Name: Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Öğrenin farelerde biyolüminesans görüntüleme ile bakteriyel enfeksiyonları canlı olarak izleme yöntemini. Bu teknik, patojenlerin akciğerlerdeki lokalizasyonunu ve enfeksiyon dinamiklerini gerçek zamanlı analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu çalışma boyunca değerli tartışmalar ve yardım için Cirillo laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Biz bu protokolün çekimler sırasında Dr Joshua Hill ve Dr James Samuel laboratuvar yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Bill &amp; Melinda Gates Vakfı ve hibe AI47866 hibe 48.523 tarafından finanse edildi.

1. Intratrakeal Entübasyon tarafından Akciğer Enfeksiyonu <ol><li> Fareler tartılır ve isteğe bağlı olarak, işaretleri kulaklara kolay tanımlanması için yapılabilir. </li><li> Intraperitoneal inokülasyon ile fareler anestezi ketamin (g fare kilo başına 100 mikrogram) ve xylazine (farenin ağırlığının gramı başına 10 mikrogram). </li><li> Tam anestezi kadar kafeslere yerleştirin fareler. Pedal refleks kontrol etmek için onların ayak pedleri sıkıştırın. Fare azaltılmış ya da herhangi bir refleks reaksiyon göstermesi gerekir. </li><li> Sırtında uzanan entübasyon standı üzerinde fare yerleştirin. </li><li> Entübasyon durmak için bir lastik bant saptamak ve sonra farenin üst kesici dişlerin altına koyun. Entübasyon standı üzerine bacaklar ve kollar düzeltmek için bant kullanın. </li><li> Forseps kullanarak ağız hafifçe dışarı tougue taşıyın. </li><li> Ağız içinde octoscope spekulum yerleştirin ve gırtlak açılması görülene kadar orofarinks içine bakmak. </li><li> Catether hub kadar trakea içine kateteri ile kaplı Advance kılavuz tel kesiciler. Kılavuz teli çıkarın. Göğüs genişlemesi gözlemlemek ve doğru entübasyon onaylamak için, kateteri içine hava koyun. </li><li> 50 mcL bakteriyel 1 ml şırınga kullanarak kateteri yoluyla çözüm (Bacillus Calmette Guerin (BCG) laboratuvarında inşa tıklayın böceği kırmızı lusiferaz (CBRLuc), ifade kullanılır, ancak herhangi bir ışıldayan bakteri suşunun kullanılabilir gösterilir görüntüleri) enjekte edilir. </li><li> Fare bir kafes yerleştirin ve anestezi kurtarma sırasında gözlemlemek. </li></ol> 2. Hayvan Anesthetization ve Biyoparlaklık Görüntüleme Hazırlık Fareler XGI-8 Gaz Aneshesia Sistemi kullanılarak izofluran anestezisi. <ol><li> XGI-8 anestezi sistemi çalıştırmadan önce, her bir kömür filtre spreyi tartmak ve ağırlığı ve tarih yazmak. 50 gram ağırlığı başlangıç ​​ağırlığının üzerinde ise, yeni bir teneke kutu ile değiştirin. </li><li> Buharlaştırıcı izofluran seviyesini kontrol edin ve gerekirse doldurun. </li><li> XGI-8 anestezi sistemi ön tahliye pompası açın ve 8 lpm (minuite litre) olarak ayarlanır. </li><li> , Yüksek basınçlı silindir oksijen kaynağı açın ve 55 psig olarak ayarlayın. </li><li> XGI-8 anestezi sistemi ön geçiş oksijen (yeşil) açın. </li><li> Gaz akışı seviyesini ayarlamak için görüntüleme odasına gaz akışını açın. 0.25 lpm ayarlayın ve ardından gaz akışı kapatın. </li><li> Gaz akışı seviyesini ayarlamak için anestezi indüksiyonu odasına gaz akışını açın. 1.5 lpm ayarlayın ve ardından gaz akışı kapatın. </li><li> Buharlaştırıcı ve yüzde 2-2.5 seti ile izofluran açın. Izofluran düzeyde kullanılan hayvanların ve kilo sayısına bağlı olarak ayarlanabilir. </li><li> Indüksiyon odasına fareler koyun ve kapağını kapatın. Indüksiyon odasına gaz akışını açın. 5 oda yerleştirin fareler - 10 minuites tamamen uyutmak kadar. </li><li> Gözlerin optik fare görüntüleme sırasında gözleri korumak ve görüntüleme odasında fareler anestezi manifoldunun üzerine burun konileri biri yere merhem sürün. Fareler arasındaki ışık baffle bitişik hayvan konular üzerine ışık yansımalarını önlemek için kullanın. </li><li> Intraperitoneal inokülasyon ile luciferase (150 mikrogram / gram vücut ağırlığı) enjekte