Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Yaşayan hayvanların bakteriyel enfeksiyonlar biyoparlaklık görüntüleme yöntemleri açıklanmıştır. Patojenler, canlı hayvanlarda enfeksiyon optik tüm vücut görüntüleme sağlayan lusiferaz ifade etmek için modifiye edilmiştir. Hayvan modelleri lusiferaz ifade patojenler ile enfekte olan ve hastalık ortaya çıkan ders biyoparlaklık görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak görüntülenebilmekte.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, enfekte edici organizmanın konakçı dokular ve organlar içinde lokalizasyonuna izin verebilecek canlı hayvanlarda bir enfeksiyonun kantitatif bir görüntüsünü elde etmektir. Anestezi uygulanmış fareler ilk olarak intratrakeal olarak biyolüminesan bakterilerle enfekte edilir. Enfekte farelere daha sonra Luciferian enjekte edilir, bu da IVIS sisteminde canlı görüntülemenin yapılmasına izin verir.

Tüm vücut görüntüleri elde edildikten sonra, enfekte akciğerler toplanır. İzole edilen organların görüntülenmesi, patojenin gerçek lokalizasyonunu göstermek için yapılabilir. Görüntülemeyi takiben, akciğerler homojenize edilir ve mikrobiyal yükün niceliğini belirlemek için bakteri üreme ortamı üzerine seyreltme kaplanır.

Sonuç olarak, konakçı içinde bulunan patojenlerin yerini ve sayısını gerçek zamanlı olarak gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin mevcut yönteme göre en büyük avantajı, patojenlerin canlı hayvanlarda gerçek zamanlı görüntüleme ile görselleştirilebilmesi ve izlenebilmesi, mikrobiyal enfeksiyonun mekansal tikleri hakkında bilgi vermesidir. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımda doktora sonrası bir araştırmacı olan Dr.Mihi Chang ve laboratuvarımda bir araştırmacı olan SWAT Cillo olacaktır.

İntraperitoneal ile başlayın, altı ila 12 haftalık valf C farelerine, fare ağırlığının gramı başına 100 mikrogram ketamin ve 10 mikrogram ksilazin içeren önceden karıştırılmış bir anestezik solüsyon enjekte edin. Anestezik etkisini gösterene kadar fareleri kafeslerine geri koyun. Anestezinin tamamlanıp tamamlanmadığını belirlemek için, her farenin ayak pedini sıkın ve pedal refleks reaksiyonunun oluşmadığından emin olun.

Hayvanlar tamamen uyuşturulduktan sonra, bir fare alın ve entübasyona yerleştirin. Sırt üstü yatarak durun. Farenin bacaklarını ve kollarını standa sabitlemek için bant kullanın.

Entübasyon standına bir lastik bant sabitleyin. Ardından farenin üst kesici dişlerinin altına yerleştirin. Fare hareketsiz hale geldiğinde, dili ağızdan nazikçe çekmek için forseps kullanın.

Daha sonra, spekulumu otoskop ile farenin ağzının içine nazikçe yerleştirin ve orofarenksin ventral tarafında yemek borusunun önünde bulunan gırtlak açıklığını bulun. Larinks açıklığı tanımlandıktan sonra, kateter göbeği kesici dişlere ulaşana kadar trakeaya bir kılavuz tel içeren 22 gauge bir inçlik bir kateter yerleştirin. Kılavuz teli çıkarın ve kateteri plastik pompaya bağlayın.

Ardından havayı kateterin içine itin. Entübasyon doğruysa farenin göğsü şişer. Kateterin doğru yerleştirildiği onaylandıktan sonra, istenen konsantrasyonda 50 mikrolitre biyolüminesan bakteri solüsyonunu katetere pipetleyin ve solüsyonu farenin akciğerlerine itmek için 50 mikrolitre hava ile bir mililitrelik bir şırınga takın.

İki veya üç kez, kateteri çıkarın ve anesteziden kurtulması için fareyi kafesine geri yerleştirin. Biyolüminesans görüntülemeyi gerçekleştirmeden önce, fareleri izofluran kullanarak uyuşturun. Fareler tamamen uyuşturulduktan sonra, onları indüksiyon odasından çıkarın ve hayvanın gözlerini korumak için hafifçe optik merhem sürün.

Görüntüleme sırasında, fareleri anestezi manifoldundaki burun konilerinin her birine ve birer birine görüntüleme odasına yerleştirin. Bitişik hayvan denekler arasındaki ışığın yansımasını önlemek için fareler arasında bir ışık bölmesi kullanın. Son olarak, her fareye Lucifer'in vücut ağırlığının gramı başına 150 mikrogram intraperitoneal enjekte edin.

Lucifer'in 10 dakika boyunca hayvanın vücuduna dağılmasına izin verin. Sonra görüntülemeye başlayın. Canlı görüntüleme yazılımını başlatın ve IVIS görüntüleme sistemini başlatın.

Önce parametreleri ayarlamak için sıra kurulumuna tıklayın. Ardından lüminesans ve fotoğraf görüntüleme modunu seçin. DLIT 3D rekonstrüksiyonunu etkinleştirmek için görüntü dizisinin bir parçası olarak fotoğrafik, ışıldayan ve yapısal ışık görüntülerini seçin.

