi diseksiyon dürbün mikroskobu altında görüntüleyin ve kenenin anal açıklık alanına odaklanın. Mikroenjeksiyon iğnesini oluşturan kenenin anal açıklığından biraz daha küçük olan tüpü kırmak için kılcal iğnenin ucuna hafifçe dokunun. Bu adım, uygun olmayan iğne uçları olan keneleri enjekte etmeye yönelik herhangi bir girişimin yaralanmaya ve olası ölüme neden olması nedeniyle kritiktir.

Enjekte edilen kene. Hareketsiz hale getirilmiş keneleri diseksiyon binoküler mikroskobunun altına yerleştirin ve iki hareketli anal plaka ile kaplı olan anal açıklığa odaklanın. İnce forseps kullanarak, anal açıklığa yakın herhangi bir alana hafifçe dokunun ve çok hafif bir basınç uygulayın.

Bu, anal plakaların ayrılmasına ve bağırsağa bağlanan anal gözeneğin açılmasına izin verecektir. İğnenin ucunu, anal plakaların zorla açılmasından anal açıklığa dikkatlice hafifçe sokun. Cam uç rektuma bağlanan yarı saydam arka bağırsağa zarar verebileceğinden iğne girişi minimumda tutulmalıdır.

Otomatik ayak kumandası ile donatılmış bir mikro enjektör kullanarak, aşağıdaki parametreleri kullanarak beberg de ferry solüsyonu enjekte edin. 1000 Hektor Paskal enjeksiyon basıncı, 0.2 saniye enjeksiyon süresi ve sekiz Hector Pascal'ın dengeleme basıncı. Her kene, mikroenjeksiyonu takiben tek bir enjeksiyon alır.

Kene, enjeksiyondan öncekine benzer uyaranlara yanıt olarak hareket veya sürünme belirtileri göstermelidir. İmmünofloresan mikroskobu için keneleri incelemek için, önce diseksiyon için temiz bir cam slayt üzerine bir damla fosfat tamponlu salin ve bir poli L lizin kaplı slayt üzerine bir damla yerleştirin Mikroskopi için, çift taraflı yapışkan bantlı başka bir cam slayt hazırlayın. Ardından, keneyi kaptan çıkarın ve çift taraflı yapışkan bant üzerine yerleştirin.

Diseksiyon mikroskobu görünümünün altında küçük bir fırça kullanarak kene üzerine odaklanın, birinci ve ikinci bacak çiftleri arasındaki kenenin üzerine keskin bir tıraş bıçağı yerleştirin. Keneyi iki parça halinde keserek sıkıca bastırın, karnı açığa çıkarın ve hemen ince forseps kullanarak karnı bir PBS damlasına batırın. Kesim bölgesinin etrafındaki dorsal ve ventral dış iskeleti tutun.

Sırt kalkanını dikkatlice yukarı ve keneden uzağa çekin ve kahverengimsi renkli bağırsak divertikülerini açığa çıkarın. Diseksiyon kenelerini her zaman PBS'nin altında tutmaya dikkat edin. Yarı saydam tükürük bezi demetleri, bağırsağın ön bölgesinin her iki yanında bulunur ve istenirse bu noktada çıkarılabilir.

Kalan dış iskeleti forseps ile yerinde tutarak, bağırsağı dikkatlice karından dışarı çekin. Trakia gibi sıkışmış dokuları çıkararak bağırsakları dikkatlice temizleyin. İnce forsepslerin ucunu kullanarak, kene bağırsağını bir poli L lizin cam slayt üzerinde bir PBS damlasına hızlı bir şekilde aktarın.

İnce bıçaklar kullanarak veya ince forsepslerin ucuyla hafifçe bastırarak bağırsağı daha küçük parçalara ayırın. Bağırsak dokularının etrafındaki fazla PBS'yi dikkatlice aspire edin. Bağırsak dokularının oda sıcaklığında kurumasına izin verin.

Kene bağırsağını 10 dakika boyunca asetona batırarak düzeltin. Havada kurumasına izin verin, oda sıcaklığındaki slaytlar bu adımda hava geçirmez bir kapta eksi 20 santigrat derecede aylarca saklanabilir. Bağırsakların immünofloresan etiketlemesi için, bir pap kalem veya başka bir hidrofobik bariyer astar cihazı ile sabit kene bağırsağının etrafına bir daire çizin.

Bu, sonraki inkübasyon adımları sırasında boyama çözeltilerinin korunmasına yardımcı olacaktır. Kene bağırsağını 30 dakika boyunca bir veya birkaç damla engelleme tamponu ile örtün. Oda sıcaklığında.

Bloke etmek için kullanılan serum, antikor için konakçı hayvanın kaynağına bağlıdır. Bu noktadan itibaren sürgünün kurumasına izin vermeyin. Engelleme tamponunu yavaşça aspire edin.

Bağırsakları uygun birincil ve/veya ikincil antikor çözeltileri ile inkübe edin. Floresein, izotiyosiyanat veya FXI etiketli anti B berg kullanıyoruz. Antikoru bir saat boyunca bloke edici tamponda bir ila 100 seyreltmede erteleyin.

Oda sıcaklığında, ışığa maruz kalmayı sınırlamak için kabı alüminyum folyo ile örtün. Antikor çözeltisini hafif aspirasyon ile çıkarın. DPI veya propidium iyodür gibi kene dokularını etiketlemek için bağırsağı bir floresan boya ile inkübe edin.

Normalde oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBS'de mililitre peridyum iyodür başına 20 mikrogram kullanırız, PBS'de beş dakika boyunca% 0.05 ile 20 arasında üç kez yıkarız. Son olarak, slaytı bir Antifa reaktifi içeren tamponlu gliserol içine monte edin ve dikkatlice bir cam kapakla örtün. Kayma slaytları bu aşamada birkaç ay boyunca hava geçirmez bir kap görüntüsünde dört santigrat derecede saklanabilir ve konfokal mikroskop altında lokalize b berg de ferry'de saklanabilir.

Burada görünürlük için parlak mavi kumasi ile doldurulmuş bir iğne ile bir kene mikroenjeksiyonu gösterilmektedir. İnce forsepsler vücuda hafif bir basınç uygulamak için kullanılır, bu da anal plakaların ayrılmasına ve mikroenjeksiyon için anal gözeneğin açılmasına izin verir. Burada, bir bağırsak divertikülünün ön bölgesi, bağırsak içinde beberg ferry ile gösterilmiştir.

Bağırsak çekirdekleri ve spiroketler sırasıyla propidyum iyodür veya fitzy konjuge anti beberg feribotu ile etiketlenir. Bir kez ustalaştıktan sonra, 10 kenenin doğal olarak yüz bin kişinin hayatta kaldığı ve fer ile enfekte olduğu mikro enjekte edilmiş güç olabileceğini bulduk. Keneler diğer deneyler için hemen kullanılabilirken, devam etmeden önce kenelerin prosedürden kurtulduğundan emin olmak için genellikle bir veya iki gün bekleriz.

Bu videoyu izledikten sonra, konfokal immün akımları kullanarak kene bağırsağında mikro ve lokalize bariyer böceği ile yapay enfekte kenelerin nasıl oluşturulacağını iyi anlamalısınız. Mikro: Keneler ve brelia brior yavrusu gibi bir insan patojeni ile doldurulmuş ince cam iğnelerle çalışmak, çalışırken tehlikeli olabilir. Kenelerin ve iğnelerin yerlerinin bilincinde olun ve her zaman biyogüvenlik seviye iki önlem alın.

İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.