edilir. </li></ol> 3. Biyoparlaklık Görüntüleme <ol><li> Yaşayan Görüntüleme Yazılımı başlatın. </li><li> Sistemi başlatılmadı ise, IVIS Görüntüleme sistemi başlatmak. </li><li> IVIS satın alma kontrol paneli sıra kurulum tıklayarak görüntüleme parametreleri ayarlayın. Görüntüleme Modu lüminesans ve fotoğraf seçin. DLIT 3D rekonstrüksiyon yürütmek için seçenek istenirse, görüntü dizisinin bir parçası olarak, fotoğraf, parlak ve yapısal ışık görüntüleri seçin. Pozlama süresi 0.5 saniye ile 10 dakika arasında ayarlayın. Set binning ve F / örnek beklenen parlaklık dayalı duracaktır. Sadece belirli dalga boylarında ışık elde etmek için planlama sürece, açmak için blok ve filtre emisyon filtre uyarma ayarlayın. DLIT 3D anayasa durumda, farklı dalga boylarında birden fazla emisyon kaynağı doğru lokalizasyon izin filtreleri ayarlayabilirsiniz. Fare ya da hayvan bölgeye yansıması sayısına göre A'dan D'ye kadar FOV ayarlayın. 4-5 fareler için 1 fare, C ve D 2-3 fareler için A ve B seçin. </li><li> Resim Sihirbazı, Kazanç Kontrol Paneli sıra kurulum eklemek için ekle düğmesine tıklayın. </li><li> Elde tıklayarak görüntüleme sırası başlayın. DLIT 3D inşaat halinde, Işıklı görüntüler, farklı dalga boylarında birden fazla emisyon filtreler için alınacaktır. Fotografik ve yapılandırılmış ışık görüntüleri de kazanılmış olacaktır. </li><li> Satın alma sırasında görüntü ve görüntü seviyeleri paneller düzenlemek görünür olacaktır. Sonraki zamanlarda görüntüleri kolay takibi sağlamak ve görüntüleri kaydetmek için resim düzenleme her bir deney için mümkün olduğunca ayrıntılı bilgi olarak doldurun. </li><li> IVIS görüntüleme odasının fareler ReRemove ve onları kendi kafeslerine geri. Bir kurtarma dikkatfareler sağlamak için esthesia yordam tarafından önemli ölçüde etkilenmemiştir. Hayvanlar sürekli tam anestezi kurtarmak (genellikle 1-2 dakika) kadar izlenmelidir. </li></ol> 4. ex vivo Görüntüleme ve Akciğerler Bakterilerin Niceleme CFU Analizi <ol><li> Ötenazi hemen önce, görüntüleme için aynı şekilde luciferase intraperitoneal farelere enjekte edilir. </li><li> Luciferase enjeksiyondan sonra 100 mg / kg pentobarbitol 5 dakika intraperitoneal fareler Euthanize. </li><li> Steril forseps ve makas kullanılarak steril Petri-yemekleri fareler ve yerden akciğerlere Eksplant. </li><li> Yeri Petri yemek görüntüleme odasında eksplante organı içeren ve tüm fare için aynı şekilde biyoparlaklık görüntüler elde. </li><li> Görüntüleme sonra, steril forseps kullanılarak petri eksplante organı kaldırmak ve 1 mL PBS içinde homojenize. </li><li> Dilüsyonları ve plaka dokusu uygun seçici besiyerleri olun. Homojenize doku yeniden kaplama için gerekli olmalıdır -80 ° C saklanabilir. Alternatif olarak, homojen doku RNA veya DNA ekstraksiyonu qPCR bakteri sayıları ölçmek için kullanılabilir. </li></ol> 5. Lüminesans Görüntüleme Analizi <ol><li> "Yaşayan Görüntüleme Yazılımı" Başlat ve görüntü dosyalarını taramak. </li><li> Görüntüleri ayarlamak için "Aracı Paleti 'kullanın. Görüntü düzeltme / ayarlar ve ayrı renk ölçekler için min / max filtreleme değiştirmek için tıklayın ayarlayın. </li><li> Işık şiddetinin ölçülmesi için açılan listesinde ROI araçlarını kullanın. ROI şekli seçin, sayısı ve boyutu. Drag ROI resmin üzerine ilgi bölgeye çerçevesi. Tüm yatırım getirisi aynı boyut ve şekil olduğundan emin olun. Tıklayın yatırım getirisini ölçme ve kaydetme, kopyalama ve / veya nicel veri ihracat. </li><li> DLIT 3D rekonstrüksiyonlar durumunda, yapısal ışık görüntü de dahil olmak üzere görüntü sırası yükleyin. Platte Aracı yüzey topoğrafyası tıklayın. Açılan listesinde, yüzey topoğrafyasını oluşturmak için yeniden yapılandırma sekmesini tıklatın. Bir yüzey karışıklık sonra pencerede görünecektir. </li><li> Aracı Platte DLIT 3D rekonstrüksiyon seçin. Açılan listesinde, doku özellikleri ve kaynak spektrumu ayarlamak için Özellikler sekmesini tıklatın. Kas, pek çok koşulda tavsiye edilir. Analiz için dalga boyu seçmek için açılan listesinde, analiz sekmesini tıklatın. Parametre sekmesini tıklatın ve varsayılan değerleri onaylamak veya gerekirse DLIT parametrelerini ayarlamak. 