Ardından, pozlama süresini bir dakikaya ayarlayın. Ardından gruplamayı orta seviyeye ve F-stop'u bire ayarlayın. Uyarma filtresini bloke edecek şekilde ayarlayın ve emisyon filtrelerini 3D rekonstrüksiyon için açacak şekilde ayarlayın, farklı dalga boylarında birden fazla filtreyi etkinleştirin.

Sinyal kaynağının doğru lokalizasyonuna izin vermek için, görselleştirilen fare sayısına karşılık gelen FOV'u seçin. Tüm ayarlar tanımlandıktan sonra, dizi kurulumunu eklemek için alım kontrol panelindeki görüntü sihirbazında ekle'ye tıklayın ve çekim sırasında görüntüleme sekansını başlatmak için edin'e tıklayın. Görüntü düzenle penceresinde deneysel ayrıntıları ve koşulları kaydedin ve görüntüleri kaydedin.

Son olarak, fareleri görüntüleme odasından çıkarın ve kafeslerine geri koyun. Anesteziden iyileşene kadar hayvanları sürekli izleyin. Doku görüntüleme için farelere insancıl bir şekilde ötenazi yapın.

Bu noktada, her farenin akciğerlerini aseptik olarak toplayın ve organları steril bir petri kabına aktarın. Enfekte akciğerleri içeren Petri kabını görüntüleme odasına yerleştirin ve bu videoda daha önce anlatıldığı gibi biyolüminesans görüntüleri elde edin. Görüntüler elde edildikten sonra, Petri kabını görüntüleme odasından çıkarın ve steril forseps kullanarak, akciğerleri bir homojenizatör kullanarak bir mililitre steril PBS içeren bir tüpe aktarın ve akciğerleri iki ila beş dakika homojenize edin.

Steril PBS'de akciğer homojenatlarının seri seyreltmesini hazırlayın. Daha sonra, her seyreltmeden 100 mikrolitreyi seçici ortam içeren Petri kaplarına koyun. Bakteri kolonileri açıkça görünene kadar kültürleri 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ardından enfeksiyon seviyesini değerlendirmek için CFU'yu sayın. Canlı görüntü yazılımını başlatın ve istediğiniz görüntü dosyalarını dosya tarayıcısından açın. Araç paletinde.

Düzeltme ve filtreleme ayarlarının yanı sıra renk ölçeği eşiklerini değiştirmek için görüntü ayarına tıklayın. Lüminesans yoğunluğunu ölçmek için, açılır listeden ilgilenilen bölgeyi veya ROI araçlarını kullanın, ROI şekil numarasını ve boyutunu seçin. Ardından ROI ölçümüne tıklayın ve 3D görüntüleri yeniden oluşturmak için nicel veri çıktısını kaydedin.

İlk olarak, yapılandırılmış ışık görüntüleri de dahil olmak üzere görüntü dizisini yükleyin. Araç paletinde yüzey topografyasına tıklayın. Ardından, açılır listede, bir yüzey topografyası oluşturmak için yeniden yapılandır sekmesini seçin.

Ardından, araç paletinden DILT 3D rekonstrüksiyonunu seçin. Açılır listedeki özellikler sekmesine tıklayın ve doku özelliklerini ve kaynak spektrumunu kas olarak ayarlayın. Analiz sekmesine tıklayın ve analiz için dalga boyunu seçin.

Ardından başlat'a tıklayın. Tüm ayarlar yapıldıktan sonra, 3D analizi başlatmak için yeniden yapılandır'a tıklayın. 3D rekonstrüksiyon tamamlandığında, sonuçlar sekmesine tıklayarak sonuçları görüntülemek için 3D görünümü seçin, foton yoğunluğu, veri vokselleri ve algoritma parametreleri görüntülenebilir, sonuçları kaydedebilir ve daha fazla analiz için verileri ve görüntüleri dışa aktarabilir.

Bu şekilde gösterildiği gibi, sağdaki 10 ila altıncı CFU biyolüminesan bakteri ile intratrakeal olarak enfekte olmuş iki fare, pulmoner bölgeden güçlü bir sinyal üretirken, soldaki enfekte olmamış fare üretmez. Benzer bir analiz: Sadece enfekte farelerden disseke edilmiş akciğerlerin kullanılması, lüminesansın diğer bazı yakın yan yana dokulardan ziyade akciğerlerden yayıldığını doğrular. Numuneden yayılan sinyal, ilgilenilen bir bölgedeki toplam akı olarak kolayca ölçülebilir.

Bir tomografi analizi, bu görüntülerde kırmızı kutular olarak görüntülenen lüminesansın konumunun, 3D rekonstrüksiyon ile belirlenen farenin akciğerlerini içeren alan içinde kaldığını doğrular. Son olarak, solda ölçülen foton yoğunluğu eğrisi ile sağdaki simüle edilmiş foton yoğunluğu eğrisi arasındaki benzerlik, rekonstrüksiyonun iyi kalitesini kanıtlamaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, emsal ile enfekte olmuş hayvanların nasıl görüntüleneceğini iyi anlamalı ve görüntüleri hatıraların yerelleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için analiz etmelisiniz.