3D analiz başlatmak için Yeniden İnşa sekmesini tıklayın. </li><li> 3D rekonstrüksiyon bittiğinde, 3D görünümü 3 boyutlu rekonstrüksiyon sonuçları gösterecektir. Foton yoğunluğu, vokseller ve DLIT algoritma parametreleri için analiz verileri görmek için sonuçları sekmesine tıklayın. </li><li> Kaydet ve / veya 3 boyutlu rekonstrüksiyon analizlerin sonuçları ihracat rakamları ve veri dosyalarının içine. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Bulaşmamış bir fare kontrolü ile birlikte bioluminescent bakteri ile enfekte farelerde biyoparlaklık görüntüleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Bioluminescent bakteri ile enfekte farelerde pulmoner akciğerler (Şekil 1) önemli bir sinyal üretir. Lüminesans yoğunluğu içinde toplam akı bir yatırım getirisi (ilgi bölgesi) (Şekil 2) olarak belirlendi. Işık şiddeti için nicel veri sinyal bioluminescent bakteri elde edilir ve negatif kontrol ile karşılaştırıldığında onaylamak için akciğerlere elde edilen bakteri koloni oluşturan birim (CFU) için normalize. Sinyal konumu ve yoğunluğu daha da fare yüzeyinin 11 tomografi lüminesans kaynak DLIT 3D rekonstrüksiyon ile analiz edilebilir. Bu analizler, üretilen bioluminescent sinyal ölçümlerini ve lokalizasyonu izin verir. Işıklı enfekte farelerde kaynağı 3D rekonstrüksiyon sonuçları o ışık fare akciğerler (Şekil 3) elde edilir göstermektedir. Bu lüminesans teyit çıkan fare akciğerlerin ex vivo görüntüleri oldukça yakından yan yana bazı diğer doku ya da organ (Şekil 2C) daha akciğerlere yayılan. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. CBRluc tagged with bioluminescent bakteriler ile pulmoner bulaşmış farelerin Lüminesans görüntüleme. Bulaşmamış kontrolü fare solda ve sağda iki enfekte olmuş fareler vardır. Fareler intratrakeal yolla CBRluc (n = 2) ifade bakteri ile enfekte edildi. Sırt, karın, sol tarafında ve sağ tarafında luciferase enjeksiyondan sonra 10 dakika, 4 pozisyon az 10 dakika lüminesans görüntüleri elde edildi. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. CBRluc ifade bakteri ile enfekte farelerden alınan kantitatif ışık şiddeti (A, B) ROI analizi ve dorsal ve ventral pozisyonda ROI ışık sayısal toplam akı Lüminesans görüntüleri, sırasıyla. Bulaşmamış fareler solda ve sağda iki enfekte olmuş fareler vardır. Akciğerler o Lüminesans görüntüler elde edilmiştirf fareler bulaşmamış CBRlux ile enfekte (n = 2). Akciğerler etrafında ışık yoğunluğu ROI analizi ile belirlendi. C) bulaşmamış (üstte) ve enfekte (alt akciğerlerin iki takım) farelerden alınan akciğerlerin ex vivo görüntüleri. Sonra önce ötanazi ve görüntüleri elde edildi luciferase 5 miniuts enjekte edildi. CFU sayısal değerler normalize edilir. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Pulmoner enfekte fare biyoparlaklık kaynak (lar) 3D rekonstrüksiyon fare CBRluc intratrakeal enjeksiyon yoluyla ifade bakteri ile enfekte oldu. Görüntü sırası seri 540 nm ila 700 nm dalga boylarında farklı emisyon filtreler kullanılarak elde edilmiştir. Bir görüntü dizisi lüminesans kaynağı için yapılandırılmış bir imag içeren hayvan konularda 3D sulandırıldıktan için kullanılmıştır. A) fare tomografi farklı pozisyonlarda gösterilen: ön, arka, sağ ve sol. Işık kaynakları, yeniden yapılanma tarafından belirlendiği gibi akciğer içinde yer vokseller (3D fare içinde kırmızı kutu) olarak gösterilir. B) ölçülen ve simüle edilmiş veri Foton densiy harita. Ölçülen ve simüle foton yoğunluğu eğrileri yeniden inşa kalitesi bilgi vermek karşılaştırılması. Benzer ölçülen ve simüle foton yoğunlukları kaliteli rekonstrüksiyonlar sonucudur.

<ol><li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).</li>
<li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).</li>
<li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).</li>
<li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li>
<li>Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+DNA+coding+click+beetle+luciferases+can+elicit+bioluminescence+of+different+colors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors.</a> Science. 244, 700-702 (1989).</li>
<li>Wet, J. R. de, Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+firefly+luciferase+cDNA+and+the+expression+of+active+luciferase+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).</li>
<li>Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistries+and+colors+of+bioluminescent+reactions%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review.</a> Gene. 173, 5-11 (1996).</li>
<li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).</li>
<li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li>
<li>Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li>
<li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).</li>
<li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).</li>
</ol>

Hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar, Texas A &amp; M Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı.

Bu protokoller genellikle yüksek kaliteli görüntüler neden olmakla birlikte, bu görüntüleme çalışmalarından elde edilen doğru ve tutarlı verilerin elde etmek için birkaç temel sorunları dikkate almak önemlidir. Lüminesans görüntü sinyali arka plan üzerinde ve kamera doymuş değildir sağlamak için 600 ila 60.000 sayımlar elde edilmelidir. Elde edilen sinyal 600 den az ise maruz kalma koşullarını sayımı artırmak için ayarlanabilir olmalıdır. 60.000 &#39;den fazla elde edilen sinyal ise, bazı bölgelerde kamera doymuş yağlar...

<table><tbody><tr><td>İzofluran</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>MP Biomedicals</td><td>158307</td><td></td></tr><tr><td>Lusiferin</td><td>GMT</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal plus solüsyonu</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kateter (22G x 1&amp;#8221;)</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>Kılavuz tel</td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3491</td><td></td></tr><tr><td>Spekulumlu oktoskop</td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3748</td><td></td></tr><tr><td>Xenogen IVIS sistemi</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XGI-8-gaz anestezi sistemi</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canlı görüntüleme yazılımı</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf burun konileri</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Işık yönlendirici bölücü</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

farelerde görüntü bakteriyel enfeksiyonlar lusiferaz kullanımı

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Görüntüleme biyolojik süreçleri izlemek için kullanılan değerli bir tekniktir. Özellikle, kanser hücreleri, kök hücreleri, spesifik immün hücre tipleri, viral patojenler, parazit ve bakterilerin varlığı hayvanlar 1-2 yaşam içinde gerçek zamanlı olarak takip edilebilir. Patojenlerin çalışmaya biyoparlaklık görüntüleme Uygulama 3-4 hayvan modellerinde enfeksiyon analiz için geleneksel stratejiler kıyasla avantajları vardır. Enfeksiyonlar, zamanla patojenin yerini ve miktarını belirlemek için ötenazi gerektirmeden bireysel hayvanlar içinde görüntülenir olabilir. Optik görüntüleme, daha önce enfekte olduğu bilinen sitelerin örnekleme yerine, tüm doku ve organları kapsamlı inceleme sağlar. Buna ek olarak, belirli dokulara aşılama doğruluğunu doğrudan başarısız tüm deney boyunca ekildi önce ileri hayvanları taşıyan belirlenir. Görüntüleme, her hayvan ayrı ayrı takip edilmesi gereken hayvanlar arasında değişkenlik, kontrol edilebilir. Görüntüleme çünkü yeteneği 3-4 patojen yükü belirlemek için örnek dokulara kalmadan birçok noktadan veri elde etmek için gereken hayvan sayısının büyük ölçüde azaltma potansiyeli vardır. Bu protokol, canlı hayvanlarda enfeksiyonlara lusiferaz ifade rekombinant bakteri suşları için biyoparlaklık görüntüleme kullanarak görselleştirmek için yöntemler anlatılmaktadır. Tıklayın böceği (CBRLuc) ve ateşböceği luciferases (FFluc) bir substrat luciferase 5-6 olarak kullanmaktadır. CBRluc ve FFluc tarafından üretilen ışık, canlı hayvan modelleri 7-9 optik görüntüleme için bu luciferases mükemmel gazetecilere, 500 nm&#39;den 700 nm&#39;ye kadar geniş bir dalga boyu vardır. 600 nm&#39;den daha fazla ışık dalga boyu, hemoglobin tarafından emilimini önlemek ve böylece verimli memeli doku yoluyla seyahat etmek gereklidir, çünkü bu öncelikle. Lusiferaz genetik ışık sinyali üretmek için 10 bakteri girmiş. Fare akciğer enfeksiyonları gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak intratrakeal bioluminescent bakteri inoküle. Luciferase enjeksiyondan sonra, görüntüler IVIS Görüntüleme Sistemi kullanılarak elde edilir. Görüntüleme sırasında, fare XGI-8 Gaz Anethesia Sistemi kullanılarak izofluran anestezisi. Görüntüler, yerelleştirme ve sinyal kaynağını, sırasıyla, bakteriyel enfeksiyon site (ler) ve sayı temsil eden ölçmek için analiz edilebilir. Görüntüleme sonra, CFU belirlenmesi bakteri varlığını doğrulamak için homojenize dokusu üzerinde yapılır. Bakterilerin çeşitli dozlarda lüminesans bakteri sayısı ilişkilendirmek için kullanılır. Görüntüleme patogenezi ve antibakteriyel bileşikler ve aşıların etkinliğini değerlendirme çalışması yapılabilir.

Yaşayan hayvanların bakteriyel enfeksiyonlar biyoparlaklık görüntüleme yöntemleri açıklanmıştır. Patojenler, canlı hayvanlarda enfeksiyon optik tüm vücut görüntüleme sağlayan lusiferaz ifade etmek için modifiye edilmiştir. Hayvan modelleri lusiferaz ifade patojenler ile enfekte olan ve hastalık ortaya çıkan ders biyoparlaklık görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak görüntülenebilmekte.

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Görüntüleme, biyolojik süreçleri izlemek için kullanılabilecek değerli bir tekniktir. Özellikle kanser hücrelerinin, kök hücrelerin, spesifik...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, konak dokular ve organlar içinde enfeksiyona neden olan organizmanın lokalizasyonuna olanak tanıyan, canlı hayvanlardaki bir enfeksiyonun kantitatif görüntüsünü elde etmektir. Anestezi uygulanmış farelere önce intratrakeal olarak biyolüminesans bakteriler enfekte edilir. Enfekte edilen farelere daha sonra, IVIS sisteminde canlı görüntülemenin gerçekleştirilmesini sağlayan Luciferian enjekte edilir.Tüm vücut görüntüleri elde edildikten sonra, enfekte akciğerler hasat edilir. Patojenin gerçek lokalizasyonunu göstermek için izole edilen organların görüntülemesi yapılabilir. Görüntülemenin ardından akciğerler homojenize edilir ve mikrobiyal yükün miktar tayini için bakteriyel büyüme besiyerine dilüsyon plaklaması yapılır.Sonuç olarak, konakçı bünyesindeki patojenlerin konumunu ve sayısını gerçek zamanlı olarak gösteren veriler elde edilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, patojenlerin canlı hayvanlarda gerçek zamanlı görüntüleme ile görselleştirilebilmesi ve izlenebilmesi, böylece mikrobiyal enfeksiyonun mekansal özelliklerine dair içgörü sağlanmasıdır. Bu prosedürü, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr. Mihi Chang ve laboratuvarımdaki araştırmacı SWAT Cillo gösterecektir.İşleme, altı ila 12 haftalık BALB/c farelerine, fare ağırlığının gramı başına 100 µg ketamin ve 10 µg xylazin içeren önceden karıştırılmış bir anestezik solüsyonu intraperitoneal olarak enjekte ederek başlayın. Anestezik etki gösterene kadar fareleri kafeslerine geri yerleştirin. Anestezinin tamamlandığını belirlemek için her farenin ayak tabanını sıkın ve pedal refleks reaksiyonu oluşmadığından emin olun.Hayvanlar tamamen anestezi altındayken, bir fare alın ve entübasyon standına yerleştirin. Fareyi sırt üstü yatırın. Fareyle bacaklarını ve kollarını standa sabitlemek için bant kullanın.İntübasyon standına bir lastik bant sabitleyin. Ardından bandı farenin üst kesici dişlerinin altına yerleştirin. Fare sabitlendikten sonra, dili ağızdan nazikçe dışarı çekmek için pens kullanın.Ardından, otoskoplu spekulumu nazikçe farenin ağzına yerleştirin ve orofarenksin ventral tarafında, özofagusun önünde bulunan larenks açıklığını bulun. Larenks açıklığı belirlendikten sonra, kılavuz tel içeren 22 gauge bir inçlik bir kateteri, kateter göbeği kesici dişlere ulaşana kadar trakeaya yerleştirin. Kılavuz teli çıkarın ve kateteri plastik pompaya bağlayın.Ardından katetere hava basın. İntübasyon doğruysa farenin göğsü şişecektir. Kateterin doğru yerleştirildiği onaylandıktan sonra, istenen konsantrasyondaki 50 µL biyolüminesans bakteri çözeltisini katetere pipetle aktarın ve çözeltiyi farenin akciğerlerine itmek için 50 µL hava içeren bir mL'lik bir şırınga takın.Kateteri iki veya üç kez çıkarıp fareyi, anesteziden ayılmasına izin vermek için kafesine geri yerleştirin. Biyolüminesans görüntüleme yapmadan önce fareleri isofluran kullanarak anesteziye alın. Fareler tamamen anesteziye girdikten sonra, onları indüksiyon odasından çıkarın ve hayvanın gözlerini korumak için nazikçe optik pomad uygulayın.Görüntüleme sırasında, fareleri görüntüleme haznesine ve burun konilerini anestezi manifolduna yerleştirin. Yan yana bulunan hayvanlar arasında ışık yansımasını önlemek için farelerin arasına bir ışık bariyeri yerleştirin. Son olarak, her bir fareye vücut ağırlığının gramı başına 150 mikrogram Lucifer intraperitonal olarak enjekte edin.Lusiferinle işaretli maddenin hayvanların vücudunda 10 dakika boyunca yayılmasına izin verin. Ardından görüntülemeye başlayın. Canlı görüntüleme yazılımını başlatın ve IVIS görüntüleme sistemini kurun.Parametreleri ayarlamak için öncelikle dizi kurulumuna (sequence setup) tıklayın. Ardından lüminesans ve fotoğraf görüntüleme modunu seçin. DLIT 3D rekonstrüksiyonunu etkinleştirmek için görüntü dizisinin bir parçası olarak fotoğrafik lüminesans ve yapısal ışık görüntülerini seçin.Ardından, pozlama süresini bir dakika olarak ayarlayın. Daha sonra binning ayarını orta (medium) seviyeye ve F-stop değerini bir'e getirin. 3B rekonstrüksiyon için farklı dalga boylarında birden fazla filtrenin etkinleştirilmesini sağlamak amacıyla, eksitasyon filtresini blok (block) ve emisyon filtrelerini açık (open) konumuna getirin.Sinyal kaynağının doğru şekilde lokalize edilmesini sağlamak için, görüntülenen fare sayısına karşılık gelen FOV'u seçin. Tüm ayarlar tanımlandıktan sonra, sekans kurulumunu eklemek için görüntüleme kontrol panelindeki görüntüleme sihirbazında ekle'ye tıklayın ve görüntüleme sekansını başlatmak için alım sırasında alım'a tıklayın. Deney detaylarını ve koşullarını görüntüyü düzenle penceresine kaydedin ve görüntüleri kaydedin.Son olarak, fareleri görüntüleme haznesinden çıkarın ve kafeslerine geri koyun. Hayvanları, anesteziden tamamen ayılana kadar sürekli olarak gözlemleyin. Doku görüntüleme işlemi için fareleri insani yöntemlerle ötanazi edin.Bu aşamada, her bir farenin akciğerlerini aseptik olarak toplayın ve organları steril bir petri kabına aktarın. Enfekte akciğerlerin bulunduğu petri kabını görüntüleme haznesine yerleştirin ve bu videonun daha önceki bölümlerinde açıklandığı şekilde biyolüminesans görüntülerini alın. Görüntüler elde edildikten sonra, petri kabını görüntüleme haznesinden çıkarın ve steril pensler kullanarak akciğerleri bir mililitre steril PBS içeren bir tüpe aktarın; ardından bir homojenizatör kullanarak akciğerleri iki ila beş dakika boyunca homojenize edin.Steril PBS içerisinde akciğer homojenatlarının seri dilüsyonlarını hazırlayın. Ardından, her bir dilüsyondan 100 microliters alarak seçici besiyeri içeren Petri kaplarına ekleyin. Kültürleri, bakteriyel koloniler net bir şekilde görünene kadar 37 degrees Celsius sıcaklıkta inkübe edin.Ardından, enfeksiyon seviyesini değerlendirmek için CFU'ları sayın. Living Image yazılımını başlatın ve dosya gezgininden istenen görüntü dosyalarını açın. Araç paletinde.Düzeltme ve filtreleme ayarlarının yanı sıra renk ölçeği eşiklerini değiştirmek için görüntü ayarına (image adjust) tıklayın. Lüminesans yoğunluğunu nicelendirmek için açılır listedeki ilgi alanı (region of interest) veya ROI araçlarını kullanın, ROI şeklini, sayısını ve boyutunu seçin. Ardından, ROI ölçümüne (ROI measurement) tıklayın ve 3D görüntüleri yeniden oluşturmak için nicel veri çıktısını kaydedin.İlk olarak, yapılandırılmış ışık görüntülerini de içeren görüntü dizisini yükleyin. Araç paletindeki surface topography seçeneğine tıklayın. Ardından, açılır listeden yüzey topografyası oluşturmak için reconstruct sekmesini seçin.Ardından, araç paletinden DILT 3D reconstruction seçeneğini belirleyin. Açılır listedeki özellikler (properties) sekmesine tıklayın; doku özelliklerini ve kaynak spektrumunu kas (muscle) olarak ayarlayın. Analiz (analyze) sekmesine tıklayın ve analiz için dalga boyunu seçin.Ardından başlat'a tıklayın. Tüm ayarlar düzenlendikten sonra, 3D analizi başlatmak için yeniden oluştur'a tıklayın. 3D yeniden oluşturma işlemi tamamlandığında, sonuçları görüntülemek için 3D görünüm'ü seçin; sonuçlar sekmesine tıklayarak foton yoğunluğu, veri vokselleri ve algoritma parametreleri görüntülenebilir, sonuçları kaydedin ve daha fazla analiz için verileri ve görüntüleri dışa aktarın.Bu şekilde gösterildiği gibi, intratrakeal olarak 10⁶ CFU biyolüminesan bakteri ile enfekte edilen sağdaki iki fare akciğer bölgesinden güçlü bir sinyal üretirken, soldaki enfekte edilmemiş farede bu durum görülmemektedir. Yalnızca enfekte farelerden alınan diseke akciğerlerin kullanıldığı benzer bir analiz, lüminesansın yakındaki başka bir dokudan ziyade akciğerlerden yayıldığını doğrulamaktadır. Örnekten yayılan sinyal, ilgi bölgesindeki toplam akı olarak kolayca nicelleştirilebilir.Bir tomografi analizi, bu görüntülerde kırmızı kutularla gösterilen lüminesans konumunun, 3D rekonstrüksiyon ile belirlenen fare akciğerlerini içeren alan içerisinde kaldığını doğrulamaktadır. Son olarak, soldaki ölçülen foton yoğunluğu eğrisi ile sağdaki simüle edilen foton yoğunluğu eğrisi arasındaki benzerlik, rekonstrüksiyonun yüksek kalitesini kanıtlamaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, precedent ile enfekte edilmiş hayvanların nasıl görüntüleneceği ve lüminesansın lokalizasyonu ve kantifikasyonu için görüntülerin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

using-luciferase-to-image-bacterial-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bioluminescent Bakteriyel Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Kaynak: Valentine, M. E., ve diğerleri. Pseudomonas aeruginosa'da Çerçeve İçi Gen Silme Mutantlarının Üretilmesi ve Basit Bir Fare Enfeksiyon Modelinde Virülans Zayıflaması Testi. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, farelerde öldürücü ve zayıflatılmış bakteri suşlarının in vivo davranışını görselleştirmek ve karşılaştırmak için biyolüminesans kullanımını göstermektedir. Biyolüminesans bakteri süspansiyonlarının hazırlanmasını ve bunların farelere intraperitoneal enjeksiyonunu özetlemektedir. Öldürücü...

Biyolüminesans Kullanarak Farede Bakteriyel Enfeksiyon Dinamiklerini İzleme

Kaynak: de Vries, C. R. ve ark., Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonunun Gecikmiş Aşılama Modeli. J. Vis. Exp. (2020).Bu video, canlı bir fare modelinde bakteriyel enfeksiyon ilerlemesini izlemek için biyolüminesans görüntüleme tekniğini gösteriyor. LuxABCDE raporlayıcı sistemiyle tasarlanmış patojenik bakteriler, enfeksiyon bölgesinde ışık yayarak metabolik olarak aktif bakterilerin görselleştirilmesini sağlar. Araştırmacılar, fareyi zamanla görüntülemekle, enfeksiyon dinamiklerini...

Farelerde Bakteriyel Enfeksiyonların Biyolüminesans Görüntülemesi

Kaynak: Valentine, M. E. ve diğerleri, Pseudomonas aeruginosa'da Çerçeve İçi Gen Silinme Mutantlarının Üretimi ve Basit Fare Enfeksiyon Modelinde Virulans Zayıflamasının Testi. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, canlı bir fare modelinde bakteriyel enfeksiyonu izlemek için biyolüminesans tabanlı görüntüleme yaklaşımının kullanıldığını göstermektedir. Ardışık biyolüminesans ve X-ışını görüntüleme, konak genelinde yayılan enfeksiyonun gerçek zamanlı görselleştirmesi ve anatomik lokalizasyonu mümkün...

Biyolüminesans kullanarak fare modelinde bakteriyel enfeksiyonun gerçek zamanlı görüntülemesi

Kaynak: Luyts, N. ve diğerleri. Biyolüminesans görüntüleme ile farelerde idrar yolu enfeksiyonlarının uzunlamasına takibi ve tedavisi. J. Vis. Exp. (2021).Bu video, bakteriyel yapışma, invaziya ve hücre içi çoğaltmanın gerçekleştiği mesane içine enjekte edilen biyolüminesan E. coli kullanılarak fare modelinde idrar yolu enfeksiyonunun indüksiyonu ve izini göstermektedir. Biyolüminesans operondan yayılan ışık, enfeksiyon ilerlemesi sırasında bakteri yükünün gerçek zamanlı göstergesi olarak...

Biyolüminesans kullanarak fare modelinde idrar yolu enfeksiyonunun görselleştirilmesi

Bu videoda, rekombinant lusiferaz ve floresan protein eksprese eden bi-raportör Influenza A virüsü kullanılarak fare modellerinde viral enfeksiyonları izlemek için bir yöntem gösterilmektedir. Bu yöntem, hem in vivo hem de ex vivo çalışmalara olanak tanıyarak araştırmacıların viral dinamikler ve müdahalelerin etkileri hakkında bilgi edinmelerini sağlar.

Viral Enfeksiyonları İzlemek için Bir Luciferase-Floresan Muhabir İnfluenza Virüsü

Çok yöntemi görüntüleme küçük hayvan modellerinde bakteri kolonizasyonu eğitim için değerli bir yaklaşımdır. Bu protokol bioluminescent ile farelerin enfeksiyonu...

4D modelli Görüntüleme<em&gt; Citrobacter rodentium</emFarelerde&gt; Enfeksiyonlar

Streptococcus pneumoniae ciddi toplum kökenli pnömoni ve dünya çapında 2 milyondan fazla kişinin ölümünden sorumludur neden lider patojen olduğunu. Spor ya da virülans karıştığı bakteriyel faktörlerin etkisi biyolüminesens bakterileri kullanarak akut fare pnömoni veya bakteriyemi modelinde gerçek zamanlı olarak izlenebilir.

Biyoluminesen Bakteriler Kullanılarak Gerçek Zamanda Bir Akut Fare Pnömoni Modelinde Pnömokok virulans faktörlerinin etkisi aşağıdaki

Biz gazeteci enzim floresan (REF) kullanarak Mycobacterium tüberküloz ile (M. tuberculosis) enfekte farelerin optik görüntüleme açıklar. Bu iletişim kuralı M. tuberculosis hassas ve belirli algılama Patogenez, tedavi ve aşı araştırma için önceden klinik hayvan modellerinde kolaylaştırır.

Mycobacterium tüberküloz ile muhabir enzim Floresans farelerde görüntüleme

Influenza A virüsleri (IAVs) yıllık salgınlara ve ara sıra salgınlara neden olan bulaşıcı solunum patojenleridir. Burada, yeni bir rekombinant luciferase ve floresan ifade iki muhabir IAV (BIRFLU) kullanarak vivo viral enfeksiyonları izlemek için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım in vivo IAV çalışma için mükemmel bir araç ile araştırmacılar sağlar.

Canlı Görüntüleme ve Viral Enfeksiyon Quantification için Bir Luciferase-floresan Reporter Grip Virüsü

Bu makalede, farelerde idrar yolu enfeksiyonuna neden olacak lüks bir operon ile üropatojenik bakterilerin intravesik yönetimi ve daha sonra biyolüminesans görüntüleme kullanılarak bakteri yükünün uzunlamasına in vivo analizi açıklanmaktadır.

Biyolüminesans Görüntüleme Kullanan Farelerde İdrar Yolu Enfeksiyonlarının Boyuna Takibi ve Tedavileri

Öğrenin farelerde biyolüminesans görüntüleme ile bakteriyel enfeksiyonları canlı olarak izleme yöntemini. Bu teknik, patojenlerin akciğerlerdeki lokalizasyonunu ve enfeksiyon dinamiklerini gerçek zamanlı analiz etmenizi sağlar.

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Daha fazla video keşfet